本发明涉及一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒及其制备方法，属于分子生物学和医学领域。
背景技术：
：吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。吞噬细胞具有对异物吞噬和消化的功能，当病原微生物侵入机体后，在激发免疫应答以前即可被吞噬细胞吞噬并清除，这在机体非特异性免疫中具有重要意义。不同的基因表达、细胞因子、药物等均可以通过改变细胞的吞噬功能，对机体的非特异性免疫产生影响，因此，测量吞噬细胞的吞噬能力具有十分重要的科学研究和临床意义。现有检测细胞吞噬的传统方法有吞噬中性红法，吞噬鸡血红细胞法等，但存在敏感度有限，试剂难以保存等问题，国外有用荧光法检测细胞吞噬功能的试剂盒，虽然敏感度有所提高，但也存在一定缺陷，如应用范围窄，只能用于测定贴壁细胞的吞噬效率，对于中性粒细胞等悬浮细胞检测效果不佳；检测手段单一，只能使用荧光酶标仪进行检测，无法获得吞噬细胞的形态学图像；荧光颗粒单一，试剂盒中的荧光颗粒仅为荧光标记的大肠杆菌一种，而且该试剂盒仅能进口，价格昂贵，不利于广大基层实验室进行科学研究。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒及其制备方法，所述荧光试剂盒包含有可以被细胞吞噬的荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌，能够通过检测细胞内荧光信号的强弱来判断细胞吞噬的细菌数量，从而确定细胞的吞噬活性。本发明的第一个目的通过以下的技术方案实现：一种检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒，包括荧光标记大肠杆菌，其特征在于：还包括荧光标记铜绿假单孢菌。通过采用上述技术方案，利用荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌共同检测吞噬细胞的吞噬活性，避免了仅用一种荧光颗粒检测导致的实验偏差，使结果更为全面和可靠。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光标记大肠杆菌和/或荧光标记铜绿假单孢菌为冻干粉。通过采用上述技术方案，由于本试剂盒需要避光保存以防荧光淬灭，而荧光标记细菌经过真空冻干为冻干粉后，可以在4℃短期保存及运输，在-20℃长期保存。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌具有fitc的荧光标记。通过采用上述技术方案，在碱性条件下，fitc的碳酰胺键可与细菌壁上赖氨酸的ε氨基共价结合，在480nm的激发光源下，可以产生520nm的黄绿色荧光，通过在荧光显微镜、共聚焦显微镜下观察或用荧光酶标仪、流式细胞仪分析荧光的位置和强弱，可对细菌进行定位、半定量、定量的检测，从而计算出细胞的吞噬活性。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光试剂盒还包括缓冲液和用于给细胞核染色的细胞核染色剂。通过采用上述技术方案，缓冲液既可以维持生物的正常ph值和正常生理环境，又可以用来溶解细菌；细胞核染色剂用于给细胞核染色，便于提高观测精度。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述荧光试剂盒还包括用于淬灭多余荧光的台盼蓝溶液。通过采用上述技术方案，台盼蓝溶液可用于淬灭未被吞噬也未被洗去的细菌荧光，减少干扰，提高检测精确度。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述细胞核染色剂采用eb溶液。通过采用上述技术方案，细胞核染色剂采用eb溶液，可以用于细胞核的着色定位，在荧光显微镜下，在480mm的激发光源下可产生橘黄色荧光，有利于提高观察精度。作为所述荧光试剂盒的进一步改进，所述缓冲液为hanks平衡盐缓冲液。hanks平衡盐缓冲液具有以下优点：(1)hanks平衡盐缓冲液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，具有普适、廉价、高效的优点。(2)hanks平衡盐缓冲液与细胞生长状态下的ph值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中，细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。(3)hanks平衡盐缓冲液可按需配置所需ph值。(4)hanks平衡盐缓冲液保存时间长，利用效率高。本发明的第二个目的通过以下的技术方案实现：检测细胞吞噬作用的荧光试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1.大肠杆菌/铜绿假单孢菌的扩增与浓度检测：取大肠杆菌，扩增至od值为3.4～3.48，浓度为10.5×108；取铜绿假单孢菌，扩增至od值为3.4～3.48，浓度为10.5×108；2.荧光标记大肠杆菌的制备：用10×浓缩hanks平衡盐缓冲液将大肠杆菌浓度调至1～2×109cfu/ml，取2×108的大肠杆菌到离心管中，加入1ml的fitc溶液，混匀；加入大肠杆菌的fitc溶液在室温下孵育20分钟；以8000g速度离心10分钟，除去上清，加入1mlhbsa溶液将沉淀吹散洗涤，重复3次，最后用100ul的hbsa溶液重悬沉淀，即获得荧光标记荧光标记大肠杆菌；3.荧光标记铜绿假单孢菌的制备：用10×浓缩hanks平衡盐缓冲液将铜绿假单孢菌浓度调至1～2×109cfu/ml，取2×108的铜绿假单孢菌到离心管中，加入1ml的fitc溶液，混匀；加入铜绿假单孢菌的fitc溶液在室温下孵育20分钟；以8000g速度离心10分钟，除去上清，加入1mlhbsa溶液将沉淀吹散洗涤，重复3次，最后用100ul的hbsa溶液重悬沉淀，即获得荧光标记铜绿假单孢菌。作为所述制备方法的进一步改进，所述fitc溶液采用如下方法配制：1.配制基本液：每100ml基本液包括碳酸氢钠4.2g、氢氧化钠2g、氯化钠5.84g，用水定容至100ml，基本液中各种成分的终浓度为0.5mg/ml，溶质是碳酸钠和氯化钠，将基本液的ph值调为9；2.配制fitc溶液：取基本液，加fitc，配成0.5mg/ml的fitc溶液，现用现配。作为所述制备方法的进一步改进，所述hbsa溶液采用如下方法配制：每100ml的10×浓缩hanks平衡盐缓冲液中加入0.25g的bsa和0.046g的hepes。本发明与现有技术相比，具有如下优点：1)、应用范围广：本发明可用于检测悬浮和贴壁的各种具有吞噬功能的细胞的吞噬活性；2)、检测手段多样：本发明既可以使用荧光显微镜、共聚焦显微镜获得细胞吞噬细菌后的形态学图片，又可以使用荧光酶标仪、流式细胞仪对细菌进行半定量及定量检测，从而计算出细胞的吞噬活性。3)、荧光颗粒多样：本发明包含了荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌两种荧光颗粒，避免了仅用一种荧光颗粒检测导致的实验偏差，使结果更为全面和可靠。4)、便于运输和储存：本发明荧光标记大肠杆菌和荧光标记铜绿假单孢菌为冻干粉，可以4℃运输和短期保存，并不会降低荧光强度，标记效率稳定，方便使用和检测。5)、成本低廉：本发明为首个国产的检测细胞吞噬作用的试剂盒，价格较进口产品大幅降低。附图说明图1为荧光标记大肠杆菌图片；图2为荧光标记铜绿假单孢菌图片；图3为流式细胞仪检测大肠杆菌的散点图；图4为流式细胞仪检测未被荧光标记的大肠杆菌的直方图；图5为流式细胞仪检测fitc荧光标记大肠杆菌的直方图；图6为原代培养小鼠腹腔巨噬细胞光镜(400×)图片；图7为流式细胞仪检测巨噬细胞的散点图；图8为流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬fitc荧光标记细菌前的直方图；图9为流式细胞仪检测巨噬细胞吞噬fitc荧光标记细菌后的直方图；图10为荧光显微镜检测检测巨噬细胞吞噬fitc荧光标记细菌后(1000×)图片。具体实施方式下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例1：荧光试剂盒的制备一、材料：大肠杆菌(atcc标准株25922)、铜绿假单孢菌(atcc标准株27853)、碳酸氢钠、氢氧化钠、氯化钠购于上海国药集团化学有限公司，均为分析纯，fitc(异硫氰酸荧光素)购于sigma公司，bsa、10×浓缩hanks平衡盐缓冲液(具体成份为nacl137.93mm；kcl5.33mm；nahco34.17mm；kh2po40.441mm；na2hpo40.338mm；d-glucose5.56mm)、hepes缓冲液、10mg/ml的eb(溴化乙锭)储存液、台盼蓝、柠檬酸缓冲溶液均购于上海生工生物工程有限公司。二、试剂配制：fitc溶液：每100ml基本液包括碳酸氢钠4.2g、氢氧化钠2g、氯化钠5.84g，用水定容至100ml，基本液中各种成分的终浓度为0.5mg/ml，溶质是碳酸钠和氯化钠，将基本液的ph值调为9；配制fitc溶液时，取2ml基本液，加1mgfitc，配成0.5mg/ml的fitc溶液，现用现配；hbsa溶液：100ml的10×浓缩hanks平衡盐缓冲液中加入0.25g的bsa和0.046g的hepes；eb溶液：将10mg/ml的eb储存液加入1ml的hanks液中，使eb溶液的终浓度为50ug/ml；5×浓缩台盼蓝溶液：将台盼蓝用柠檬酸缓冲溶液溶解至浓度为1.25mg/ml，ph值为4.4。三、细菌的荧光标记：1.大肠杆菌/铜绿假单孢菌的扩增与浓度检测：将大肠杆菌扩增至od值为3.4～3.48，浓度为10.5×108；将铜绿假单孢菌扩增至od值为3.4～3.48，浓度为10.5×108。2.荧光标记大肠杆菌的制备：(2.1)用10×浓缩hanks平衡盐缓冲液将大肠杆菌浓度调至1～2×109cfu/ml，取2×108的大肠杆菌到离心管中，加入1ml的fitc溶液，混匀；(2.2)加入大肠杆菌的fitc溶液在室温下孵育20分钟；(2.3)以8000g速度离心10分钟，除去上清，加入1ml配制的hbsa溶液将沉淀吹散洗涤，重复3次，最后用100ul的hbsa溶液重悬沉淀，即获得荧光标记大肠杆菌(图1所示)；此步骤中，所述hbsa溶液可以用pbs溶液替代；(2.4)获得的荧光标记大肠杆菌浓度为2×109cfu/ml，使用时如说明书方法使用即可，需制备大量荧光标记大肠杆菌时，可将制备过程中涉及的溶液体积等比例放大；(2.5)制备完成后将菌液放置在真空干燥机中，-20℃真空干燥过夜，得到大肠杆菌冻干粉；3.荧光标记铜绿假单孢菌的制备：(3.1)用10×浓缩hanks平衡盐缓冲液将铜绿假单孢菌浓度调至1～2×109cfu/ml，取2×108的铜绿假单孢菌到离心管中，加入1ml的fitc溶液，混匀；(3.2)加入铜绿假单孢菌的fitc溶液在室温下孵育20分钟；(3.3)以8000g速度离心10分钟，除去上清，加入1ml配制的hbsa溶液将沉淀吹散洗涤，重复3次，最后用100ul的hbsa溶液重悬沉淀，即获得荧光标记铜绿假单孢菌(图2所示)；此步骤中，所述hbsa溶液可以用pbs溶液替代；(3.4)获得的荧光标记铜绿假单孢菌浓度为2×109cfu/ml，使用时如说明书方法使用即可，需制备大量荧光标记铜绿假单孢菌时，可将制备过程中涉及的溶液体积等比例放大；(3.5)制备完成后将菌液放置在真空干燥机中，-20℃真空干燥过夜，得到铜绿假单孢菌冻干粉；此法染色的细菌可以使用具有480nm波段激发光的荧光酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜及共聚焦显微镜进行检测。在检测前，先制备荧光标记细菌混悬液，用10×浓缩hanks平衡盐缓冲液溶解一瓶荧光标记细菌(大肠杆菌和铜绿假单孢菌分别溶解)，然后用超声破碎仪短暂破碎一下，破碎时间约为5秒，加入4.5ml蒸馏水，继续超声破碎10-15秒，直至细菌充分混匀。本实施例采用流式细胞仪，以大肠杆菌为检测对象进行检测分析，检测结果如下：图3为大肠杆菌散点图，图3中r1为选定的目标大肠杆菌区域，从图3中可以看出，选定区域的大肠杆菌占总数的大部分，具有代表性。图4为未被荧光标记的大肠杆菌直方图，图5为fitc荧光标记的大肠杆菌直方图。图4和图5中分析使用的就是r1中被圈选的大肠杆菌，图4和图5中的横坐标表示荧光强度，纵坐标表示大肠杆菌个数，m1表示可以被统计到的荧光强度范围。图4和图5的直方图统计结果如表1所示(％fated表示发出荧光的菌落数占总菌落数的百分比，mean表示平均荧光强度)。从图4、图5和表1可以看出，使用fitc荧光标记前，大肠杆菌的荧光强度很弱，平均荧光强度为53.52，发出荧光的菌落数占总菌落数的0.08％，使用fict荧光标记后，大肠杆菌的荧光强度显著增高，平均荧光强度为601.59，发出荧光的菌落数占总菌落数的96.25％，可见，使用本专利的荧光标记方法，大肠杆菌获得fitc荧光的效率很高。铜绿假单孢菌与大肠杆菌同属革兰氏阴性菌，其染色特性与大肠杆菌类似，从图2中也可以直观看出，使用本专利的荧光标记方法，铜绿假单孢菌获得fitc荧光的效率也很高。另外，表1中还统计了采用不同方法保存的未被荧光标记的大肠杆菌和fitc荧光标记大肠杆菌的荧光强度，使用常规液态保存的大肠杆菌的平均荧光强度为257.75，发出荧光的菌落数占总菌落数的98.15％；使用冻干法保存的大肠杆菌的平均荧光强度为586.65，发出荧光的菌落数占总菌落数的96.77％，可见，冻干法处理大肠杆菌是一种能保持大肠杆菌fitc荧光强度的合适方法。表1：％gatedmean未染色大肠杆菌0.0853.52fitc大肠杆菌96.25601.59fitc大肠杆菌液态保存98.15257.75fitc大肠杆菌冻干保存96.77586.65实施例2：96孔板荧光酶标仪检测吞噬效果实验一、自备物品：细胞株(原代培养小鼠腹腔巨噬细胞，其光镜图片参见图6)和青链霉素、dmem培养液、血球计数板、去离子水、细胞培养箱、超声破碎仪、96孔板、荧光酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、玻璃底培养皿、共聚焦显微镜、无菌pbs缓冲液、含有edta的胰酶。二、采用实施例1配制的荧光试剂盒(包含一支荧光标记的大肠杆菌冻干粉、一支铜绿假单孢菌冻干粉、用于淬灭多余荧光的台盼蓝溶液、用于溶解细菌的hanks平衡盐缓冲液以及用于细胞核染色的eb溶液)，按如下实验步骤进行：1.细胞和荧光标记细胞的准备：细胞在加有血清的dmem中养3～4天，需要使用时，用室温下的无菌pbs缓冲液冲洗2遍去除残余培养基，然后加入含有edta的胰酶，于37℃消化15分钟，轻轻将胰酶吸净，再用预冷的4℃的无菌pbs缓冲液冲洗3次，将细胞冲洗下来，离心重悬；2.细胞活力测定：细胞活力应大于90％，计数并用dmem将细胞数调成106个/ml；3.制备荧光标记细菌混悬液：用10×浓缩hanks平衡盐缓冲液溶解一瓶荧光标记细菌(大肠杆菌和铜绿假单孢菌分别溶解)，然后用超声破碎仪短暂破碎一下，破碎时间约为5秒，加入4.5ml蒸馏水，继续超声破碎10-15秒，直至细菌充分混匀；4.准备实验组和对照组：4.1设阴性对照组、阳性对照组和实验组，为了减少误差，每个样本至少5个复孔；4.2阴性对照组：在每个微孔中加150uldmem；4.3阳性对照组：在每个微孔中加100ul细胞悬液+50uldmem；4.4实验组：在每个微孔中加100ul细胞悬液+50ul刺激吞噬的实验药品溶液(此处采用香烟提取物溶液，制备方法为：将3支标准香烟燃烧产生的烟雾溶于20ml的rpmi1640培养液中，调整ph至7.5，过滤除菌，30min内用于实验)4.5孵育一小时，等待细胞附着到孔板上，如果反应慢也可以孵育更长时间；5.加荧光标记细菌和台盼蓝：孵育结束后，吸净培养液，在阴性对照组(空白组)、阳性对照组和实验组的每个微孔中均加入100ul准备好的荧光标记细菌混悬液；于37℃下反应2小时后，吸掉所有的荧光反应液；在反应期间，将4ml去离子水加入1ml的5×浓缩台盼蓝溶液中，超声混匀，反应结束后立即加上配好的台盼蓝溶液100ul，室温反应1分钟后，立即吸走台盼蓝溶液；6.荧光检测：将96孔板置于荧光酶标仪中，激发波长为480nm，发射波长为520nm，为了减少实验误差，可以将复孔的荧光读数进行平均，之后按以下公式进行计算：统计结果表2所示：组别荧光值空白组53.4实验组481.3阳性对照组562.1该实施例中，阳性对照组的吞噬效率为100％，加入香烟提取物刺激的巨噬细胞的吞噬效率为84.12％，可见香烟提取物可以降低巨噬细胞的吞噬效率。实施例3：流式细胞仪检测吞噬效果实验一、自备物品：与实施例2相同；二、采用实施例1配制的荧光试剂盒，按如下实验步骤进行：1.细胞和荧光标记细胞的准备：步骤与实施例2相同；2.细胞活力测定：步骤与实施例2相同；3.制备荧光标记细菌混悬液：步骤与实施例2相同；4.准备实验组和对照组：4.1设阳性对照组和实验组，为了减少误差，每个样本至少5个复孔；4.2阳性对照组：在每个微孔中加300ul细胞悬液+150uldmem；4.3实验组：在每个微孔中加300ul细胞悬液+150ul刺激吞噬的实验药品溶液；4.4孵育：对于贴壁细胞，孵育一小时，等待细胞附着到孔板上，如果反应慢也可以孵育更长时间，如果刺激吞噬实验药品溶液干预时间小于一小时，可待细胞贴壁后再加入刺激吞噬实验药品溶液；对于悬浮细胞，就无需等待细胞贴壁，只需孵育刺激吞噬的实验药品溶液需要干预的时间即可；5.加荧光标记细菌和台盼蓝：5.1孵育结束后，吸净培养液；5.2在阴性对照组和实验组的的每个微孔中均加入300ul准备好的荧光标记细菌悬液，于37℃下反应2小时后，吸掉所有的荧光反应液；5.3在反应期间，将4ml去离子水加入1ml的5×浓缩台盼蓝溶液中，超声混匀，反应结束后立即加上配好的台盼蓝溶液100ul，室温反应1分钟后，立即吸走台盼蓝溶液(注：悬浮细胞吞噬测定不需要吸走台盼蓝溶液，但在所有需要测定的管中均需加入等量台盼蓝溶液)；6.荧光检测：将细胞收集后使用流式细胞仪进行检测，激发波长为480nm，发射波长为520nm，检测结果如下：图7为巨噬细胞散点图，图7中r2为选定的目标巨噬细胞区域，从图7中可以看出，选定区域的巨噬细胞占总数的大部分，具有代表性。图8为巨噬细胞吞噬fitc荧光标记细菌前的直方图，图9为巨噬细胞吞噬fitc荧光标记细菌菌后的直方图。图8和图9中分析使用的就是r2中被圈选的巨噬细胞，图8和图9中的横坐标表示荧光强度，纵坐标表示巨噬细胞个数，m1表示可以被统计到的荧光强度范围。图8的直方图统计结果如表3所示，图9的直方图统计结果如表4所示。从图8、图9、表3和表4可以看出，未吞噬fitc荧光标记细菌的巨噬细胞的平均荧光强度为16.7，发出荧光的巨噬细胞数占总巨噬细胞数的0.66％；已吞噬fitc荧光标记细菌的巨噬细胞的平均荧光强度为1288.1，发出荧光的巨噬细胞数占总巨噬细胞数的91.36％；可见，巨噬细胞的平均荧光强度在吞噬fitc荧光标记细菌后显著升高。表3：表4：实施例4：荧光显微镜(共聚焦显微镜)检测吞噬效果实验一、自备物品：与实施例2相同；二、采用实施例1配制的荧光试剂盒，按如下实验步骤进行：1.细胞和荧光标记细胞的准备：步骤与实施例2相同；2.细胞活力测定：步骤与实施例2相同；3.制备荧光标记细菌混悬液：步骤与实施例2相同；4.准备实验组和对照组：4.1在6孔板中放置处理过的无菌盖玻片，加入1～5×106个细胞后，加入dmem培养基至细胞粘附在玻片上(注：悬浮细胞不用铺无菌盖玻片，无需等待贴壁)；4.2设阳性对照组和实验组，为了减少误差，每个样本至少3个复孔；4.3阳性对照组：加入与实验组刺激液等体积的dmem；4.4实验组：加入刺激吞噬的实验药品溶液；4.5孵育刺激需要的时间；5.加荧光标记细菌和台盼蓝：5.1孵育结束后，吸净培养液；5.2在阳性对照组和实验组的每个微孔中均加入500ul准备好的荧光标记细菌悬液，于37℃反应2小时后，吸掉所有荧光反应液(注：悬浮细胞在800g下离心10min取沉淀，之后均使用离心取沉淀来洗涤细胞)；5.3在反应期间，将4ml去离子水加入加入1ml的5×浓缩台盼蓝溶液中，超声混匀，反应结束后立即加上配好的台盼蓝溶液100ul，室温反应1分钟后，立即吸走台盼蓝溶液(注：悬浮细胞吞噬测定不需要吸走台盼蓝溶液，但在所有需要测定的管中均需加入等量台盼蓝溶液)；5.4细胞核标记：对于贴壁细胞，用无菌pbs缓冲液冲洗2遍后，加入4％多聚甲醛将细胞固定10分钟，吸尽多聚甲醛后，用无菌pbs缓冲液冲洗3遍，再加入eb溶液(50ug/ml，用hanks平衡盐缓冲液溶解)孵育5分钟后，吸净，再用无菌pbs缓冲液冲洗2遍后，取出盖玻片，用抗淬灭树脂封片；对于悬浮细胞，使用甩片机在1000g下离心10min，将细胞粘附在玻片上后，烘干，用4％多聚甲醛将细胞固定，eb染色后封片；5.5荧光检测：将细胞爬片或细胞甩片置于荧光显微镜下，激发波长为480nm，发射波长为520nm，图10所示的是荧光显微镜检测巨噬细胞吞噬fitc荧光标记细菌后的图片，从图中可以看出，细菌发出翠绿色荧光，细胞核发出橘黄色荧光，细胞膜和细胞质发出浅橘黄色荧光，从而能够获得清晰的吞噬细胞的形态学图像。当前第1页12