本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae,mp)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae,cp)和嗜肺军团菌(legionellapneumoniae,lp)感染是全球重要的感染性疾病，可在各年龄组儿童发病，以呼吸道感染最为常见，感染部位可贯穿整个呼吸道，且具有一定的传染性。mp、cp、lp是儿童急性上呼吸道感染常见的致病菌，也是引起社区获得性肺炎的主要病原菌。三种病原菌引起的肺炎支原体肺炎、肺炎衣原体肺炎和嗜肺军团菌肺炎为非典型肺炎，在症状、体征及辅助检查方面无特异性，病原体检测有局限性，易于误诊，利用分子技术可以快速、准确地进行诊断，从而配合正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。由这三种病原体引起的呼吸道感染所占比重较高，且三者的混合感染也日渐增多，同时检测、快速检测三种病原体的产品越来越有需求。利用多重荧光pcr分子诊断技术可以达到对三种病原体的快速同步检测，对临床早期诊断有着非常重要的意义。肺炎支原体是无细胞壁，介于病毒和细菌之间能自我复制进行独立生活的最小微生物，革兰氏染色阴性。mp可以引起支原体肺炎、上呼吸道感染、支气管炎、肺脓疡、免疫性溶血性贫血、脑膜脑炎、心肌炎、心包炎、肾炎、社区获得性肺炎等疾病。mp有很强的传染性，主要由口、鼻分泌物以气溶胶微粒的形式通过呼吸道传播，其潜伏期较长，存在全年散发、秋冬季高发的特点，会小范围内流行，引起集体感染，如幼儿园、学校、家庭成员交叉感染等。文献报道的阳性检出率达到15％～35％，另外，15％～20％社区获得性肺炎是由肺炎支原体引起的，在儿童社区获得性肺炎中更是占到20％左右。肺炎衣原体是介于病毒与细菌之间的专属细胞内寄生的病原体，在宿主细胞内生长、繁殖和形成包涵体。传染途径与mp一样是通过呼吸道分泌物在人-人之间传播，在半封闭环境可存在小范围流行。根据遗传学和生物学分为twar、考拉和马3个生物变种，代表株为tw-183t(atccvr2282t)，是一种常见的人类呼吸道致病菌。cp可以引起急性呼吸道感染如咽炎、喉炎、鼻窦炎中耳炎、支气管炎及肺炎等，以肺炎最常见，支气管炎次之；还可以引起心肌炎、心内膜炎、动脉硬化和冠心病、虹膜炎、肝炎、脑膜炎和关节炎等疾病。潜伏期约为10天，一年四季均可感染，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所，文献报道的阳性检出率5％～20％。目前的诊断主要靠病原体的分离和血清学抗体的检测，但时间长、操作复杂，而荧光pcr检测可用于急性感染诊断及特殊人群流行病学研究。嗜肺军团菌是引起军团病的病原菌，是人类单核细胞和巨噬细胞的兼性胞内寄生菌，系革兰氏阴性杆菌，是一类水源微生物，通过嗜肺军团菌有15个血清型，都有致病性。其中i型在人军团菌肺炎中最常常见，估计70％～90％的军团菌病是由i型嗜肺军团菌引起的。初期症状为轻微的咳嗽、不舒服、肌肉酸痛、低热或者还有些消化道症状，与普通感冒和流感症状类似，所以在临床上很难诊断；后期症状是高热、下呼吸道感染和肺炎的表现，x线可以看到明显的肺部病变，部分患者可出现并发症，如心包炎、心肌炎、心内膜炎、急性肾功能衰竭、休克等。潜伏期2～10天，嗜肺军团菌从饮用水系统、空调冷却水、淋浴喷头水等与人群密切接触水体以气溶胶的形式经呼吸道传播给人，引起严重的肺部炎症-军团菌病，使用中央空调的公共场所是传播嗜肺军团菌感染的重要高危场所。流行高峰为夏秋季，散发病例全年均有发生，男女发病比例2：1。本病主要发生于细胞免疫功能低下，如糖尿病、恶性肿瘤、器官移植、肝肾衰竭者。文献报道的阳性率3％～9％，暴露人群行业中10％～25％。微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(lab-on-a-chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。目前市场上针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的检测方法主要有荧光pcr法、免疫法和细菌培养法，其中培养法占一半以上，其次是免疫法，分子检测法所占比重最少。荧光pcr法是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因；免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白；培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。市面上已注册的有单项/两项的检测试剂盒，但没有同时检测三种病原菌的产品。目前市面上暂无利用荧光定量pcr法检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的同类试剂盒，但有这三种病原体单项或者包含这三种病原体的多项检测荧光定量pcr法试剂盒的技术方案公开，可以作为参照进行比对，其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量pcr仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。免疫法检测试剂针对的是样本中病原体引起机体产生的特异性抗体，抗体的检测有窗口期，在发病初期容易漏诊，且灵敏度、特异性较低，样本易污染且干扰物质较多，浓度过高或者过低时都容易造成结果错判，需要重复检测、复查才能确诊，检测的可信度较差；采用培养法检测耗时一般在一天以上，培养效果差，很多病原体无法培养，延误最佳治疗时机。普通的荧光pcr检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是试剂盒一般为多管液态试剂构成，平时需要保存在-20℃环境中，在操作时需要将各管试剂按照比例混合使用，对于保存运输条件、操作方法等方面有较高的要求，容易因保存不当和操作失误引起检测结果不可信。同时由于甲型流感病毒和乙型流感病毒的亚型种类很多，检测试剂盒一般针对的是甲型流感病毒和乙型流感病毒最为常见的亚型，有时因为病毒毒株的变异，可能会产生漏检的情况。由于荧光定量pcr仪检测后的结果需要专业人员来对扩增曲线分析，有时候会有人为误差产生。最后，因为荧光定量pcr仪的升降速度较慢，检测时间一般在1～2个小时，耗时较长。另外，肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的混合感染日渐增多，而三者感染引起的肺炎在症状、体征及辅助检查方面没有特异性，易于误诊，针对这种情况市面上检测单项病原体的产品无法满足快速检测、区分三种病原体的需求。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌三种病原体的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及taqman荧光探针；其中，特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体，seqidno.1和seqidno.2；肺炎衣原体，seqidno.4和seqidno.5；嗜肺军团菌，seqidno.7和seqidno.8；特异性taqman探针序列为：肺炎支原体，seqidno.3；肺炎衣原体，seqidno.6；嗜肺军团菌，seqidno.9。上述技术方案的试剂盒可对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌进行快速准确检测，能在各种环境中简便易用，保证检测的时效性、特异性和灵敏度；针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌各自的保守序列上设计特异性引物探针，并在探针上标记荧光信号，可以同时检测并区分出肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌；由于采用微流控芯片进行扩增，增大了反应腔内液体的比表面积，且热传导更快，能使试剂迅速的进行升降温，并能通过仪器和芯片配合控制反应液的密闭性，避免污染泄漏；试剂盒中检测试剂为干粉状态，预装在微流控芯片中，在不同的反应腔内分别预装有检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的检测试剂干粉，可在4℃低温或常温下保存，使用时仅需加入提取好的核酸样本即可上机检测，解决了低温保存和使用操作繁琐的问题；本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用taqman探针荧光pcr技术，针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌进行检测，设计引物和探针的序列在肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μl。其中，seqidno.1：cagctcagtcgaatcgca；seqidno.2：cacatcaatcgactcgcag；seqidno.3：gtctgtagagaggctctacggc；seqidno.4：gacttgagctagcaca；seqidno.5：ctgatgcctgtctacga；seqidno.6：ctgtctgactgatcatcgtcctcatc；seqidno.7：cagcgctagctgcaatcc；seqidno.8：gctagctggctactgagc；seqidno.9：cgtcctagactagcgttcaatacag；优选的，所述预装干粉检测试剂还包括有pcr缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、datp、dutp、dctp、dgtp，mgcl2、hotstarttaq酶、逆转录酶和ung酶。采用了ung酶/dutp防污染体系，能减少前次pcr反应产物带来的污染干扰；将逆转录酶与hotstarttaq酶混合使用，先进行逆转录过程合成出cdna，再进行pcr扩增，没有添加随机引物，过程一步完成，无需开盖，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的样本污染。所使用的探针为荧光标记的taqman探针，探针两端分别标记荧光报告基团(r)和荧光淬灭基团(q)的寡核昔酸。在探针完整时，即随机状态和无pcr产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收；在荧光pcr扩增过程中，当特异的pcr产物与taqman探针发生杂交反应时hotstarttaq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到；pcr每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板rna的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。优选的，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nm；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nm；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度均为0.5u～5u；所述datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均为0.1mm～2mm；所述mgcl2在扩增体系中的终浓度为1.5mm～10mm。其中，m＝mol/l，是浓度单位；w/v为质量体积比；此外，酶的浓度是在一个反应体系里1u。优选的，所述阳性质控品中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的扩增基因序列的质粒。优选的，所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂。优选的，所述预装干粉检测试剂的制备方法为：(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到pcr管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：-50℃，1h，1大气压；-40℃，5h，＜10pa；-10℃，2h，＜10pa；0℃，2h，＜10pa；30℃，5h，＜10pa；(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。采用上述方法将检测试剂处理为干粉形态，可预装在微流控芯片中，能够在4℃低温或常温下保存一年以上，不影响检测效果，使用时仅需加入样本即可上机检测，方便易用。优选的，所述预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种采用前述试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：(1)将样品dna/rna共提取模板200μl加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；(2)pcr扩增反应的条件为：92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45个循环；(3)有效性判定：阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；(4)结果判读：根据对应的反应腔的检测信号给出结果，直接判断肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的阴阳性结果。本发明与普通荧光pcr法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：1.特异性强：本发明的引物探针针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守区域序列设计，特异性强。2.敏感性高：本发明能检测到10copies/μl浓度的目的基因序列。3.易于保存：本发明的在微流控芯片内预装干粉试剂，保存方便。4.分型检测：在一个芯片内区分肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌。5.无污染：检测过程为封闭操作，大大降低了污染及结果偏差的可能性。6.操作简单快速：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测，从标本送检到得出结果可在2个小时以内完成。7.结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。8.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需pcr产物的后处理，对操作员和环境都无危害。具体实施方式实施例1：本实施例的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及taqman荧光探针；主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片具有微流控流道，包括一条出样主流道以及若干条分样流道；各分样流道分体设置，每个分样流道对应一个反应腔，能等分各个反应腔的试剂；其中，特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体，seqidno.1和seqidno.2；肺炎衣原体，seqidno.4和seqidno.5；嗜肺军团菌，seqidno.7和seqidno.8；特异性taqman探针序列为：肺炎支原体，seqidno.3；肺炎衣原体，seqidno.6；嗜肺军团菌，seqidno.9。所述预装干粉检测试剂还包括有pcr缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、datp、dutp、dctp、dgtp，mgcl2、hotstarttaq酶、逆转录酶和ung酶。检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的干粉检测试剂预装到微流控核酸检测芯片不同的反应腔内；检测试剂经过干燥工艺制成干粉形态，可预装于微流控芯片中；具体的预装干粉检测试剂的制备方法为：(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到pcr管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：-50℃，1h，1大气压；-40℃，5h，＜10pa；-10℃，2h，＜10pa；0℃，2h，＜10pa；30℃，5h，＜10pa；(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。制备好的预装干粉检测试剂是预装在所述主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片中。在本实施中，肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物在扩增体系中的终浓度优选为100nm；肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的taqman荧光探针在扩增体系中的终浓度优选为50nm；海藻糖在扩增体系中的终浓度优选为1％w/v；牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度优选为0.2％w/v；hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度均优选为1u；datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均优选为0.5mm；mgcl2在扩增体系中的终浓度优选为5.5mm；阳性质控品中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的扩增基因序列的质粒；试剂盒的操作和结果判定：(1)将样品dna/rna共提取模板(从人的痰液、鼻咽拭子等样本中提取)200μl加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；(2)pcr扩增反应的条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，58℃退火延伸30s，40个循环；上述pcr扩增反应的条件还可以进行这样选择：92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45个循环；(3)有效性判定：阴性对照孔是未加引物探针的空白孔，检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测出为阳性，否则实验视为无效；(4)结果判读：1号反应腔的数据对应肺炎支原体，2号反应腔的数据对应肺炎衣原体，3号反应腔的数据对应嗜肺军团菌，仪器软件会把对应的反应腔的荧光强度值进行数据处理，直接判断肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的阴阳性结果。实施例2：用本发明的基于微流控芯片的检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒检测4个样品，编号1～4，含有病原体核酸。1号样品含有肺炎支原体核酸，2号样品含有肺炎衣原体核酸，3号样品含有嗜肺军团菌核酸，4号样品只有正常人的核酸，不含肺炎支原体或肺炎衣原体或嗜肺军团菌的核酸。按照实施例1相同的方法进行检测操作，检测结果见表1。表1：样品编号1号2号3号4号1号反应腔+---2号反应腔-+--3号反应腔--+-检测结果表明本试剂盒用在微流控芯片检测能够准确的检测并区分出肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌感染。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，例如引物在扩增体系中的终浓度在100～1000nm范围内进行选择，探针在扩增体系中的终浓度在50～500nm范围内进行选择，海藻糖在扩增体系中的终浓度在1％～10％范围内进行选择，牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度在0.1％～5％范围内进行选择，hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度均在0.5u～5u范围内进行选择，datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均在0.1mm～2mm范围内进行选择，mgcl2在扩增体系中的终浓度在1.5mm～10mm范围内进行选择，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>南京岚煜生物科技有限公司<120>基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)<400>1cagctcagtcgaatcgca18<210>2<211>19<212>dna<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)<400>2cacatcaatcgactcgcag19<210>3<211>22<212>dna<213>特异性taqman探针序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)<400>3gtctgtagagaggctctacggc22<210>4<211>16<212>dna<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)<400>4gacttgagctagcaca16<210>5<211>17<212>dna<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)<400>5ctgatgcctgtctacga17<210>6<211>26<212>dna<213>特异性taqman探针序列为：肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)<400>6ctgtctgactgatcatcgtcctcatc26<210>7<211>18<212>dna<213>特异性保守序列的引物序列为：嗜肺军团菌(legionellapneumophila)<400>7cagcgctagctgcaatcc18<210>8<211>18<212>dna<213>特异性保守序列的引物序列为：嗜肺军团菌(legionellapneumophila)<400>8gctagctggctactgagc18<210>9<211>25<212>dna<213>特异性taqman探针序列为：嗜肺军团菌(legionellapneumophila)<400>9cgtcctagactagcgttcaatacag25当前第1页12