本发明涉及一种化合物，尤其涉及一种广谱抗耐药菌先导化合物毛壳菌素及制备和应用。
背景技术：
随着抗生素的滥用，细菌耐药发展十分迅猛，尤其是“超级细菌”引发的细菌耐药已经引起了全球抗感染领域的关注。世界卫生组织、英国、美国都制定了发现新抗生素的行动计划，并提出具有新的作用模式的抗生素，使人类能够避免未来无药可治的可能。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）是引起人类感染的重要病原菌之一，也是临床常见的多重耐药细菌之一，对多种抗生素产生抗药性，比如对青霉素，甲氧西林，四环素和红霉素，氨基糖苷类药物、喹诺酮等的抗性。mrsa在世界各地的感染率不断上升，已成为当前医院感染的重要病原菌之一，致死率已经超过人类免疫缺陷病毒（hiv）和结核分枝杆菌致死的总和。因此，寻找新型的抗mrsa先导化合物，开发新型的抗耐药菌药物已成为当今药物研发的热点。
技术实现要素：
本发明涉及chaetomiumcochliodes的发酵和制备工艺，抑制mrsa、staphylococcusaureus以及candidaalbicanssc5314等的药理活性，以及在相关抗生素领域的应用。
本发明从chaetomiumcochliodes的发酵培养物中提取分离得到广谱抗耐药菌先导化合物，它的结构式是：
该物质为白色胶状，核磁和高分辨质谱的物化参数是：
positivemsm/z711[(m+h)+];
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.20(3h,s,2-ch3),4.29,4.35(2h,d,12.6hz,3-ch2oh),6.21(1h,s,h-5),7.34(1h,d,7.6hz,h-7),7.31(1h,d,7.2hz,h-8),6.94(t,7.6hz,h-9),6.80(d,7.6hz,h-10),3.10,4.42(eachd,15.4hz,h-11),3.16(3h,s,2’-ch3),4.27(1h,d,12.8hz,3’-ch2oh),4.32(1h,d,12.4hz,3’-ch2oh),2.96(3h,s,5’-ch3),3.71(1h,d,15.2hz,h-7’),3.88(1h,d,15.6hz,h-7’),7.19(h-9’),7.31(1h,d,7.6hz,h-11’),7.23(1h,m,h-12’),7.23(1h,m,h-13’),7.66(1h,m,h-14’).
13cnmr(101mhz,cdcl3)δ165.55(c-1),27.51(2-ch3),74.85(c-3),60.64(3-ch2oh),163.25(c-4),80.15(c-5),148.38(c-6a),125.05(c-7),131.45(c-8),120.40(c-9),111.17(c-10),126.59(c-10a),73.82(c-10b),42.69(c-11),73.59(c-11a),165.58(c-1’),27.41(2’-ch3),76.19(c-3’),61.24(3’-ch2oh),166.86(c-4’),28.27(5’-ch3),76.59(c-6’),27.14(c-7’),107.74(c-8’),127.27(c-9’),34.09(c-10a’),111.45(c-11’),120.63(c-12’),122.85(c-13’),119.19(c-14’),130.44(c-14a’).
广谱抗耐药菌先导化合物（即抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）、staphylococcusaureus以及candidaalbicanssc5314先导化合物毛壳菌素）的制备，它包括如下步骤：
（1）菌株的分离和纯化：利用无菌水将新鲜的三七根清洗3次，然后切成0.2cm×0.2cm的小块，利用添加硫酸链霉素和氨苄青霉素的pda培养基，于25-30℃培养7-14天，挑取纯的菌株。
（2）制作种子培养基：将保藏号为：cgmccno.13574的螺卷毛壳菌chaetomiumcochliodes菌株接种于葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏的斜面培养基中：ph6.5-7.5，在温度25-30℃、转速150rpm条件下培养120小时，获得种子培养液；
（3）发酵罐发酵生产：将2000-5000ml种子培养液转入发酵培养基，利用50l发酵罐，于25-30℃发酵72-96小时。发酵培养基（重量百分比%）：葡萄糖0.3-2，酵母提取物0.03-0.2，蛋白胨0.2-0.4，谷胱甘肽0.01-0.03，水100-150；将种子培养液加入发酵培养基，通气量的体积比为0.3-0.5/发酵液（即每分钟通气的体积/发酵液的体积比），搅拌速度150-200rpm，于室温25-30℃发酵72-96小时；
将发酵液经纱布过滤和离心分离菌体，将菌体利用甲醇浸泡，发酵液利用大孔树脂吸附菌液，然后利用乙醇洗脱，洗脱液浓缩后得到浸膏，浸膏利用多次硅胶，以30%-50%石油醚/乙酸乙酯为流动相进行减压分离和纯化，最后得到广谱抗耐药菌先导化合物即毛壳菌素单体化合物。结构确定：利用高分辨核磁波谱数据结合高分辨质谱，确定了广谱抗耐药菌先导化合物（chaetomin）的结构。
一种广谱抗耐药菌先导化合物的应用，该化合物在制备抑制mrsa，staphylococcusaureus，candidaalbicanssc5314生物活性的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果，实验结果显示chaetomin具有广谱的抗真菌和抗细菌活性，抗candidaalbicanssc5314的最小抑制浓度为1.56μg/ml（阳性对照甲氧西林为0.78μg/ml），抗candidaalbicans17#和g5的最小抑制浓度为3.125μg/ml，特别是抗mrsa活性远远小于甲氧西林，为0.05μg/ml（阳性对照甲氧西林的mic=0.625μg/ml），约是阳性对照甲氧西林的最小抑浓度的1/13，抗staphylococcusaureus的最小抑制浓度为0.1μg/ml(阳性对照甲氧西林的mic=0.625μg/ml)，约是阳性对照甲氧西林最小抑制浓度的1/6。实验证明，chaetomin具有广谱抑制mrsa，staphylococcusaureus，candidaalbicanssc5314的活性，发酵工艺简单，可以大规模制备，具有用于抗生素药物的前景。
螺卷毛壳菌chaetomiumcochliodes菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏号为：cgmccno.13574。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏中心邮编100101，保藏日期2017年1月9日。该生物材料的分类命名及拉丁文名称:螺卷毛壳（chaetomiumcochliodes）。
菌株的获得：菌株的分离和纯化：利用无菌水将新鲜的三七根清洗3次，然后切成0.2cm×0.2cm的小块，利用添加硫酸链霉素和氨苄青霉素的pda培养基，于25-30℃培养7-14天，挑取纯的菌株。三七根际来源的螺卷毛壳菌chaetomiumcochliodes，菌落培养初期为白色，且颜色不变；分生孢子头初为球形，继而成为致密的直柱形。
抑制病原菌生长活性：以病原菌为受试菌，根据其生长特性确定不同的生长时间和生长温度，使用多功能酶标仪检测并记录各孔吸光值，并确定其最小抑菌浓度（mic）。
具体实施方式
实施例1：一种广谱抗耐药菌先导化合物的制备方法，它包括如下步骤：
（1）制作种子培养液：将保藏号为：cgmccno.13574的螺卷毛壳菌chaetomiumcochliodes斜面接种于葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏培养基中：ph:7.0，在温度25℃、转速170rpm、培养168h，获种子培养液。种子培养基为葡萄糖1.0，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，粗海盐3、水100，以上的数值皆为重量比。螺卷毛壳菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏号为：cgmccno.13574。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏中心邮编100101，保藏日期2017年1月9日。该生物材料的分类命名及拉丁文名称:螺卷毛壳（chaetomiumcochliodes）。
（2）发酵罐发酵生产：发酵培养基（重量百分比%）：葡萄糖1，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，琼脂1，粗海盐3，通气量0.3-0.5/发酵液（v/v），转速100-140rpm，水100，将1000ml种子培养基转入30l发酵罐中，于28℃发酵培养72小时得到发酵液；
浸膏制备：浸膏的制备：将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，菌体利用甲醇浸泡，发酵液利用大孔树脂吸附，然后通过大孔树脂体积3倍体积的100%乙醇洗脱，洗脱液在50℃浓缩，获得浸膏。
化合物的分离、纯化：浸膏利用多次硅胶柱层析，以30%-50%石油醚/乙酸乙酯为流动相，以及sephadexlh-20为固定相，石油醚/二氯甲烷/甲醇（1:1:1）为流动相，进行分离和纯化，重结晶，即得到广谱抗耐药菌先导化合物（chaetomin）。
实施例2，用途实施例：化合物chaetomin对mrsa的抑制作用
抑制病原菌生长活性：以病原菌为受试菌，根据其生长特性确定不同的生长时间和生长温度，使用多功能酶标仪检测并记录各孔吸光值，并确定其最小抑菌浓度（mic）。
化合物chaetomin对mrsa的抑制作用的实验包括如下步骤：
（1）细菌活化：将mrsa接种至m-h培养基中，于37℃恒温摇床中110rpm培养6-8小时至对数生长中期。
（2）菌悬液配置：用新鲜m-h培养基将其稀释至od600=0.05-0.055（此时对应~106cfu/ml菌浓）。
（3）药敏反应板制备：取无菌96孔微孔板，每排1号孔加入100μlm-h培养基作为空白对照，2号孔中加入200μl菌悬液和待测化合物（或利福平对照及dmso对照），3-12号孔加入100μl菌悬液，2-11号孔进行倍比稀释，12号孔为不含药物的阳性对照。随后用parafilm封口膜封闭各测试板，置于37℃恒温培养箱中孵育24小时。
（4）最小抑制浓度（mic）判定：使用多功能酶标仪检测并记录各孔吸光值，mrsa生长被抑制90%以上（荧光值低于阴性对照组90%以上）的孔所对应的化合物终浓度即定义为该化合物对mrsa的最小抑菌浓度（mic）。
实施例3：用途实施例：化合物chaetomin对真菌candidaalbicans的抑制作用
化合物chaetomin对真菌candidaalbicans的抑制作用的实验包括如下步骤：
（1）candidaalbicans的活化：挑取保存的candidaalbicans菌株接种至1mlyepd培养基中，于30℃、200rpm培养24h，使真菌处于指数生长后期，即od600=0.8~1.0。
（2）菌悬液的配置：以rpmi1640培养基稀释菌液浓度，用血细胞计数板于显微镜下计数，调整菌悬液浓度为1×103-5×103cfu/ml。
（3）药敏反应板制备：取无菌96孔微孔板，每排1号孔加入100μlrpmi1640培养基作为空白对照，2号孔中加入200μl菌悬液和待测化合物（或两性霉素对照及dmso对照），3-12号孔加入100μl菌悬液，2-11号孔进行倍比稀释，12号孔为不含药物的阳性对照。随后用parafilm封口膜封闭各测试板，置于30℃恒温培养箱中孵育24小时。
（4）mic值判定：使用多功能酶标仪检测620nm处各孔od值，与阳性对照孔比，以od值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为mic值（真菌生长80%被抑制时的药物浓度）。
实验结果显示chaetomin具有广谱的抗真菌和抗细菌，抗candidaalbicanssc5314的最小抑制浓度为1.56μg/ml，抗candidaalbicans17#和g5的最小抑制浓度为3.125μg/ml，特别是抗mrsa活性远远小于甲氧西林，为0.05μg/ml（50ng/ml），抗staphylococcusaureus的最小抑制浓度为0.1μg/ml，其活性远远强于万古霉素。