本发明属于病毒生物学技术领域，具体涉及一种包膜病毒颗粒的纯化方法，同时还涉及使用分离得到的包膜病毒颗粒的病毒组合物。
背景技术：
病毒可分为包膜病毒(envelopedvirus)和非包膜病毒。非包膜病毒仅由衣壳蛋白和病毒基因组核酸组成，结构简单均质，易于分离纯化。而包膜病毒结构非常复杂，且不均质，因此要得到结构均质的包膜病毒难度非常大。
包膜病毒的基本结构为：线状dna或rna大分子位于病毒颗粒的内核心，其外表是由多个核蛋白亚单位形成的外壳(capsid)，外壳与病毒基因组核酸形成紧密结构的核衣壳(nucleocapsid)颗粒。核衣壳外有脂质包膜，包膜外有1～若干种膜外蛋白，每种膜外蛋白在每个病毒颗粒表面都有多个拷贝，密布于病毒颗粒表面；膜外蛋白一般包括三个区域：膜外区、跨膜区和膜内区，其中，膜外区占主要比例，跨膜区和膜内区很短。包膜病毒的膜外蛋白通常情况下都是高度糖基化的蛋白(glycoprotein)，糖链部分占膜外蛋白比例可高达75％以上。由于糖链是在病毒颗粒形成之后经后加工联接上去的，导致每个培养批内和培养批间收获的包膜病毒颗粒在结构上都是不同质的。
一般而言，包膜以内部分比较稳定和均质，病毒颗粒结构的差异主要在于膜外蛋白，包括每个病毒颗粒膜外蛋白的拷贝数及其糖基化程度。这种差异既可能在病毒颗粒组装时就已形成，也可能在病毒颗粒成熟释出到培养液中后被破坏，包括被蛋白酶、糖链水解酶降解或被机械力剪切而造成。
此外，包膜病毒是严格意义的寄生微生物，需要以其他生物体为培养基质(宿主细胞)。包膜病毒培养过程中，细胞基质会出现坏死、凋亡等生物学效应，细胞的dna被剪切成大小高度不均的片段被释放到培养液中，细胞内物质如各种细胞器、细胞碎片、分子量大小不同的糖类、脂类和各种蛋白质也被释放到培养液中。
包膜病毒是感染人和动物的病毒中的主要类型，常见的致病包膜病毒有狂犬病毒、流感病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒、登革热病毒、艾滋病毒等。为了制备疫苗或者其他的研究需要获得均质或纯度较高的包膜病毒颗粒。
目前，包膜病毒的分离原理主要是利用分子量大小差异将病毒颗粒和杂质分离。分离技术路线主要包括：密度梯度超速离心纯化技术和凝胶过滤柱层析纯化技术。但是由于病毒收获液中部分大分子杂质的分子筛性质与有效成分非常接近，单纯依靠分子筛原理很难进行有效分离。这类杂质包括：
(1)来源于宿主细胞的高分子量蛋白质。培养过程中宿主细胞表达的蛋白质数量在2万种以上，分子量大小不均，许多蛋白质以多聚体形式存在。因此，病毒收获液中的宿主细胞蛋白质(hcp)是一个组成复杂的混合物，其中包括分子筛性质与病毒粒子接近的组分。
(2)来源于宿主细胞的dna。病毒收获液中游离的dna是通过宿主细胞的破碎、病变、坏死或凋亡产生的，这些细胞生物学过程都会产生基因组dna被剪切成大小不同片段的结果。因此，病毒收获液中的宿主细胞dna也是一个分子量大小高度不均一的混合物。一些工艺步骤如超滤浓缩产生的剪切效应还会进一步增加dna分子量大小的不均一性。一部分dna组分的分子筛性质与病毒粒子非常相近。
(3)来源于培养基添加物如牛血清，牛血清也是一种成分复杂的混合物。
(4)来源于包膜病毒的结构衍生物。病毒培养过程中，通常会产生一部分结构不完整的病毒粒子，如膜外蛋白拷贝数过低、糖基化缺失或不完全的病毒。这些结构不完整的病毒粒子与结构完整的病毒粒子在生物学性质和免疫学性质等方面有显著差别，但其分子筛性质与结构正常的病毒粒子十分接近，不易分离。
基于以上原因，现有的包膜病毒颗粒纯化方法很难将包膜病毒颗粒和其他杂质有效分离，更难做到将结构不同或异常的病毒颗粒分离。
此外，现有的纯化方法通常需要对病毒液进行超滤浓缩，而包膜病毒的膜外蛋白非常脆弱，在超滤浓缩过程中很容易被破坏，导致病毒颗粒的异质性更为严重。现有的纯化工艺对培养得到的包膜病毒液要求比较高，只能用于处理特定方法培养的包膜病毒液，一旦培养方法改变，则纯化工艺需要进行大范围的改变。即便针对同一方法培养得到的包膜病毒液进行纯化，也很难保证产品批次间的稳定性，无法获得质量高度稳定的包膜病毒颗粒。
因此，开发一种纯化技术路线简洁、分离效率高、分离选择性好、对包膜病毒结构破坏性小的包膜病毒颗粒分离方法具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于分离包膜病毒颗粒的方法，该方法具有处理条件温和，简洁高效的优点。
本发明的另一个目的在于提供一种含有上述方法分离得到的包膜病毒颗粒的病毒组合物。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于分离包膜病毒颗粒的方法，包括将病毒液进行离子交换层析和羟基磷灰石层析操作，其中，离子交换层析在羟基磷灰石层析之前进行；或离子交换层析在羟基磷灰石层析之后进行。
作为上述方法的进一步改进，离子交换层析包括：
a)可选的预平衡操作：包括使用离子交换预平衡液对离子交换层析柱进行预平衡；
b)上样操作：将病毒液或经过羟基磷灰石层析后的样液上样至离子交换层析柱；
c)可选的平衡操作：包括使用离子交换平衡液对离子交换层析柱进行平衡；
d)可选的预洗脱操作：包括使用离子交换预洗脱液对离子交换层析柱进行预洗脱；
e)洗脱操作：使用离子交换洗脱液对离子交换层析柱进行洗脱。
作为上述方法的进一步改进，进一步包括使用第二离子交换洗脱液对离子交换层析柱进行洗脱。
作为上述方法的进一步改进，分别收集洗出的第一离子交换洗脱液和第二离子交换洗脱液，获得不同结构、组成或纯度的病毒颗粒。
作为上述方法的进一步改进，羟基磷灰石层析包括：
a)可选的预平衡操作：包括使用羟基磷灰石预平衡液对羟基磷灰石层析柱进行预平衡：
b)上样操作：将病毒液或经过离子交换层析后的样液上样至羟基磷灰石层析柱；
c)可选的平衡操作：包括使用羟基磷灰石平衡液对羟基磷灰石层析柱进行平衡；
d)可选的预洗脱操作：包括使用羟基磷灰石预洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行预洗脱；
e)洗脱操作：使用羟基磷灰石洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行洗脱。
作为上述方法的进一步改进，进一步包括使用第二羟基磷灰石洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行洗脱。
作为上述方法的进一步改进，分别收集洗出的第一羟基磷灰石洗脱液和第二羟基磷灰石洗脱液，获得不同结构、组成或纯度的病毒颗粒。
作为上述方法的进一步改进，离子交换层析和羟基磷灰石层析之间没有中间层析操作。
作为上述方法的进一步改进，离子交换层析和羟基磷灰石层析之间没有中间操作。
作为上述方法的进一步改进，离子交换层析为阴离子交换层析。
作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液的ph值独立为7.0～9.5。
作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液独立为磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、tricine缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、tea缓冲液、巴比妥钠缓冲液。
作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液为磷酸缓冲液。
作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液独立添加有水溶性盐。
作为上述方法的进一步改进，包膜病毒包括狂犬病毒、流感病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒、登革热病毒、或艾滋病毒。
一种包膜病毒组合物，包括按上述方法分离得到的病毒颗粒。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，还包括稳定剂。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，稳定剂包括蔗糖和白蛋白。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，蔗糖的质量百分含量为0.5～10％。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，白蛋白的质量百分含量为1～20％。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方法中，病毒液的前处理工艺要求低，处理条件温和，不会对病毒颗粒造成二次破坏，同时具有处理量大，处理成本低的特点。
(2)本发明方法提高了病毒颗粒的结构均一性，通过离子交换层析和羟基磷灰石层析，可将目标病毒颗粒与分子量接近但结构异常的包膜病毒颗粒有效分离。
(3)本发明方法可以在不调整工艺条件的情况下，处理各种培养基质培养得到的病毒液，具有更好的适应性。
(4)本发明方法进一步降低了杂质残留量。
(5)本发明方法提高了纯化工艺的耐受性(processrobustness)，即使病毒液质量出现明显差异，也能通过纯化工艺过程进行较正，保证收获组分批间的一致性。
附图说明
图1为实施例1实验1纯化得到的目标病毒组分的sds-page蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果(条带1-3为vero细胞方瓶培养得到的病毒液经过纯化后的电泳结果；条带4为蛋白marker；条带5-7为vero细胞转瓶培养得到的病毒液经过纯化后的电泳结果；条带8-10为vero细胞生物反应器培养得到的病毒液经过纯化后的电泳结果)。
图2为实施例1实验1vero细胞生物反应器培养得到的病毒液不同纯化阶段sds-page电泳考马斯亮蓝分析结果(marker：蛋白质分子量标准(mr：分子量，单位为kd)；1为病毒收获液；2为离子交换层析洗脱组分；3-4为cht洗脱组分，3为脱盐前的样品，4为脱盐后的样品)。
图3为实施例1实验1vero细胞生物反应器培养收获病毒液纯化后病毒颗粒的电镜照片。
图4为实施例2vero细胞方瓶培养收获的乙型脑炎病毒经不同纯化方法纯化后sds-page电泳银染分析结果(marker：蛋白质分子量标准(mr：分子量，单位为kd)；1本方法纯化样品；2凝胶过滤方法纯化样品；3超速离心方法纯化样品，4病毒收获液)。
图5为实施例2vero细胞方瓶培养收获的乙型脑炎病毒经纯化后病毒颗粒电镜照片。
图6为实施例3鸡胚培养收获的流感病毒经不同纯化方法纯化后sds-page电泳银染分析结果(marker：蛋白质分子量标准(mr：分子量，单位为kd)；1病毒收获液；2超速离心方法纯化样品；3凝胶过滤方法纯化样品，4本方法纯化样品)。
图7为实施例3鸡胚培养收获的流感病毒纯化后病毒颗粒电镜照片。
具体实施方式
一种用于分离包膜病毒颗粒的方法，包括将病毒液进行离子交换层析和羟基磷灰石层析操作，其中，离子交换层析在羟基磷灰石层析之前进行；或离子交换层析在羟基磷灰石层析之后进行。
本发明技术所使用的离子交换层析柱可以是各种现有的离子交换层析柱。示例性的阴离子交换层析柱包括但不限于：appliedbiosystems的deaecellulose、porospi20、pi50、hq10、hq20、hq50、d50，monoq、miniq、source15q和30q、q、deae和anxsepharosefastflow、qsepharosehighperformance，gehealthcare的qaesephadextm和fastqsepharosetm，j.t.baker的wppei、wpdeam、wpquat，biochromlabsinc.的hydrocelldeaeandhydrocellqa，biorad的unosphereq、macro-prepdeae和macro-prephighq，palltechnologies的ceramichyperdq、ceramichyperddeae、qhyperz、trisacrylm和lsdeae、spherodexlsdeae、qmaspherosills、qmaspherosilm，dowexfinemeshstrongbasetypei和typeπanionresins和dowexmonosphere77，dowliquidseparationd的弱碱性阴离子交换层析柱，millipore的matrexcellufmea200、a500、q500和q800，emd的
示例性的阳离子交换层析柱包括但不限于：monos、minis、source15s和30s、spsepharosefastflowtm、gehealthcare的spsepharosehighperformance、tosoh的
羟基磷灰石层析柱包括但不限于：陶瓷羟基磷灰石层析柱(型号有：chttypei和typeii、bio-radlaboratories、hercules、calif.)，ha超凝胶羟基磷灰石层析柱(型号有：pallcorp.、easthills、n.y.)、和陶瓷氟磷灰石层析柱(型号有：cfttypei和typeii、bio-radlaboratories、hercules、calif.)。
作为上述方法的进一步改进，离子交换层析包括：
可选的预平衡操作：包括使用离子交换预平衡液对离子交换层析柱进行预平衡；
上样操作：将病毒液或经过羟基磷灰石层析后的样液上样至离子交换层析柱；
可选的平衡操作：包括使用离子交换平衡液对离子交换层析柱进行平衡；
可选的预洗脱操作：包括使用离子交换预洗脱液对离子交换层析柱进行预洗脱；
洗脱操作：使用离子交换洗脱液对离子交换层析柱进行洗脱。
可选的操作步骤可以根据不同离子交换层析柱的类型、具体型号、病毒液或样液的情况等进行相应的调整。
作为上述方法的进一步改进，进一步包括使用第二离子交换洗脱液对离子交换层析柱进行洗脱。
作为上述方法的进一步改进，分别收集洗出的第一离子交换洗脱液和第二离子交换洗脱液，获得不同结构、组成或纯度的病毒颗粒。
作为上述方法的进一步改进，羟基磷灰石层析包括：
可选的预平衡操作：包括使用羟基磷灰石预平衡液对羟基磷灰石层析柱进行预平衡；
上样操作：将病毒液或经过离子交换层析后的样液上样至羟基磷灰石层析柱；
可选的平衡操作：包括使用羟基磷灰石平衡液对羟基磷灰石层析柱进行平衡；
可选的预洗脱操作：包括使用羟基磷灰石预洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行预洗脱；
洗脱操作：使用羟基磷灰石洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行洗脱。
可选的操作步骤可以根据不同羟基磷灰石层析的具体型号、病毒液或样液的情况等进行相应的调整。
进一步包括使用第二羟基磷灰石洗脱液对羟基磷灰石层析柱进行洗脱。
作为上述方法的进一步改进，分别收集洗出的第一羟基磷灰石洗脱液和第二羟基磷灰石洗脱液，获得不同结构、组成或纯度的病毒颗粒。
为避免降低病毒颗粒完整性，作为上述方法的进一步改进，离子交换层析和羟基磷灰石层析之间没有中间层析操作。
为进一步简化操作，离子交换层析和羟基磷灰石层析之间没有中间操作。
作为上述方法的进一步改进，离子交换层析为阴离子交换层析。
作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液的ph值既可以相同，也可以互不相同，或者部分相同，部分不同。根据具体的层析条件，各溶液的ph值可以独立为7.0～9.5、7.0～9.0、7.0～8.5、7.2～8.0、7.2～7.8、7.3～7.8、7.3～7.6、7.6。各溶液的ph值可以根据具体的层析条件进行相应的调整，这些具体的层析条件包括但不限于离子交换层析柱的类型、具体型号、羟基磷灰石层析柱的具体型号、病毒的种类、病毒一种或多种外膜蛋白的拷贝数、氨基酸组成、糖基化程度、磷酸化程度、各溶液的用量等等。通过对各溶液ph值的调节，获得不同的溶液特性，满足不同的需要。
缓冲液可以更好地稳定层析时的条件，有利于保证层析结果的稳定性。作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液独立为磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、tricine缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、tea缓冲液、巴比妥钠缓冲液等本领域常用的缓冲液。进一步的，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液为同种或阴离子相同的缓冲液。特别的，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液为磷酸缓冲液。各溶液的ph值可以独立为7.0～9.5、7.0～9.0、7.0～8.5、7.2～8.0、7.2～7.8、7.3～7.8、7.3～7.6、7.6。各溶液的ph值可以根据具体的层析条件进行相应的调整，这些具体的层析条件包括但不限于离子交换层析柱的类型、具体型号、病毒的种类、病毒一种或多种外膜蛋白的拷贝数、氨基酸组成、糖基化程度、磷酸化程度、各溶液的用量等等。通过对各溶液ph值的调节，满足不同的需要。在一些实例中，缓冲液中离子(如阴离子，磷酸根离子)的浓度约为1-50mm、1-40mm、5-30mm、10-30mm、15-25mm、18-22mm、或20mm。在一些实例中，缓冲液中离子(如阴离子，磷酸根离子)的浓度约为1-20mm、1-10mm、2-8mm、4-6mm、或5mm。
在一些实例中，离子交换预平衡液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，离子交换预平衡液中离子(例如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-80mm、1-50mm、3-40mm、5-30mm、5-30mm、10-30mm、15-25mm、18-22mm、或20mm。在一些实例中，离子交换预平衡液中盐(如nacl)的浓度约为1-500mm、10-400mm、50-300mm、100-200mm、125-175mm、或150mm。在一些实例中，离子交换预平衡液为磷酸缓冲液，具有约10-30mm、或20mm的磷酸根浓度。
在一些实例中，离子交换平衡液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，离子交换平衡液中离子(例如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-50mm、1-40mm、5-30mm、10-30mm、15-25mm、18-22mm、或20mm。在一些实例中，离子交换平衡液进一步添加有盐，如钠盐、nacl。在一些实例中，离子交换平衡液中盐(如nacl)的浓度约为1-500mm、10-400mm、50-300mm、100-200mm、125-175mm、或150mm。在一些实例中，离子交换平衡液为磷酸缓冲液，具有约10-30mm、或20mm的磷酸根浓度。在一些实例中，磷酸缓冲液进一步含有100-200mm、150mm的nacl。
在一些实例中，离子交换预洗脱液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，离子交换预洗脱液的ph值与离子交换预平衡液和/或离子交换平衡液的ph差值少于2、1、1.5、1、0.8、0.5、0.2、0.1。在一些实例中，离子交换预洗脱液中离子(例如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-50mm、1-40mm、5-30mm、10-30mm、15-25mm、18-22mm、或20mm。在一些实例中，离子交换预洗脱液中添加有浓度约为1-700mm、10-600mm、50-500mm、100-350mm、150-300mm、175-275mm、或250-300mm的nacl。在一些实例中，离子交换预洗脱液(如磷酸缓冲液)中添加有浓度约为1-700mm、10-600mm、50-500mm、100-350mm、150-300mm、175-275mm、或250-300mm的盐(如nacl)。在一些实例中，离子交换预洗脱液为磷酸根离子浓度为的10-30mm、或20mm的磷酸缓冲液。在一些实例中，磷酸缓冲液进一步添加有浓度约为200-300mm(如250mm)、20-100mm(如50mm)、或50-180mm(如120mm)的nacl。
在一些实例中，离子交换洗脱液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，离子交换预洗脱液的ph值与在先使用的任一种溶液的ph值差值少于2、1、1.5、1、0.8、0.5、0.2、0.1。在一些实例中，离子交换洗脱液(如磷酸缓冲液)的中盐(如nacl)浓度约为50-1000mm、100-800mm、或200-700mm。在一些实例中，离子交换洗脱液(如磷酸缓冲液)的中盐(如nacl)浓度约为250-750mm、300-700mm、350-650mm、400-600mm、450-600mm、或500-550mm。在一些实例中，离子交换洗脱液(如磷酸缓冲液)的中盐(如nacl)浓度约为100-500mm、150-450mm、200-400mm、250-350mm、275-325mm或300mm。
在一些实例中，羟基磷灰石预平衡液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，羟基磷灰石预平衡液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-50mm、1-40mm、5-30mm、10-30mm、15-25mm、18-22mm、或20mm。在一些实例中，羟基磷灰石预平衡液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-20mm、1-10mm、2-8mm、4-6mm、或5mm。在一些实例中，羟基磷灰石预平衡液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为50～220mm。在一些实例中，羟基磷灰石预平衡液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为1-500mm、10-400mm、50-300mm、100-200mm、125-175mm、或150mm的盐(如nacl)。在一些实例中，羟基磷灰石预平衡液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为100-1000mm、300-800mm、400-700mm、500-600mm或550mm的盐(如nacl)。在一些实例中，羟基磷灰石预平衡液(如磷酸缓冲液)未添加盐。
在一些实例中，羟基磷灰石平衡液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，羟基磷灰石平衡液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-50mm、1-40mm、5-30mm、10-30mm、15-25mm、18-22mm、或20mm。在一些实例中，羟基磷灰石平衡液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-20mm、1-10mm、2-8mm、4-6mm、或5mm。在一些实例中，羟基磷灰石平衡液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为1-500mm、10-400mm、50-300mm、100-200mm、125-175mm、或150mm的盐(如nacl)。在一些实例中，羟基磷灰石平衡液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为100-1000mm、300-800mm、400-700mm、500-600mm或550mm的盐(如nacl)。
在一些实例中，羟基磷灰石预洗脱液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，羟基磷灰石预洗脱液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-50mm、1-40mm、5-30mm、10-30mm、15-25mm、18-22mm、或20mm。在一些实例中，羟基磷灰石预洗脱液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-20mm、1-10mm、2-8mm、4-6mm、或5mm。在一些实例中，羟基磷灰石预洗脱液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-200mm、20-180mm、30-150mm、40-120mm、50-100mm、40-60mm、80-120mm、50mm、或100mm。在一些实例中，羟基磷灰石预洗脱液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为1-500mm、10-400mm、50-300mm、100-200mm、125-175mm、或150mm的盐(如nacl)。在一些实例中，羟基磷灰石预洗脱液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为100-1000mm、300-800mm、400-700mm、500-600mm或550mm的盐(如nacl)。
在一些实例中，羟基磷灰石洗脱液的ph值约为6.0-10.0、6.5-9.5、7.0-9.5、7.0-9.0、7.0-8.5、7.0-8.0、7.2-7.8、7.4-7.7、7.5-7.6或7.6。在一些实例中，羟基磷灰石洗脱液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为50-500mm、75-350mm、80-320mm、90-310mm、100-300mm、80-120mm、150-230mm、180-220mm、250-330mm、280-380mm、73-223mm、100mm、200mm、或300mm。在一些实例中，羟基磷灰石洗脱液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为200mm。在一些实例中，羟基磷灰石洗脱液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为100-200mm、125-175mm、或150mm。在一些实例中，羟基磷灰石洗脱液(如磷酸缓冲液)的离子(如阴离子、磷酸根离子)的浓度约为1-200mm、20-180mm、30-150mm、40-120mm、50-100mm、40-60mm、80-120mm、50mm、或100mm。在一些实例中，羟基磷灰石洗脱液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为1-500mm、10-400mm、50-300mm、100-200mm、125-175mm、或150mm的盐(如nacl)。在一些实例中，羟基磷灰石洗脱液(如磷酸缓冲液)进一步添加有浓度约为100-1000mm、300-800mm、400-700mm、500-600mm或550mm的盐(如nacl)。
作为上述方法的进一步改进，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液独立添加有水溶性盐。水溶性盐的加入，可以改变溶液的参数，使其满足不同层析条件的需要，这些层析条件包括但不限于离子交换层析柱的类型、具体型号、羟基磷灰石层析柱的具体型号、病毒的种类、病毒一种或多种外膜蛋白的拷贝数、氨基酸组成、糖基化程度、磷酸化程度等等。在一些实例中，盐(如钠盐、具体如nacl)的浓度约为1-500mm、10-400mm、50-300mm、100-200mm、125-175mm、或150mm。在一些实例中，盐(如钠盐、具体如nacl)的浓度约为100-1000mm、300-800mm、400-700mm、500-600mm、或550mm。
作为上述方法的进一步改进，在进行离子交换层析和羟基磷灰石层析之前，对病毒液进行预处理。
作为上述方法的进一步改进，包膜病毒包括但不限于狂犬病毒、流感病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒、登革热病毒、或艾滋病毒等包膜病毒。
一种包膜病毒组合物，包含按上述方法分离得到的病毒颗粒。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，还包括稳定剂。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，稳定剂包括蔗糖和白蛋白。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，蔗糖的质量百分含量为0.5～10％。
作为上述包膜病毒组合物的进一步改进，白蛋白的质量百分含量为1～20％。
一些实例中，离子交换层析的条件根据一种或多种外膜蛋白的拷贝数(例如特定外膜蛋白的拷贝数、一种或多种外膜蛋白的组合)和/或一种或多种外膜蛋白的糖基化程度、磷酸化程度来确定。在一些实例中，离子交换层析的条件包括以下条件中至少一个：柱的类型(如阴离子或阳离子)、柱的型号，离子交换预平衡液、离子交换平衡液、离子交换预洗脱液、离子交换洗脱液、羟基磷灰石预平衡液、羟基磷灰石平衡液、羟基磷灰石预洗脱液、羟基磷灰石洗脱液的离子浓度、ph、特定缓冲液中盐的种类、浓度和/或使用体积；病毒液的体积或上样量。
在一些实例中，病毒包含一种或多种外膜蛋白。离子交换层析或羟基磷灰石层析的条件可以根据以下条件中的一个或多个确定：a)一种或多种外膜蛋白的氨基酸组成；b)一种或多种外膜蛋白的拷贝数；c)一种或多种外膜蛋白的糖基化程度；d)一种或多种外膜蛋白的磷酸化程度。
在一些实例中，洗脱液的离子浓度与一个或多个外膜蛋白的拷贝数呈正比。在一些实例中，洗脱液的离子浓度与一个或多个外膜蛋白的糖基化程度呈反比。
在一些实例中，包膜病毒只有一个外膜蛋白。洗脱液的离子浓度与该唯一的外膜蛋白的拷贝数呈正比，与糖基化程度呈反比。在一些实例中，唯一的外膜蛋白具有优选的拷贝数范围和/或优选的糖基化程度范围。例如与不具有优选拷贝数范围或糖基化程度的病毒相比，优选的拷贝数范围和/或优选的糖基化程度范围使得病毒组合物具有更高的免疫原性。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
本实施例将以狂犬病毒颗粒的纯化为例，对本发明作进一步的说明。
本实施例中，病毒纯度和病毒蛋白比例分析方法为：将纯化收获的病毒组分经过变性sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析，经银染色或考马斯亮蓝染色后，凝胶置于凝胶成像系统下扫描，按峰面积归一法计算各病毒蛋白占总蛋白的比例，以所有病毒蛋白比例之和计算为病毒纯度。
vero细胞dna残留量和nih效价按《中华人民共和国药典》2015年三部所载方法进行。
实验1
本实验以vero细胞(转瓶培养、方瓶培养、生物反应器培养)、人二倍体细胞、鸡胚培养的ctn-1v株狂犬病毒液为例，对本发明的纯化方法作进一步的说明。
1、病毒培养液预处理
将收获的病毒培养液以0.45μm的微孔滤膜进行过滤澄清，得到病毒预处理液。
2、阴离子交换层析
(1)柱平衡：对capto-deae层析柱进行平衡，平衡液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为150mmol/l)。
(2)病毒吸附：将过滤澄清后的病毒液流过平衡后的capto-deae层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为200mmol/l)。
(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为500mmol/l)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到产物a。
3、羟基磷灰石层析
(1)柱平衡：对cht层析柱进行平衡，平衡液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液。
(2)病毒吸附：将过产物a流过平衡后的cht层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph7.6的100mmol/l磷酸缓冲液。
(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：ph7.6的200mmol/l磷酸缓冲液，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到目标病毒颗粒组分。
不同培养基质培养的病毒液纯化后得到的目标病毒颗粒组分的分析见表1和图1-图2。
表1不同培养基质培养的病毒液纯化后得到的目标病毒颗粒组分的特性
图1为实施例1实验1纯化得到的目标病毒组分的sds-page蛋白电泳考马斯亮蓝染色结果(条带1-3为vero细胞方瓶培养得到的病毒液经过纯化后的电泳结果；条带4为蛋白marker；条带5-7为vero细胞转瓶培养得到的病毒液经过纯化后的电泳结果；条带8-10为vero细胞生物反应器培养得到的病毒液经过纯化后的电泳结果)。从图中可以看出，不同培养基质培养得到的狂犬病毒颗粒经过相同的方法分离或纯化后，其蛋白条带位置几乎完全重合。充分说明经过本发明方法纯化后的狂犬病毒颗粒具有极高的纯度，本发明方法可以适用于纯化或分离不同培养基质培养得到的狂犬病毒，大大提高了工艺了适应性。
图2为实施例1实验1vero细胞生物反应器培养得到的病毒液不同纯化阶段sds-page电泳考马斯亮蓝分析结果(marker：蛋白质分子量标准(mr：分子量，单位为kd)；1为病毒收获液；2为离子交换层析洗脱组分；3-4为cht洗脱组分，3为脱盐前的样品，4为脱盐后的样品)。
实验1vero细胞生物反应器培养收获病毒液纯化后病毒颗粒的电镜照片如图3所示。从图中可以看出，病毒颗粒结构完整，具有典型的狂犬病毒颗粒形态。
实验2：
本实验以vero细胞培养的ctn-1v株狂犬病毒液为例，对本发明的纯化方法作进一步的说明。
1、病毒培养液预处理
将收获的病毒培养液以0.45μm的微孔滤膜进行过滤澄清，得到病毒预处理液。
2、阴离子交换层析
(1)柱平衡：对capto-deae层析柱进行平衡，平衡液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为150mmol/l)。
(2)病毒吸附：将过滤澄清后的病毒液流过平衡后的capto-deae层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为200mmol/l)。
(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为500mmol/l)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到产物a。
3、羟基磷灰石层析
(1)柱平衡：对cht层析柱进行平衡，平衡液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液。
(2)病毒吸附：将过产物a流过平衡后的cht层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph7.6的50mmol/l磷酸缓冲液。
(4)产物a洗脱：以洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行产物a洗脱，洗脱液a为：ph7.6的100mmol/l磷酸缓冲液。
(5)产物b洗脱：以洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行产物b洗脱，洗脱液b为：ph7.6的200mmol/l磷酸缓冲液。
(6)产物c洗脱：以洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行产物c洗脱，洗脱液c为：ph7.6的300mmol/l磷酸缓冲液。
4、不同培养基质培养的病毒液纯化后得到的目标病毒颗粒组分的分析
表2不同洗脱组分的特性
实施例1的实验1和实验2的结果表明，本发明的方法具有以下优点：
(1)病毒液的前处理工艺要求低，不会对病毒颗粒造成二次破坏，处理量大，处理成本低。
(2)提高了病毒颗粒的结构均一性，通过离子交换层析和羟基磷灰石层析，可将目标病毒颗粒与分子量接近但结构异常的包膜病毒颗粒有效分离。
(3)可以在不调整工艺条件的情况下，处理各种培养基质培养得到的病毒液。
(4)进一步降低了杂质残留量。
(5)提高了纯化工艺的耐受性(processrobustness)，即使病毒液质量出现明显差异，也能通过纯化工艺过程进行较正，保证收获组分批间的一致性。
实施例2
本实施例将以乙型脑炎病毒颗粒的纯化为例，对本发明作进一步的说明。
本实验以vero细胞培养的p3株乙型脑炎病毒液为例，对本发明的纯化方法作进一步的说明。
1、病毒培养液预处理
将收获的病毒培养液以0.45μm的微孔滤膜进行过滤澄清，得到病毒预处理液。
2、阴离子交换层析
(1)柱平衡：对capto-deae层析柱进行平衡，平衡液为：ph8.0的20mmol/l磷酸缓冲液。
(2)病毒吸附：将过滤澄清后的病毒液流过平衡后的capto-deae层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph8.0的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为50mmol/l)。
(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：ph7.2的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为300mmol/l)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到产物a。
3、羟基磷灰石层析
(1)柱平衡：对cht层析柱进行平衡，平衡液为：ph7.2的5mmol/l磷酸缓冲液。
(2)病毒吸附：将过产物a流过平衡后的cht层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph7.2的5mmol/l磷酸缓冲液。
(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：ph7.2的150mmol/l磷酸缓冲液，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到目标病毒颗粒组分。
图4为实施例2vero细胞方瓶培养收获的乙型脑炎病毒经不同纯化方法纯化后sds-page电泳银染分析结果(marker：蛋白质分子量标准(mr：分子量，单位为kd)；1本方法纯化样品；2凝胶过滤方法纯化样品；3超速离心方法纯化样品，4病毒收获液)。从检测结可以看出，与其他纯化(分离)方法相比，本发明方法得到病毒洗脱液中，只有一个条带，说明该样品中几乎不含杂质，具有极好的分离纯化效果。
图5为实施例2vero细胞方瓶培养收获的乙型脑炎病毒经纯化后病毒颗粒电镜照片。从图中可以看出，获得的病毒颗粒完整，不同病毒颗粒的形态无显著差别，具有典型的乙型脑炎病毒颗粒形态。进一步说明本发明方法可以分离纯化得到完整的病毒颗粒。
实施例3
本实施例将以流感病毒颗粒的纯化为例，对本发明作进一步的说明。
本实验以鸡胚培养的h1n1流感病毒液为例，对本发明的纯化方法作进一步的说明。
1、病毒培养液预处理
将收获的病毒培养液以1.2μm的微孔滤膜进行过滤澄清，得到病毒预处理液。
2、阴离子交换层析
(1)柱平衡：对capto-deae层析柱进行平衡，平衡液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液。
(2)病毒吸附：将过滤澄清后的病毒液流过平衡后的capto-deae层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为120mmol/l)。
(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液(含有氯化钠为500mmol/l)，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到产物a。
3、羟基磷灰石层析
(1)柱平衡：对cht层析柱进行平衡，平衡液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液。
(2)病毒吸附：将过产物a流过平衡后的cht层析柱，加样结束后，以2-5倍柱体积的平衡液继续平衡层析柱。
(3)预洗脱：以预洗脱液对吸附了病毒的层析柱进行预洗脱，预洗脱液为：ph7.6的20mmol/l磷酸缓冲液。
(4)病毒洗脱：以洗脱液对预洗脱后的层析柱进行洗脱，洗脱液为：ph7.6的200mmol/l磷酸缓冲液，根据层析系统检测仪指示的光吸收峰收集洗脱液，得到目标病毒颗粒组分。
图6为实施例3鸡胚培养收获的流感病毒经不同纯化方法纯化后sds-page电泳银染分析结果(marker：蛋白质分子量标准(mr：分子量，单位为kd)；1病毒收获液；2超速离心方法纯化样品；3凝胶过滤方法纯化样品，4本方法纯化样品)。从图中可以看出，本方法纯化得到的病毒杂质的量显著减少，而病毒相关蛋白浓度显著提高。
图7为实施例3鸡胚培养收获的流感病毒纯化后病毒颗粒电镜照片。可以看出，获得的病毒颗粒完整，不同病毒颗粒的形态无显著差别，具有典型的流感病毒形态。
其他的包膜病毒，如麻疹病毒、风疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒、登革热病毒、或艾滋病毒等的分离、纯化，也可以参照上述实施例，在未有实质性改变的前提下实现。