本发明涉及病毒基因突变检测技术领域,具体涉及检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法。
背景技术:
HCMV属于疱疹病毒科 ,β疱疹病毒亚科, 巨细胞病毒属, 人疱疹病毒 5 型。HCMV 基因组为线性双股 DNA 分子 , 长约 230 kb ,由长单一序列( UL)和短单一序列(US) 构成。HCMV 在自然界广泛存在,正常人群中自然感染普遍。
人巨细胞病毒(HCMV)是一种免疫缺陷或免疫不成熟人群的条件致病菌,大多数感染者无明显症状,但在先天感染的儿童中,或免疫功能受抑制的个体,如器官移植者,获得性免疫缺陷病综合征(艾滋病)患者中,容易激活感染,引发严重病变,危及生命。此外,巨细胞病毒宫内感染还是导致出生缺陷的主要原因之一。因此,巨细胞病毒的药物干预和治疗显得尤为重要。
治疗HCMV感染的抗病毒药物为更昔洛韦(GCV),西多福韦(CDV)和膦甲酸(PFA)。巨细胞病毒耐药突变主要是由于UL97和UL54基因发生突变导致。UL97 基因全长 2124 个碱基 ,编码一种蛋白激酶相关的磷酸转移酶,含有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶功能域。HCMV感染细胞内的磷酸化过程是UL97基因编码的产物所完成。GCV是第一个被开发及应用最普遍的治疗 HCMV 感染的高效药物, 必须在此酶作用下发生单磷酸化进一步三磷酸化发挥抗病毒作用, 因此,UL97基因的突变导致GCV不能发生磷酸化而获得活性,导致GCV耐药性的出现。GCV是目前预防和治疗 HCMV病的一线药物,长期治疗后,GCV首先可发生UL97突变,因此 UL97通常是临床检测耐药基因突变的首选基因。GCV耐药突变主要集中在460、520、590至607位点(图1),如M460V/I, H520Q, C592G, A594V, L595S和C603W出现在80%以上以GCV为首选药物的病人体内。UL54 基因全长3729个碱基, 编码由1242个氨基酸组成的 DNA 聚合酶。与UL97基因突变只能导致更昔洛韦(GCV)耐药不同,因为三种药物都是针对编码病毒DNA聚合酶的UL54基因的,因此该基因的突变可以导致这三种药物耐药。与UL97基因耐药位点较为集中不同,UL54基因突变位点更多,其耐药检测只能通过测序,至少需覆盖氨基酸300-1000位点(图1)。抗HCMV药物耐药是免疫功能缺陷患者的一个严重的问题, UL54和UL97基因突变引起的多药物耐药对于异源干细胞移植病人可危及生命。
目前,传统基因突变诊断方法包括限制性片段长度多态性分析(RFLP),基因芯片法,荧光定量PCR等,这些方法存在耗时费力或所需设备和耗材昂贵等缺点,导致不能在临床大规模推广,应用受到限制。同时,巨细胞病毒(HCMV)UL54和UL97基因耐药突变位点众多,上述方法根本无法全部涵盖这些位点。因此有必要建立一种高效率、使用方便的巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的方法,以实现临床快速检测和大规模人群筛查。用本专利申请的巢式PCR的方法进行检测可以完全覆盖所有的突变位点,且不需要贵重的专用仪器,对技术人员要求不高,只需要PCR实验室常规的设备即可,适用于在国内医院推广使用。
技术实现要素:
为了克服现有技术中存在的缺点和不足,本发明的目的在于提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物,该巢式PCR引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因。
本发明的另一目的在于提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法,该巢式PCR方法具有高度的特异性、灵敏度与准确性,所得到的PCR产物可直接送去测序,根据序列即可分析巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变情况。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物,该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物(图2):
当检测巨细胞病毒UL54时,
第一轮PCR扩增引物为:
第一对引物:正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1;
第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物:
第二对引物:正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2;
第三对引物:正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3;
当检测巨细胞病毒UL97时,
所述第一轮PCR扩增引物为:
第四对引物:正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1;
所述第二轮PCR扩增引物为:
第五对引物:正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2;
其中,UL54-SF1基因序列如SEQ ID No.1 所示,UL54-SR1基因序列如SEQ ID No.2所示,UL54-SF2基因序列如SEQ ID No.3 所示,UL54-SR2如SEQ ID No.4 所示,UL54-SF3基因序列如SEQ ID No.5所示,UL54-SR3如SEQ ID No.6 所示,UL97-SF1如 SEQ ID No.7 所示,UL97-SF1如 SEQ ID No.8 所示,UL97-SF2如SEQ ID No.9 所示,UL97-SR2如SEQ ID No.10 所示。
本发明提供的用于检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的引物,第一到第三对引物用来扩增UL54基因,第四到第五对引物用来扩增UL97基因。第一对引物中的正向引物(即上游引物)UL54-SF1选择巨细胞病毒UL54基因nt731-747保守区域;反向引物(即下游引物)UL54-SR1主要部分选择nt3223- 3239保守区域。第一对引物将扩增出2509bp大小的片段。第二对引物中的正向引物UL54-SF2选择巨细胞病毒UL54基因nt779-796位保守区域;反向引物UL54-SR2选择nt1924-1940位保守区域。第二对引物将扩增出1162bp大小的片段。第三对引物中的正向引物UL54-SF3选择巨细胞病毒UL54基因nt1795- 1818位保守区域;反向引物UL54-SR3选择nt3033-3048位保守区域。第三对引物将扩增出1254bp大小的片段。第四对引物中的正向引物UL97-SF1选择巨细胞病毒UL97基因nt821-842位保守区域,第四对引物中的反向引物UL97-SR1选择巨细胞病毒UL97基因nt1953-1972位保守区域,第四对引物将扩增出1152bp大小的片段。第五对引物中的正向引物UL97-SF2选择巨细胞病毒UL97基因nt868-886位保守区域,第五对引物中的反向引物UL97-SR2选择巨细胞病毒UL97基因nt1914-1933位保守区域,第五对引物将扩增出1066bp大小的片段。
本发明的另一目的通过下述技术方案实现:一种采用上述所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法,其包括如下步骤:
(1)以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR,得到第一轮PCR产物,进行50-150倍稀释,得到第一轮PCR稀释产物;
(2)以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR,得到第二轮PCR产物;
(3)对第二轮PCR产物进行检测。
优选地,所述步骤(1)中,待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得。
优选地,所述步骤(1)中,第一轮PCR反应体系的体积为10-25μL。
优选地,所述步骤(1)中,第一轮 PCR 的反应体系为:KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1-2μL,双蒸水补齐至25μL。
优选地,所述步骤(1)中,第一轮PCR的反应程序为:1)、94℃预变性2min;2)、98℃变性10s,56℃退火30s,68℃延伸2min30s,共34个循环;3)、68℃后延伸5min。
优选地,所述步骤(2)中,第二轮PCR反应体系的体积为25-50μL。
优选地,所述步骤(2)中,第二轮 PCR的反应体系为:KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR稀释产物 1-2μL,双蒸水补齐至50μL。
优选地,所述步骤(2)中,第二轮PCR的反应程序为:1)、94℃预变性2min;2)、98℃变性10s,56℃退火30s,68℃延伸1min10s,共34个循环;3)、68℃后延伸5min。
本发明还提供一种检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的试剂盒,该试剂盒包含权利要求1所述第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物。
本发明的有益效果在于:
本发明的巢式PCR引物可以高特异、高灵敏度和高效的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变。
本发明的巢式PCR方法具有高度的特异性、灵敏度与准确性,所得到的PCR产物可直接送去测序,根据序列即可分析巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的情况。
本发明限定了第一轮PCR的反应体系和反应程序,同时还限定了第二轮PCR的反应体系和反应程序,最终得到的条带清晰,结果稳定。
本发明通过选用特定的巢式PCR引物,采用巢式PCR方法,优化PCR反应体系和反应程序,扩增巨细胞病毒UL54和UL97基因具有高敏感性,与其它方法比较无非特异性扩增出现,显示高度扩增特异性,可以用于分析其耐药基因突变,实用性强,符合临床推广的要求。
本发明在长期进行病毒研究的基础上,对NCBI上巨细胞病毒序列进行比对分析,对相关引物、反应体系进行优化后,探索出一套特异、准确、操作简便的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明,但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制,对于本领域的普通技术人员,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变位点(Nell S. Lurain et al, Clinical Microbiology Reviews, Oct. 2010),其中A为聚合酶 UL54 基因突变位点示意图,B为UL97 基因的突变位点示意图。图2为巨细胞病毒UL54和UL97基因片段扩增示意图,其中A为UL54 基因的扩增片段示意图,B为UL97 基因的扩增片段示意图。
图3为本发明的电泳图,其中,泳道M为DNA marker,泳道1为UL97基因扩增产物,泳道2和3为UL54基因扩增产物。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明,见附图1-3。实施例中未注明具体条件的,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的,均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
本实施例中,一种检测巨细胞病毒UL54基因耐药突变的巢式PCR引物,该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物:
当检测巨细胞病毒UL54时,
第一轮PCR扩增引物为:
第一对引物:正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1;
第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物:
第二对引物:正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2;
第三对引物:正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3;
本实施例, 第一对引物用于扩增UL54基因的第一轮,包括正向引物UL54-SF1 (SEQ ID No.1)和反向引物UL54-SR1(SEQ ID No.2);第二对引物用于扩增UL54基因的第二轮,包括正向引物UL54-SF2(SEQ ID No.3)和反向引物UL54-SR2(SEQ ID No.4);第三对引物用于扩增UL54基因的第二轮包括正向引物UL54-SF3(SEQ ID No.5)和反向引物UL54-SR3(SEQ ID No.6);第一至第三对引物序列分别为:
正向引物UL54-SF1:5'-TGGTCATCGATCGGCGG-3';
反向引物UL54-SR1:5'-ATGACGGCAATGTGCGG-3' ;
正向引物UL54-SF2:5'-GTTACGACTGGCGGCAGC-3';
反向引物UL54-SR2:5'-GCAGATTGCAAGGGCGG-3';
正向引物UL54-SF3:5'-AACCACTACAGCAAAGGTACGACG-3';
反向引物UL54-SR3:5'-CGACAGGCGCACGGCT-3';
每个模板DNA均采用以下PCR反应体系和PCR反应程序进行:
一种用于非治疗目的采用上述所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL54耐药突变的方法,包括如下步骤:
(1)以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR,得到第一轮PCR产物,进行100倍稀释,得到第一轮PCR稀释产物;所述第一轮PCR扩增引物为第一对引物;
(2)以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR,得到第二轮PCR产物;其中,当检测巨细胞病毒UL54基因耐药突变时,所述第二轮PCR扩增引物为第二对引物和第三对引物;
(3)对第二轮PCR产物进行检测。
如图2(A)所示,采用正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1进行第一轮PCR扩增,采用正向引物UL54-SF2和反向引物UL54-SR2进行第二轮PCR扩增,得UL54-1片段;采用正向引物UL54-SF1和反向引物UL54-SR1进行第一轮PCR扩增,采用正向引物UL54-SF3和反向引物UL54-SR3进行第二轮PCR扩增,得UL54-2片段。
所述步骤(1)中,待检测DNA均为从待检血清或血浆中提取DNA而得。
本实施例中,所述步骤(1)中,第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地,第一轮PCR的反应体系为:KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 2μL,双蒸水补齐至25μL。
所述步骤(1)中,第一轮PCR的反应程序为:1)、94℃预变性2min;2)、98℃变性10s,56℃退火30s,68℃延伸2min30s,共34个循环;3)、68℃后延伸5min。
本实施例中,所述步骤(2)中,第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地,第二轮PCR的反应体系为:KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物2μL,双蒸水补齐至50μL。
所述步骤(2)中,第二轮PCR的反应程序为:1)、94℃预变性2min;2)、98℃变性10s,56℃退火30s,68℃延伸1min10s,共34个循环;3)、68℃后延伸5min。
所述步骤(3)中,检测采用电泳检测,将第二轮PCR产物通过琼脂糖电泳配合凝胶成像系统观察结果。其中,检测的第二轮PCR产物加样量为3μL,其过程按照仪器标准操作程序进行。选择DL2,000marker(TAKARA公司)作为对照,电泳结束后分析电泳图像,第二轮PCR产物送去Invitrogen公司测序。
本实施例还提供一种检测巨细胞病毒UL54耐药突变的试剂盒,该试剂盒包括第一对引物,并且包括第二对引物或者第三对引物中的任一对引物。
实施例2
本实施例中,一种检测巨细胞病毒UL97基因耐药突变的巢式PCR引物,该巢式PCR引物包括第一轮PCR扩增引物和第二轮PCR扩增引物:
检测巨细胞病毒UL97时,
第一轮PCR扩增引物为:
第四对引物:正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1;
第二轮PCR扩增引物为:
第五对引物:正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2;
本实施例,第四对引物用于扩增UL97基因的第一轮,包括正向引物UL97-SF1(SEQ ID No.7)和反向引物UL97-SR1(SEQ ID No.8);第五对引物用于扩增UL97基因的第二轮,包括正向引物UL97-SF2(SEQ ID No.9)和反向引物UL97-SR2(SEQ ID No.10);第四至第五对引物序列分别为:
正向引物UL97-SF1:5'-GTTCCAACGACCAGATCATCAC-3';
反向引物UL97-SR1:5'-GCGAGCATTCGTGGTAGAAG-3';
正向引物UL97-SF2:5'-GACCCGCGTATGTTCTTGC-3';
反向引物UL97-SR2:5'-GACACGAGGACATCTTGGCC-3';
每个模板DNA均采用以下PCR反应体系和PCR反应程序进行:
一种用于非治疗目的采用上述所述的巢式PCR引物检测巨细胞病毒UL97耐药突变的方法,包括如下步骤:
(1)以第一轮PCR扩增引物对待检测DNA进行第一轮PCR,得到第一轮PCR产物,进行100倍稀释,得到第一轮PCR稀释产物;所述第一轮PCR扩增引物为第四对引物;
(2)以第二轮PCR扩增引物对第一轮PCR稀释产物进行第二轮PCR,得到第二轮PCR产物;其中,当检测巨细胞病毒UL54基因耐药突变时,所述第二轮PCR扩增引物为第五对引物;
(3)对第二轮PCR产物进行检测。
如图2(B)所示,采用正向引物UL97-SF1和反向引物UL97-SR1进行第一轮PCR扩增,采用正向引物UL97-SF2和反向引物UL97-SR2进行第二轮PCR扩增,得UL97片段。
所述步骤(1)中,待检测DNA均为从待检血清或血浆中提取DNA而得。
本实施例中,所述步骤(1)中,第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地,第一轮PCR的反应体系为:KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 2μL,双蒸水补齐至25μL。
所述步骤(1)中,第一轮PCR的反应程序为:1)、94℃预变性2min;2)、98℃变性10s,56℃退火30s,68℃延伸2min30s,共34个循环;3)、68℃后延伸5min。
本实施例中,所述步骤(2)中,第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地,第二轮PCR的反应体系为:KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物2μL,双蒸水补齐至50μL。
所述步骤(2)中,第二轮PCR的反应程序为:1)、94℃预变性2min;2)、98℃变性10s,56℃退火30s,68℃延伸1min10s,共34个循环;3)、68℃后延伸5min。
所述步骤(3)中,检测采用电泳检测,将第二轮PCR产物通过琼脂糖电泳配合凝胶成像系统观察结果。其中,检测的第二轮PCR产物加样量为3μL,其过程按照仪器标准操作程序进行。选择DL2,000marker(TAKARA公司)作为对照,电泳结束后分析电泳图像,第二轮PCR产物送去Invitrogen公司测序。
本实施例还提供一种检测巨细胞病毒UL97耐药突变的试剂盒,该试剂盒包括第四对引物和第五对引物。
实施例1-2的电泳图像如图3所示,泳道M为DNA marker,泳道1为UL97基因扩增产物,泳道2和3为UL54基因扩增产物。本实施例限定了第一轮PCR的反应体系和反应程序,同时还限定了第二轮PCR的反应体系和反应程序,最终得到的条带清晰,结果稳定。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于:
本实施例中,所述步骤(1)中,第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地,第一轮PCR的反应体系为:KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL,双蒸水补齐至25μL。其中,所述第一轮PCR产物,进行50倍稀释,得到第一轮PCR稀释产物。
本实施例中,所述步骤(2)中,第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地,第二轮PCR的反应体系为:KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物1μL,双蒸水补齐至50μL。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于:
本实施例中,所述步骤(1)中,第一轮PCR反应体系的体积为10μL。具体地,第一轮PCR的反应体系为:KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL,双蒸水补齐至10μL。其中,所述第一轮PCR产物,进行150倍稀释,得到第一轮PCR稀释产物。
本实施例中,所述步骤(2)中,第二轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地,第二轮PCR的反应体系为:KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物 1μL,双蒸水补齐至25μL。
实施例5
本实施例与实施例2的不同之处在于:
本实施例中,所述步骤(1)中,第一轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地,第一轮PCR的反应体系为:KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL,双蒸水补齐至25μL。其中,所述第一轮PCR产物,进行50倍稀释,得到第一轮PCR稀释产物。
本实施例中,所述步骤(2)中,第二轮PCR的反应体系的体积为50μL。具体地,第二轮PCR的反应体系为:KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物1μL,双蒸水补齐至50μL。
实施例6
本实施例与实施例2的不同之处在于:
本实施例中,所述步骤(1)中,第一轮PCR反应体系的体积为10μL。具体地,第一轮PCR的反应体系为:KOD FX 0.5U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 12.5μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和待检测DNA 1μL,双蒸水补齐至10μL。其中,所述第一轮PCR产物,进行150倍稀释,得到第一轮PCR稀释产物。
本实施例中,所述步骤(2)中,第二轮PCR反应体系的体积为25μL。具体地,第二轮PCR的反应体系为:KOD FX 1U和dNTPs各0.4mM、2×PCR buffer for KOD FX 25μL、10pmol/μL的正向引物和反向引物各0.75μL和第一轮 PCR 稀释产物 1μL,双蒸水补齐至25μL。
本发明通过选用特定的巢式PCR引物,采用巢式PCR方法,优化PCR反应体系和反应程序,扩增巨细胞病毒UL54和UL97基因具有高敏感性,与其它方法比较无非特异性扩增出现,显示高度扩增特异性。
本发明限定了第一轮PCR的反应体系和反应程序,同时还限定了第二轮PCR的反应体系和反应程序,最终得到的条带清晰,结果稳定。
本发明在长期进行病毒研究的基础上,对NCBI上巨细胞病毒序列进行比对分析,对相关引物、反应体系进行优化后,探索出一套特异、准确、操作简便的检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR方法,可以用于分析其耐药基因突变,实用性强,符合临床推广的要求。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
<110>东莞市第八人民医院东莞市儿童医院 东莞市儿科研究所
<120>检测巨细胞病毒UL54和UL97基因耐药突变的巢式PCR引物及方法
<160>10
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tggtcatcga tcggcgg 17
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atgacggcaa tgtgcgg 17
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gttacgactg gcggcagc 18
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gcagattgca agggcgg 17
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aaccactaca gcaaaggtac gacg 24
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cgacaggcgc acggct 16
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gttccaacga ccagatcatc ac 22
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gcgagcattc gtggtagaag 20
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gacccgcgta tgttcttgc 19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gacacgagga catcttggcc 20