本发明涉及昆虫物种鉴定领域，具体涉及刺螫库蠓的特异dna序列及其分子鉴定方法。
背景技术：
刺螫库蠓（culicoidespunctatusmeigen,1804)隶属于昆虫纲（insecta）双翅目（diptera）蠓科（ceratopogonidae）库蠓属（culicoideslatreille,1809），其体型微小，在世界范围内广泛分布。刺螫库蠓是一种吸血蠓，可刺吸人和动物血液带来直接骚扰，也可携带病原体进而传播人畜疾病，如蓝舌病病毒(btv)等。由于蓝舌病等一旦爆发流行将带来巨大的经济损失，而对吸血蠓的研究有助于切断虫媒疾病的传播途径，故其在医学与兽医学领域具有重要的研究意义。因此，准确鉴定疾病媒介是对蠓传疾病进行监测、防治的关键一步。
由于蠓虫体型微小、形态特征稀少等原因，传统形态学分类鉴定存在以下不足：（1）卵、幼虫和蛹等早期发育阶段的形态结构和肢体残缺的虫体均难以辩认；（2）传统形态学鉴定的操作过程较为繁琐且需具备较强的专业知识和丰富是实践经验；（3）受限于库蠓性别，如雄性非吸血蠓通过外生殖器和尾器等形态特征易于鉴别，而雌性吸血蠓却难以鉴别；（4）库蠓表型的可塑性和遗传的可变性等也容易导致误判。因此，亟需寻求一种快速、稳定的方法，以实现蠓虫如刺螫库蠓等媒介的准确鉴定。
随着分子生物学和生物信息学的快速发展，以dna序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用技术手段，极大地弥补了传统分类学鉴定的不足。一般来说，昆虫的dna分子标记会选择一段标准的、有足够变异和一定保守性的、且相对较短易扩增的dna片段。因此，昆虫的线粒体dna包含多个基因如nd1-6、nd4l、coi-coiii、atpase6、atpase8、cytb等，非常适合作为分子鉴定的分子标记。目前，应用较多的分子标记是coi、coii、cytb、12srrna、16srrna、nd4、nd5等。12srrna和16srrna因其存在大量的插入和缺失现象，且基因高度保守，进化较慢，故不宜用做条形编码基因。nd4和nd5进化太快，难以设计出通用引物，限制了它们作为全面dna鉴定系统的目标基因。cytb基因大小和结构较为保守，包含信息量大，能够保证足够变异的同时又容易被通用引物扩增，在物种内不同个体之间的差异应小于2%，而近缘种间的差异远大于同种不同个体间，是使用较为广泛的分子标记。
迄今为止，已有诸多研究证明cytb基因适用于昆虫、鸟类、鱼类、哺乳类等类群的分类鉴定。因此，可采用基于cytb基因的特异dna序列对吸血蠓进行分子鉴定。该方法与传统形态学分类方法互为佐证，不仅可实现吸血蠓的快速、准确鉴定，而且可帮助发现库蠓属中的隐存种或新种。目前，通过该方法已获得多种吸血蠓的cytb基因序列并上传至genbank中，但至今尚无刺螫库蠓的cytb基因序列。本发明提供刺螫库蠓的特异dna序列有利于实现其快速、准确鉴定，缩短物种鉴定周期。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种刺螫库蠓的特异dna序列及其分子鉴定方法。通过分子生物学dna测序的方法获取刺螫库蠓的特异dna序列—cytb基因序列，通过基因序列相似性的比对，实现刺螫库蠓的快速、准确鉴定。
为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
通过dna模板制备和pcr反应，由合成的引物扩增刺螫库蠓的cytb基因，经扩增后pcr产物可用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并将特异性扩增出大小约为500bp的条带序列送生物公司测序。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在ncbi中进行blast相似性搜索，确保所得序列为目标基因序列，同时刺螫库蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结果的可靠性。本发明所述的刺螫库蠓的特异dna序列为cytb基因序列，所述刺螫库蠓的cytb基因序列如seqidno.1所示：
tactttttattcgcttatgctattcttcgatctatccccaataaattaggaggagtaatt60
gccttagtcatatcaattgcaattctttttattttaccttttacccacaaaagaaacttt120
cgaactttaaaattctacccattaaataaaattttattttgaaacttttttattatcgta180
ctattactaacttgaattggagcccgacctgtagaagacccgtatattttaaccggacaa240
attttaacagttttatattttttctactacttattaaatccccttactataaaaatatga300
gataaaataatttattaatcaatgagcttgaataagcatatgttttgaaaacataagata360
aaataatttttattgatttttactaaaaattaatcatataattaaaataaaaattaataa420
tttaagactaacaaataaaattaaaaaacataaagaaaaagataaataactttttcaagc480
taagtatattaatttatcat500
所述的刺螫库蠓的特异dna序列的pcr引物分别为：
正向引物：5’cayattcaaccwgaatgata3’。
反向引物：5’ggtaywttgcctcgawttcgwtatga3’。
本发明的刺螫库蠓的分子鉴定方法，步骤包括：
1）从待测的蠓组织中分离提取dna；
2）以该dna为模板，采用的引物为：正向引物：5’cayattcaaccwgaatgata3’，反向引物：5’ggtaywttgcctcgawttcgwtatga3’，通过聚合酶链式反应扩增出刺螫库蠓cytb基因；
3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，根据电泳条带判断是否为目的条带，如果能特异性扩增出大小约为500bp的条带，则将pcr产物切胶纯化，-20℃保存；
4）聚合酶链式反应扩增出该库蠓cytb基因与peasy-t1载体连接转化进trans1-t1感受态细胞中进行克隆，根据蓝白斑筛选出阳性克隆后扩增，再将含阳性克隆的菌液用60%甘油保存送至生物公司进行双向测序；
5）通过测序结果的比对分析，如果相应cytb基因序列与seqidno.1的相似性在98%以上，即可判断所述的待测组织为刺螫库蠓。
采用上述技术方案的有益效果是：
1）本发明联合了传统的形态学鉴定与分子鉴定方法，对所述库蠓进行鉴定，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。
2）本发明与传统的形态学鉴定方法相比，所建立的刺螫库蠓分子鉴定方法可大大缩短刺螫库蠓的鉴定时间。
3）本发明填补了刺螫库蠓cytb基因序列在genbank数据库中的空白。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为刺螫库蠓cytb基因pcr扩增结果的电泳图谱。编号说明如下：泳道1-3为刺螫库蠓雌虫的cytb基因，检出大小约为500bp的条带。m为250bpdnaladdermarker。
图3为未知库蠓雌虫cytb基因pcr扩增结果的电泳图谱。编号说明如下：泳道1未知库蠓雌虫的cytb基因，检出大小约为500bp的条带。m为250bpdnaladdermarker。
具体实施方式
实施例1刺螫库蠓cytb基因序列的获取
1、刺螫库蠓标本的采集与保存
刺螫库蠓标本均通过网扫法和灯诱法采集于贵州的野外栖息地，并保存于95%酒精中。用解剖针在体视镜下进行解剖，除胸部外其余均制成永久装片，经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。将刺螫库蠓胸部单独标号后进行分子实验。
2、基因组dna提取
将保存的刺螫库蠓胸部研磨后，按照qiagendneasyblood&tissuekit说明书进行单只库蠓基因组dna提取，并保存至-20℃备用。
3、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物：5’cayattcaaccwgaatgata3’。其中，y处的碱基为c或t，w处的碱基为a或t，y或w的设立是用来扩增未知碱基的。
反向引物：5’ggtaywttgcctcgawttcgwtatga3’。其中，y处的碱基为c或t，w处的碱基为a或t，y或w的设立是用来扩增未知碱基的。
4、pcr扩增
dna模板1.5ul
上游引物（10um）1ul
下游引物（10um）1ul
2×pcrmastermix12.5ul
ddh2o9ul
总体系25ul
pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，40℃退火60s，68℃延伸60s，循环5次；94℃变性60s，44℃退火60s，68℃延伸60s，循环35次；最后68℃延伸10min。
5、pcr产物回收
pcr产物用1%琼脂糖凝胶经120v恒压电泳25min后，在凝胶成像系统下观察电泳条带判断是否为目的条带，电泳图谱参见附图2。对扩增效果良好的pcr产物按照琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行pcr产物切胶纯化，-20℃保存。
6、pcr回收产物克隆和测序
pcr回收产物与peasy-t1载体连接转化进trans1-t1感受态细胞中进行克隆，根据蓝白斑筛选出阳性克隆后扩增，再将含阳性克隆的菌液用60%甘油保存送至生物公司进行双向测序。
本实施例的克隆反应体系如下：
dna0.5-4ul
peasy-t1cloningvector1ul
ddh2o0-3.5ul
总体系5ul
克隆反应条件：反应体系轻轻混合，室温（20℃-37℃）反应5-10min。
7、cytb基因序列测定
通过人工校对及生物信息学软件对刺螫库蠓cytb基因序列进行比对、编辑和拼接后即为seqidno.1。
实施例2未知库蠓的鉴定
1、蠓标本的采集与保存
蠓标本通过网扫法和灯诱法采集于野外栖息地，并保存于95%酒精中。用解剖针在体视镜下进行解剖，除胸部外其余均制成永久装片用于形态鉴定。将蠓胸部单独标号后进行分子实验。
2、基因组dna提取
将保存的蠓胸部研磨后，按照qiagendneasyblood&tissuekit说明书进行单只未知蠓基因组dna提取，并保存至-20℃备用。
3、引物合成
本实施例所用引物如下：
正向引物：5’cayattcaaccwgaatgata3’。
反向引物：5’ggtaywttgcctcgawttcgwtatga3’。
4、pcr扩增
本实施例的pcr反应体系如下：
dna模板1.5ul
上游引物（10um）1ul
下游引物（10um）1ul
2×pcrmastermix12.5ul
ddh2o9ul
总体系25ul
pcr反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，40℃退火60s，68℃延伸60s，循环5次；94℃变性60s，44℃退火60s，68℃延伸60s，循环35次；最后68℃延伸10min。
5、pcr产物回收
pcr产物用1%琼脂糖凝胶经120v恒压电泳25min后，在凝胶成像系统下观察电泳条带判断是否为目的条带，电泳图谱参见附图3。附图3显示实施例2的未知库蠓也能通过pcr特异性扩增出大小约为500bp的产物。对扩增效果良好的pcr产物按照琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行pcr产物切胶纯化，-20℃保存。
6、pcr回收产物克隆和测序
pcr回收产物与peasy-t1载体连接转化进trans1-t1感受态细胞中进行克隆，根据蓝白斑筛选出阳性克隆后扩增，再将含阳性克隆的菌液用60%甘油保存送至生物公司进行双向测序。
本实施例的克隆反应体系如下：
dna0.5-4ul
peasy-t1cloningvector1ul
ddh2o0-3.5ul
总体系5ul
克隆反应条件：反应体系轻轻混合，室温（20℃-37℃）反应5-10min。
7、cytb基因序列测定
通过人工校对及生物信息学软件对未知库蠓cytb基因序列进行比对、编辑和拼接后与seqidno.1进行相似性比对，结果显示其与基因序列seqidno.1的相似性大于98%，因而可判定该未知库蠓为刺螫库蠓。
序列表
<110>遵义医学院
<120>一种刺螫库蠓的特异dna序列及其分子鉴定方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>500
<212>dna
<213>刺螫库蠓cytb基因
<400>1
tactttttattcgcttatgctattcttcgatctatccccaataaattaggaggagtaatt60
gccttagtcatatcaattgcaattctttttattttaccttttacccacaaaagaaacttt120
cgaactttaaaattctacccattaaataaaattttattttgaaacttttttattatcgta180
ctattactaacttgaattggagcccgacctgtagaagacccgtatattttaaccggacaa240
attttaacagttttatattttttctactacttattaaatccccttactataaaaatatga300
gataaaataatttattaatcaatgagcttgaataagcatatgttttgaaaacataagata360
aaataatttttattgatttttactaaaaattaatcatataattaaaataaaaattaataa420
tttaagactaacaaataaaattaaaaaacataaagaaaaagataaataactttttcaagc480
taagtatattaatttatcat500
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>正向引物
<400>2
cayattcaaccwgaatgata20
<210>3
<211>26
<212>dna
<213>反向引物
<400>3
ggtaywttgcctcgawttcgwtatga26