一种用于核酸提取的裂解液的制作方法

本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种用于核酸提取的裂解液。

背景技术：

分离纯化得到高质量的核酸是分子生物学实验非常关键的步骤。已报道了多种从生物样本中分离纯化核酸的方法，例如从血液、血浆、血清、培养细胞、植物、动物及人体组织等样本中分离提纯核酸的方法。

核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时要保证核酸分子一级结构的完整性，同时排除其他分子污染。一般核酸分离与纯化的方法包括裂解、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。

1.裂解：核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用例如超声裂解、化学作用、酶作用等方法实现。细胞外核酸一般是包裹在脂质囊泡中的，也需要裂解过程将其完全释放出来。

2.核酸的分离与纯化：核酸的高负电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，因此可根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心、亲和性吸附等方法将核酸分离、纯化，有些方法需要有害的有机溶剂，但目的都是获得高质量的核酸。磁珠法核酸分离纯化技术采用纳米级磁性微珠，这种磁珠的表面具有与核酸结合的官能基团，在一定条件下能与核酸发生吸附反应。磁珠在磁力作用下可以发生聚集，从而可摆脱离心等所需的手工操作流程。

技术实现要素：

本发明提供一种裂解液，特别是从血液、血浆、体液样本中分离细胞外核酸的方法。在本发明中，磁珠与生物样本中的核酸在特定基质中形成复合物，特定基质含有离液序列高的盐(chaotropicsalt)，它可以破坏分子力(氢键)稳定性，使疏水性的蛋白质更易溶于水。离液序列高的盐能破坏大分子的三维结构，诸如蛋白、dna、rna，并使其变性；离液序列高的盐干扰分子间的由非共价键(力)形成的相互作用，如氢键、范德华力、巯水作用；常见的离液序列高的盐包括：硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、licl和naclo4等。然后在外部磁力作用下将核酸-磁珠复合物与生物样本分离，并通过特定的盐溶液将分离的核酸从核酸-磁珠复合物上洗脱下来。为实现上述目的，本发明提供以下技术方案。

在一种实施方式中，提供一种用于核酸提取的裂解液，所述裂解液包括质量浓度为30-70％离液序列高的盐、质量浓度为0.05-20％的阴离子表面活性剂和质量浓度为0.05-20％非离子表面活性剂。

在一种实施方式中，所述离液序列高的盐为盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钾，氯化锂、高氯酸钠中的一种或多种，所述离液序列高的盐质量浓度为40-65％，优选地是质量浓度为50-60％。

在一种实施方式中，阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠(sds)和月桂酸钠(sls)中的一种或多种，质量浓度为0.1-20％，优选地质量浓度为0.2-10％；所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯型或多元醇型类非离子表面活性剂中的一种或多种，质量浓度为0.1-20％，优选地是质量浓度为0.2-10％。

在一种实施方式中，所述非离子表面活性剂是brij-58、聚多卡醇、tritonx-100、np-40、吐温-20、吐温-80、聚氧乙烯醚中的一种或多种。

在一种实施方式中，裂解液包括质量浓度为52％盐酸胍、质量浓度为10％tritonx-100和质量浓度为20％月桂酸钠；或者质量浓度为36％异硫氰酸胍、质量浓度为10％brij-58和质量浓度为10％月桂酸钠；或者质量浓度为40％异硫氰酸胍、质量浓度为1％brij58和质量浓度为1％月桂酸钠；或者质量浓度为40％异硫氰酸胍、质量浓度为20％tween-20和质量浓度为0.2％月桂酸钠；或质量浓度为40％异硫氰酸胍、质量浓度为1％聚多卡醇和质量浓度为0.1％sds。

本发明还提供一种核酸提取试剂盒，其包括如上所述的裂解液。

进一步地，本发明还提供一种细胞外核酸分离纯化方法，其包括以下步骤：1)通过上述的裂解液将细胞外核酸释放出来；2)用羟基化固相载体吸附细胞外核酸；和3)通过洗脱液将细胞外核酸洗脱下来。

根据本发明分离的核酸优选地是脱氧核糖核酸(dna)。根据本发明所用的磁珠优选地是硅氧化包被的磁珠。在本发明中，首先，将生物样本与本发明的组合物和磁珠形成混合物；将混合物中的核酸吸附到磁珠上，然后通过磁力将磁珠从混合物中分离出来。最后，磁珠上的核酸用洗脱液洗脱下来。另外，本发明的核酸提取试剂盒还包括其他分离纯化核酸所需的组分，包括：磁珠悬浮液，清洗液和洗脱液等等。

本发明提供了一种简便有效的分离纯化生物样本中的核酸的方法，本发明通过组合物和磁珠将核酸简单有效地分离纯化出来，不需要离心、转移等步骤，最大限度地降低核酸的丢失，而且通过优化组合物配方，可以获得高浓度高纯度的核酸，可以从血液等体液中分离纯化核酸，也可以分离纯化病毒核酸，得到的核酸物质可直接应用于聚合酶链反应(pcr)、酶切反应、文库构建等下游实验中，因此，本发明提供了一种简便有效的、应用范围较广的核酸分离纯化方法。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1从人血浆中提取核酸

从癌症病人采血10ml到streck采血管中，颠倒混匀8-10次，使血液与采血管中的保护剂充分混合。按照血浆分离步骤分离血浆，首先在4℃，2000g离心10min，将上清转移到新管中，然后在4℃，16000g离心10min，将上清转移到新管中，得到的血浆标本可在-70℃冰箱长期保存。

实验组的核酸提取按照以下步骤：向1ml血浆中加入10μl蛋白酶k溶液，然后加入1.5倍样本体积的裂解液(50％异硫氰酸胍，15％np-40，2％sds)，混合均匀后，室温静置5min。加入3/4样本体积的异丙醇和30-50μl磁珠悬浮液(thermofisher，37002d)。颠倒混匀数次。将离心管放在垂直混合仪上，室温混匀10min。将离心管置于磁力架，进行磁分离，移液器吸弃上清。然后加入1ml清洗液(30％盐酸胍，50％异丙醇)，重悬磁珠，将其转至1.5ml的离心管中，磁力架上静置2min，进行磁分离，弃上清。重复清洗步骤2次。然后加入30μl洗脱液(10mmtrishclph8.0)，与磁珠完全混匀后，70℃温浴10min。将离心管置于磁力架，进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，得到的核酸-20℃保存，长期保存于-80℃。上述血浆同时用商品化试剂盒(thermofisher，37011d)根据说明书进行提取，作为对照组。

提取的核酸用qubit3.0荧光计(thermofisher)进行定量，测定的dna浓度为：实验组0.43ng/μl，对照组0.31ng/μl。提取来自不同生物样本(例如血、尿液、组织液、其他体液等)的核酸，上述缓冲液(包括裂解液、清洗液等)可适当调整，包括调整浓度、ph、溶剂加入量等。

实施例2裂解液的提取效率

裂解液释放核酸的效率主要取决于离液盐的浓度、表面活性剂的类型和数量。配制不同配方的裂解液缓冲液按照实施例1中的核酸提取方法提取1ml血浆的dna，将dna与磁珠(thermofisher，37002d)结合，然后用洗脱液(10mmtrishclph8.5)将dna洗脱下来，通过qubit测定得到的dna的浓度，结果如下表1。

表1.不同裂解液的提取效率

从表1可以说明，使用两种不同表面活性剂组合作为裂解液成份，比使用一种表面活性剂提取效果更好，二者具有显著性差异(p<0.001)。

实施例3从血液中提取核酸

向200μledta抗凝血液中加入600μl红细胞裂解液(rt122，天根)，颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1min，弃上清，留下白细胞沉淀，加200μlpbs，振荡至彻底混匀。然后向细胞混悬液中加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。然后加入300μl裂解液(40％异硫氰酸胍，10％tritonx-100，5％sds)，混合均匀后，室温静置5min。然后按照实施例1中的核酸提取步骤进行核酸提取。最后用100μl洗脱液将核酸洗脱下来。提取的核酸-20℃保存。长期保存于-80℃。nanodropnd-1000(nanodrop)测定的核酸浓度为52.5ng/μl，纯度为od260/280＝1.82。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。