本发明属于药物残留检测技术领域。更具体地，涉及一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
泰乐菌素(Tylosin,TYL)，亦称泰农，是Hamill等于1959年从弗氏链霉菌的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素。TYL对革兰氏阳性菌有明显抑制效果，对部分革兰氏阴性菌也有抑制作用，对畜禽支原体疾病有很好的治疗作用，是治疗支原体疾病的首选药物。对绝大多数的螺旋体、病毒等具有一定的抑制及杀灭功效，还具有促进动物生长、改善饲料效率的作用，因此被广泛应用于畜牧养殖业中。但是这些药物的残留会引起人体的过敏反应(皮疹、过敏性休克等)，抑制肠道中正常的敏感菌群的生长，使致病菌、念珠菌大量增殖而导致全身或局部感染，并且发现耐泰乐菌素的肠球菌对红霉素具有抗性，其与一些其它抗生素的交叉耐药性会导致人体对抗生素产生抗药性，给临床治疗带来很大的危害。
欧盟委员会于1999年禁止泰乐菌素作为增长促进剂使用。然而，在一些国家泰乐菌素还是作为家禽，猪和牛的生长促进剂被使用。为了人类健康的长远利益考虑，食品法典委员会，欧盟委员会和一些国家都建立了泰乐菌素在禽畜类食物中的最大残留限量。我国农业部在2002年发布的第235号文件《动物性食品中兽药最高残留量》对泰乐菌素也做出了最高残留限量标准。对于不同的物种及不同的组织其限量值不同，如在牛奶中限量为50μg/kg，在鸡蛋及猪肉、内脏等中的限量为200μg/kg。因此，研究和制定出能够简单、快速、灵敏、可靠地检测出食品中泰乐菌素残留的方法对完善我国食品安全监测体系具有重要意义。
目前国内外有很多检测动物源性食品中泰乐菌素残留量的方法，主要包括微生物法、高效液相色谱、色谱－质谱联用法、免疫分析法(包括酶联免疫法和胶体金免疫层析)等。其中，微生物法因其分析周期长，实验步骤繁琐，灵敏度低等致命性的缺点逐渐被其他方法所替代。高效液相色谱法等仪器检测方法检测准确、灵敏度高、重复性好，但是仍然存在成本高，时间久，不能满足高通量，现场检测等问题。基于抗原抗体特异性反应的免疫检测方法现在已经较为成熟，与其他仪器方法比较，免疫分析方法灵敏度高，成本低，检测时间短，还适用于高通量样品的检测，已逐渐成为有毒有害残留物快速筛选监测的主要方法之一。
目前，国内外使用酶联免疫方法检测泰乐菌素的技术大部分是利用带氨基的有机酸与泰乐菌素大环上的醛基反应得到带有羧基结构的衍生半抗原。这些半抗原结构较复杂，偶连手臂较长，容易折叠，造成骨架构象变化，不利于暴露于载体蛋白表面，免疫效果重复性不好，且对反应原料要求较高。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服上述现有泰乐菌素残留检测技术的缺陷和不足，提供一种新的泰乐菌素半抗原结构，具体是将泰乐菌素分子大环内酯侧链的乙醛基直接一步氧化成羧基作为半抗原，而氧化后的乙酸手臂长短适中，不宜折叠，与骨架结构重叠度高，最大限度保持了泰勒菌素立体结构，有利于抗体的稳定免疫诱导，进而所述半抗原与载体蛋白偶联，其特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，能获得特异性抗体，为建立免疫检测方法奠定基础。
本发明的目的是提供一种泰乐菌素半抗原及其制备方法。
本发明另一目的是提供一种泰乐菌素人工抗原及其制备方法。
本发明再一目的是提供一种泰乐菌素抗体及其应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种泰乐菌素半抗原，其分子结构式如式(Ⅰ)所示：
所述泰乐菌素半抗原在制备泰乐菌素人工抗原中的应用，也在本发明的保护范围之内。
一种泰乐菌素人工抗原，是将上述泰乐菌素半抗原与载体蛋白偶联得到，其分子结构式如式(Ⅱ)所示：
其中，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。
所述泰乐菌素半抗原或泰乐菌素人工抗原在制备泰乐菌素抗体(包括多克隆抗体)中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
一种酶联免疫检测泰乐菌素的免疫原和包被原组合，免疫原为所述半抗原与BSA偶联得到，包被原为所述半抗原与OVA偶联得到。
所述免疫原和包被原组合在检测泰乐菌素或构建泰乐菌素酶联免疫检测方法中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
一种以上述泰乐菌素人工抗原为免疫原制备得到泰乐菌素抗体(包括多克隆抗体)，也应在本发明的保护范围之内。
另外，本发明所述泰乐菌素半抗原的制备方法，是将泰乐菌素分子中大环内酯侧链特有醛基一步氧化成羧基得到泰乐菌素半抗原。
具体地，所述泰乐菌素半抗原的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将酒石酸泰勒菌素溶于叔丁醇和水的混合液中，在0℃下依次加入NaH2PO4、二甲基亚砜、NaClO2，进行醛基氧化反应；
(2)在反应液中加入乙酸乙酯和水萃取，收集有机相；水相再用乙酸乙酯萃取，收集得有机相；合并有机相用水和盐水洗涤，再用无水MgSO4干燥并过滤，滤液减压蒸除溶剂后，残留物经硅胶柱层析纯化获得白色固体，即为所述泰乐菌素半抗原。
其中，优选地，步骤(1)所述叔丁醇和水的体积比为4～6：3。
更优选地，步骤(1)所述叔丁醇和水的体积比为5：3。
优选地，步骤(1)所述酒石酸泰勒菌素和NaH2PO4、NaClO2的摩尔比为1：3～5：1.5～2.5。
更优选地，步骤(1)所述酒石酸泰勒菌素和NaH2PO4、NaClO2的摩尔比为1：4：2。
另外，所述泰乐菌素人工抗原的制备方法，是采用活泼酯法将所述泰乐菌素半抗原和载体蛋白进行偶联，制备获得泰乐菌素人工抗原；具体包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述泰乐菌素半抗原溶于DMF中，然后加入DCC和NHS，于4℃下搅拌进行反应；
(2)称取载体蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中，将上述步骤(1)的反应液离心，取出上清液逐滴加入到载体蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下继续反应；
(3)将反应液于室温下透析3天，每天换2次透析液，即制得泰乐菌素人工抗原。
其中，优选地，步骤(1)所述泰乐菌素半抗原与DCC和NHS的投料比为1：1.5～2.5：1.5～2.5。
更优选地，步骤(1)所述泰乐菌素半抗原与DCC和NHS的投料比为1：2：2。
优选地，载体蛋白与泰乐菌素半抗原的摩尔比为60：1。
优选地，所述DMF和磷酸盐缓冲溶液的体积比为1：10。
优选地，步骤(1)所述反应的时间为8～12h。
优选地，步骤(2)所述反应的时间为8～12h。
本发明具有以下有益效果：
本发明将泰勒菌素大环侧链的乙醛基官能团作为衍生偶联位点，通过一步氧化法将醛基转化为羧基，得到羧甲基化偶联手臂的泰勒菌素半抗原；而氧化后的乙酸手臂长短适中，不宜折叠，半抗原与泰勒菌素分子高度一致，与骨架结构重叠度高，其稳定构象与泰勒菌素分子稳定构象完全重叠，最大限度保持了泰勒菌素分子立体结构特征，有利于抗体的稳定免疫诱导，进而所述半抗原与载体蛋白偶联，其特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，能获得特异性抗体，为建立免疫检测方法奠定基础。
进一步采用活泼脂法将半抗原与载体蛋白偶联得到人工抗原，并通过人工抗原免疫动物获得泰勒菌素高特异性抗体，与其他结构及功能类似物均无交叉，进一步用所述抗原抗体优化建立了泰勒菌素酶联免疫吸附分析方法，检测限达到0.051ng/mL，半抑制浓度为1.39ng/mL，准确度和灵敏度很好，可用于环境和食品样品中泰乐菌素的快速有效检测，具有广阔的应用前景。
而且，本发明合成半抗原的方法简单，易于掌握，所建立的酶联免疫方法灵敏度和准确度高，操作简单，成本低，非常适合于现场检测；为高效，低廉、快速的免疫检测产品打下很好的基础，具有良好的应用前景和经济效益。
附图说明
图1为泰乐菌素半抗原的结构式。
图2为泰乐菌素半抗原的质谱图。
图3为泰乐菌素标准曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1泰乐菌素半抗原的制备
(1)将1g酒石酸泰洛星溶于50mL叔丁醇和30mL水的混合液中，在0℃下依次加入0.62g NaH2PO4、1mL二甲基亚砜、0.2g NaClO2，反应30min；
(2)在反应液中加入乙酸乙酯(50mL)和水(10mL)萃取3次，收集有机相。水相再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次。合并的有机相用水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，用无水MgSO4干燥并过滤。滤液减压旋蒸后经硅胶柱层析纯化(甲醇：氯仿＝1：10)获得白色固体，即为半抗原。
泰乐菌素半抗原的质谱图如图2所示，出现了m/z为932.5的离子峰，说明该产物去质子后的分子量为931.5，与目标产物的理论分子量931.5一致。证明其具有式(Ⅰ)所示的结构(如图1)：
实施例2泰乐菌素人工抗原的制备
(1)称取实施例1制得的半抗原93.2mg(0.1mmoL)溶于0.5mL DMF中，搅拌加入51.2mg(0.2mmol)DCC和23mg(0.2mmoL)NHS，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液。
(2)称取载体蛋白(BSA，OVA)15mg溶于5mL浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。
(3)将反应液装入透析袋，4℃下用pH＝8.0的磷酸盐缓冲溶液透析3天，每天更换2～3次透析液，即制得泰乐菌素人工抗原。
泰乐菌素的人工抗原结构式如式(Ⅱ)所示：
实施例3泰乐菌素抗体的制备
本实施例所述抗体制备方法参照本领域常规方法。
将泰乐菌素人工抗原与等剂量的免疫佐剂混合(第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)，用搅拌器完全乳化后，背部多点皮下免疫健康新西兰大白兔，以后每隔三周加强免疫一次。利用间接ELISA测定血清效价和抑制率，待效价稳定后，再加强免疫一次。最后一次免疫后一周心脏采血，离心保留血清。采用辛酸-硫酸铵盐析法对血清进行纯化得到高特异性的抗体。
实施例4泰乐菌素酶联免疫检测方法的建立
通过棋盘法确定抗原和抗体的工作浓度，包被原的工作浓度为0.16μg/mL，泰乐菌素抗体浓度为0.5μg/mL。
用不同浓度的泰乐菌素标准品溶液做实验溶液，梯度稀释下进行竞争，采用9组平行实验(n＝3)。
间接竞争性ELISA方法：用0.1M pH 7.4碳酸盐缓冲溶液(PBS)将包被原稀释到上述浓度，37℃包被过夜。用含0.05％吐温的PBS缓冲溶液洗涤2次，加入封闭液(含2％脱脂奶粉0.05％吐温的PBS缓冲溶液)，振荡混匀，37℃孵育3h；甩干孔中液体，37℃烘干备用。将泰乐菌素标准品溶液加入板孔，再加入稀释后的抗体，同时设置空白孔和阴性对照孔，37℃孵育40min，洗板5次，加入稀释好的酶标二抗溶液；37℃孵育30min；洗板5次，加入底物显色溶液，37℃显色10min，加入终止液终止反应，用酶标仪测定各孔在波长450nm处的吸光值，以吸光值为纵坐标，以泰乐菌素标准品溶液浓度的log10值为横坐标，绘制半对数标准曲线图，见附图3所示泰乐菌素ELISA竞争标准曲线。
结果表明标准曲线具有完整的反S形状，并且有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数3次，实验重复性良好，相对标准偏差均在15％以内。
根据标准曲线得出10％抑制量(LOD)和半数抑制量(IC50)，检测抗体性能。
结果表明，泰乐菌素多克隆抗体对泰乐菌素的半数抑制量(IC50)为1.39ng/mL，最低检测限(LOD)为0.051ng/mL。
由同样的方法绘制标准曲线，计算其它结构或功能类似物的半数抑制量(IC50)，并计算交叉反应率。从表1的检测结果可以说明本发明方法准确度和灵敏度很好，可用于环境和食品样品中泰乐菌素的检测，实际使用中非常方便快捷。
表1本发明抗原、抗体检测泰乐菌素类似物的半抑制浓度和交叉率
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。