一种获得适合高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法与流程

本发明涉及一种获得高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法，属于植物基因工程和生物技术领域。

背景技术：

油菜(Brassica napus) 属于十字花科，是我国第五大农作物仅次于水稻、小麦、玉米和大豆。我国是植物油消费大国，国内菜籽油产量仅能满足人们消费需求的2/3，大量油料消耗依赖进口。另外油菜作为生物柴油原料作物，被越来越多的国家所重视，有望成为解决化石能源危机的重要替代物,因此提高油菜的产量对我国具有重要的战略性意义。

近年来我国社会发展迅速，乡村劳动力减少，劳动力价格上涨，种植油菜的成本提高，种植面积日益减少。另一方面，我国油菜生产方式传统，机械化水平远不如小麦、水稻和玉米等作物，需要大量劳动力，从而导致我国油菜生产效率低，国际竞争力较弱。因此，进一步增强油菜生产的机械化水平，降低生产成本，提高农民种植积极性，是我国需要解决的首要问题。从育种角度出发，培育优良的适合高密种植及机械化收获的油菜品种，根本解决油菜收获机械化问题，成为育种家首要目标之一。

油菜分枝在植株生长过程中不仅在植株地上形态形成中起着重要作用，而且可通过影响单株结实量进一步影响到油菜总产量，因此在油菜生产中具有举足轻重的地位。我国油菜品种主要特征有分枝较多、茎杆粗壮、株型较大、角果分散且易裂，导致机械收割困难大效率低，另外单株角果成熟时期不同，各部位角果之间成熟期差异较大，未成熟角果脱粒难而导致油菜收获损失率高达10%~15%，迫切需要选育优良的油菜品种来提高油菜收获得机械化水平。

发现并培育株型紧凑、分枝高度增高、花期集中、结荚层集中等新型油菜品种以适应密植及机械化收获是国内外油菜品种改良的发展趋势。

傅廷栋等（申请号CN200810048092.5）发明公开了一种适应高密度种植和机械化收获得新型矮秆紧凑型油菜选育及鉴定方法，该方法通过不同油菜品种杂交得到的F1代植株，将F1代植株花蕾用秋水仙碱加倍染色体，小孢子培养获得双单倍体分离群体。然后对分离群体进行多年田间观察、表型筛选得到该适合机械化收获的矮秆紧凑型油菜品种。该方法属于植物育种领域，获得油菜品种时间漫长、工作量大、表型差异不明显。

目前，本发明获得一种初级分枝高度增高、分枝集中于顶部、结荚层集中的突变体植株，暂定名为sfz（少分枝）。

技术实现要素：

本发明为克服现有技术中存在的技术缺陷，目的在于提供一种适合于油菜高密度种植和机械化收获材料的获得方法。利用该方法获得的适应高密度种植、机械化收获的油菜品种可有效解决当前油菜生产中面临的收获损失率高、种植成本高的问题。

本发明还公开了含有4个重复串联CaMV 35S 增强子序列的激活标签载体PCB260（关艳龙等，激活标签法构建拟南芥突变体库及其表型分析，云南植物研究，2010）在转化获得油菜突变体株中的应用。

本发明所述的一种适于高密度种植和机械化收获的油菜材料的获得方法，具体操作如下：

（1）采用农杆菌浸花法将激活标签载体转化到油菜中：

将激活标签载体转化到农杆菌感受态细胞中，将鉴定转化成功的菌制备菌悬液；将目标物油菜植株上已开花的花蕾和角果减掉，然后进行浸花过程。

其中所述的激活标签载体为pCB260；

所述的农杆菌感受态细胞为GV3101；

所述浸花过程如下：

（1）第一次浸花：除去开放的花蕾，把整个未开放花蕾浸润于含有重组质粒pCB260的农杆菌菌液里5分钟，浸花中轻柔地晃动菌液，利于提高转化率；浸润完毕的花蕾套入羊皮袋内。

（2）第二次浸花：距离第一次浸花后1-2天，重复步骤（1），此步无需去除开放的花蕾。

（3）第三次浸花：距离第二次浸花后1-2天，重复步骤（2）。

（4）浸花后管理：浸花结束后，待植株授粉完毕，去掉羊皮纸袋，不定时剪掉新生出的侧枝花序以及经过浸花的花序其顶端新萌发的花蕾，直接用水浇灌培养植株，直至收获。

注：每次浸花前都要按上述方法重新摇含有pCB260质粒的农杆菌菌液，保证菌液OD值为2，新鲜菌液生长活力强有利于提高转化效率。

（2）利用绿色荧光蛋白GFP筛选油菜转化株：

（3）采用草丁膦除草剂筛剂筛选油菜转化株；

（4）PCR方法鉴定转化植株：

将筛选得到的含有激活标签载体pCB260的油菜突变体植株叶片作为实验材料，CTAB法小量提取基因组DNA，PCR扩增激活标签载体PCB260上的bar片段。

PCR引物：

Bar-R：5’- CACCATCGTCAACCACTACATC-3’

Bar-F：5’- ACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG-3’

PCR程序： 95℃，5min，预变性；95℃，1min；56℃，50s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，延伸。

（5）转化植株的表型分析：

在大量转化株中，发现了少分枝油菜突变体，记为sfz，且该植株在F2代生长中符合孟德尔遗传定律，对其进行表型分析，与野生型宁油12植株相比，幼苗期突变体sfz叶片表面发亮，成熟期突变体sfz的分枝较少，有效分枝高度增高，并且角果集中在植株顶端。

针对成熟期少分枝油菜突变体及宁油12野生型植株20株植株一级分枝数进行统计，少分枝突变体一级分枝数略少于野生型植株，分枝较集中且无效分枝减少。

针对收获期少分枝油菜突变体sfz20株植株的有效分枝高度进行统计，发现少分枝突变体的有效分枝高度平均高于野生型宁油12约20cm而植株高度与宁油12无明显差异，少分枝突变体分枝均集中于植株顶部。

本发明的优点：

1. 本发明中所采用的农杆菌介导的体外浸蘸渗透法转化油菜，速度快、成本低、操作简单。

2. 本发明中所采用的激活标签载体pCB260含有4个重复串联CaMV 35S 增强子序列，插入到油菜基因组中，插入位点附近的基因会被激活而得到过量表达，被激活的基因与T-DNA紧密联系易于分离出该基因。

3. 应用激活标签载体pCB260获得的过表达植株为显性突变体，突变体表型在T1即可直接观察到，因而极大的弥补了传统方法构建的隐形突变体的不足。

4. 本发明利用basta和绿色荧光蛋白GFP高效初步筛选转化株，进一步提取植株嫩叶基因组DNA进行PCR鉴定，最终确定转化株，省时高效，成本低，容易操作。

5. 本发明利用激活标签载体pCB260转化油菜后所获得的有效分枝高度增高，分枝集中于顶部的少分枝油菜突变体sfz，为机械化大规模生产研究提供了新材料，具有重要应用前景。

6. 少分枝油菜突变体sfz为功能获得型突变体，为研究植物分枝发育调控机制提供了极佳的研究材料。

附图说明

图1：含有4个重复串联CaMV 35S 增强子序列的激活标签载体PCB260。

图2：利用绿色荧光蛋白GFP初筛油菜突变体种子；其中，A：带有胚轴的种子绿色荧光筛选合成图， B：带有胚轴的种子绿色荧光筛选图

图3：草丁膦除草剂筛剂初筛油菜突变体植株过程图；其中A：未喷洒草丁膦除草剂筛剂的油菜突变体植株，B：第一次喷洒草丁膦除草剂筛剂的油菜突变体植株，C：第二次喷洒草丁膦除草剂筛剂的油菜突变体植株。

图4：油菜突变体植株PCR鉴定；其中，M: DL2000 DNA Marker；1-12: 突变体植株；—: 阴性对照基因组DNA；+ : 阳性对照。

图5：少分枝油菜突变体sfz幼苗期叶片表面发亮表型。

图6：少分枝油菜突变体sfz开花期植株和野生型植株宁油12对比图。

图7：少分枝油菜突变体sfz成熟植株一级分枝数统计图。

图8：少分枝油菜突变体sfz成熟植株与野生型宁油12植株有效分枝高度统计图。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。

本发明所涉及的激活标签载体pCB260为文章（关艳龙等，激活标签法构建拟南芥突变体库及其表型分析，云南植物研究，2010）公开，其构建过程、鉴定、性质已公开，为公知材料，本发明所用为作者馈赠。

实施例一：激活标签载体pCB260转化到野生型油菜宁油12

1. 激活标签载体pCB260转化到农杆菌感受态细胞GV3101（购于上海迈其生物科技有限公司）

（1）取激活标签载体pCB260约5μL，加入到50μL农杆菌感受态细胞GV3101

菌液中，慢慢混匀。

（2）放于冰盒中冰浴半小时，快速取出转入液氮中冷冻1分钟（或者放置于

-70℃冰箱中，3-5分钟），迅速放置37℃水浴锅5分钟。

（3）加入800μL LB液体培养基（不含抗生素），250 rpm，置于28℃恒温摇

床培养4-5个小时。3500 rpm，离心30秒，吸出上层液体舍弃。

（4）加入100μL LB液体培养基（不含抗生素）轻轻吸打悬浮菌块，直至菌块

消失，吸取约80μL菌液，用涂布棒涂于含0.1g/L卡那霉素、0.1g/L庆大霉素和0.1g/L

利福平（购于北京拜尔迪生物技术有限公司）的LB平板上，28℃恒温培养24-48

小时。

实验材料的预处理

在进行农杆菌浸花前，应到江苏大学油菜试验田中观看野生型植株宁油12（ny12，购于江苏省农科院）油菜的开花情况；将油菜植株上已开花的花蕾和角果减掉，然后进行浸花。

含有PCB260质粒的农杆菌菌液预处理

菌液PCR鉴定出含有PCB260质粒的菌斑，挑斑，放于含0.1g/L卡那霉素、0.1g/L庆大霉素和0.1g/L利福平抗生素的液体培养基的试管中培养，然后按1%接种量接种于250 mL LB液体培养基中，测定农杆菌菌液OD₆₀₀大概为2.0时进行下一步实验。

按以下用量加入到250mL菌液中，配方如下：（Silwet、6-BA 6-苄氨基嘌呤、AS乙酰丁香酮均购于北京拜尔迪生物技术有限公司）。

甘蓝型油菜浸花过程

（1）第一次浸花：除去开放的花蕾，把整个未开放花蕾浸润于含有重组质粒pCB260的农杆菌菌液里5分钟，浸花中轻柔地晃动菌液，利于提高转化率。浸润完毕的花蕾套入羊皮袋内。

（2）第二次浸花：距离第一次浸花后1-2天，重复步骤（1），此步无需去除开放的花蕾。

（3）第三次浸花：距离第二次浸花后1-2天，重复步骤（2）。

（4）浸花后管理：浸花结束后，待植株授粉完毕，去掉羊皮纸袋，不定时剪掉新生出的侧枝花序以及经过浸花的花序其顶端新萌发的花蕾，直接用水浇灌培养植株，直至收获。

注：每次浸花前都要按上述方法重新摇含有pCB260质粒的农杆菌菌液，保证菌液OD值为2，新鲜菌液生长活力强有利于提高转化效率。

实施例二、油菜转化植株筛选

1. 利用绿色荧光蛋白GFP筛选浸花收获的种子（方法1）

（1）处理油菜种子：选取实施例一得到的转化植株的种子约1000粒，置于铺好滤纸的大号培养皿中，种子均匀排布，加入少量水直至种子被浸润，暗处理2-3天。

（2）观察荧光：种子发出嫩芽后，即可置于光图像分析系统（购于上海天能科技有限公司）观察，观察时调节曝光时间为50s。如图2所示，与野生型宁油12相比，含pCB260载体的突变体植株明显发出绿色荧光即图中白色点状。

（3）移栽：将发出荧光的种子，轻轻挑选出，置于小方盆里培养，长出3-4片真叶后，转移到试验田中，注意动作轻慢防止叶片折断。

2. 草丁膦除草剂筛剂突变体植株（方法2）

配制草丁膦除草剂母液A（作为溶剂）1000 mL，如下：（Tween-20、Basta 购于北京拜尔迪生物技术有限公司）

旋涡震荡混匀，即用即配。

配制母液B（作为溶质）150 mL，如下：

充分混匀，即用即配。

首先育苗至油菜长出3-4片真叶，在进行Basta筛选。经充分实验检测，Basta工作液的浓度在0.01%最为适合。即每次使用取180mL母液A和20mL母液B充分混匀后使用。每次喷洒至叶片完全湿润，每隔三天喷洒一次，共约5次（具体次数观察油菜生长情况），直至只有少部分油菜存活。

上述方法1和2可单独应用于筛选含有pCB260载体的植株，也可将两者结合应用，以提高准确率。

鉴定甘蓝型油菜突变体植株

用以上两种方法筛选得到的含有激活标签载体pCB260的油菜突变体植株叶片作为实验材料，CTAB法小量提取基因组DNA，PCR扩增激活标签载体pCB260上的bar基因片段。

PCR引物：

Bar-R：5’- CACCATCGTCAACCACTACATC-3’

Bar-F：5’- ACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAG-3’

PCR程序： 95℃，5min，预变性；95℃，1min；56℃，50s；72℃，30s；32个循环；72℃，5min，延伸。

检测结果表明（图4），阳性对照（pCB260质粒）和#2，#5，#7，#9，#11，#12，这6个转化植株均能够扩增出电泳条带（252bp），经测序后与NCBI数据库中的bar序列对比为正确序列，而阴性对照（野生型宁油12，购于江苏省农科院）则没有电泳条带，表明转基因油菜基因组中已经含有激活标签载体pCB260序列。

实施例三、少分枝油菜突变体sfz表型分析

通过上述方法，在大量转化株中，发现了少分枝油菜突变体sfz，且该植株在F2代生长中符合孟德尔遗传定律，对其进行表型分析，与野生型宁油12植株相比，幼苗期突变体sfz叶片表面发亮（图5），成熟期突变体sfz的分枝较少，有效分枝高度增高，并且角果集中在植株顶端。

图6为少分枝油菜突变体sfz开花期植株和野生型植株对比图；少分枝油菜突变体花序和角果集中在植株顶端，有效分枝高度明显高于野生型宁油12植株，非常适于密植和机械化收获。

少分枝油菜sfz分枝数统计

针对成熟期少分枝油菜突变体及宁油12野生型植株20株植株一级分枝数进行统计（图7所示），少分枝突变体一级分枝数略少于野生型植株，分枝较集中且无效分枝减少。因为一级分枝数和二级分枝数减少，可以适宜于高密度种植，进而弥补因分枝少造成的角果数减少的缺陷，进一步提高总产量，同时由于高密度种植，油菜的茎杆较细，适宜于收割机割刀的切割。

图7为少分枝油菜突变体sfz成熟植株一级分枝数统计图；一级分枝数和二级分枝数减少，可以适宜于高密度种植，进而弥补因分枝少造成的角果数减少的缺陷，进一步提高总产量，同时由于高密度种植，油菜的茎杆较细，适宜于收割机割刀的切割。

少分枝油菜sfz有效分枝高度统计

针对收获期少分枝油菜突变体sfz20株植株的有效分枝高度进行统计（图8），发现少分枝突变体的有效分枝高度平均高于野生型宁油12约20cm而植株高度与宁油12无明显差异，少分枝突变体分枝均集中于植株顶部。研究表明，高密度种植下有效分枝高度对油菜产量的影响仅次于结角密度为第二大重要影响性状。少分枝sfz的有效分枝高度增高，分枝集中于植株顶端，开花期较为集中的特征为机械化高密度种植油菜的最佳选育品种。

图8为少分枝油菜突变体sfz成熟植株与野生型宁油12植株有效分枝高度统计图。少分枝sfz的有效分枝高度增高，分枝集中于植株顶端，开花期较为集中的特征为机械化高密度种植油菜的最佳选育品种。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种获得适合高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法

<130> 一种获得适合高密度种植和机械化收获的油菜材料的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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