本发明属于生物技术领域，涉及一种基于ssr分子标记对新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”杂交种纯度高通量鉴定的方法。
背景技术：
甜瓜(cucumismelol.，2n＝2x＝24)为葫芦科甜瓜属，是一种风味独特的世界性水果，在国内外广泛栽培。在中国通常将甜瓜分为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜。薄皮甜瓜主要在东部省区种植，而厚皮甜瓜主要在新疆等西北地区种植。但随着吴明珠院士团队等“南移东进”生态育种工作的开展，厚皮甜瓜种植范围不断扩大，逐渐成为助力众多地区农业产业结构调整和农民创收致富的特色经济作物。
杂种优势是生物遗传的普遍现象，在厚皮甜瓜育种中得到广泛应用，目前市场上以杂交种子为主。杂交种子在生产过程中由于去雄不彻底不及时、夹花不严或机械混杂等，易导致掺入母本种子或外来杂种子，甚至一些不法商贩销售假冒种子。杂交种子的纯度和真实性是种子质量的重要指标，是决定甜瓜生产产量和品质的重要保障，关系到瓜农的切身利益。因此杂交种子在销售前必须进行纯度和真实性鉴定。传统鉴定依据品种某些特异农艺性状进行鉴别，较为费时费力，受季节限制，且易受环境因素影响。
杂交种子纯度和真实性的快速准确鉴定成为制种单位的迫切需求，也是规范种子市场的重要途径。ssr分子标记呈共显性遗传，对dna质量要求低，试验操作流程简单，可有效区分杂交种子的父本、母本和杂种子，谱带信息清晰明了，现已广泛应用于作物杂交种子纯度鉴定。在应用过程中，仅通过单个标记鉴定，准确度不足，易造成误判。将分布于不同染色体且条带大小具有明显差异的分子标记组合使用，能够对杂交种子纯度和真实性作出更准确的判断。
厚皮甜瓜品种“黄皮9818”由新疆农业科学院哈密瓜研究中心选育，具有生长势旺，抗病性较强，座果整齐一致，果实黄皮全网纹椭圆形，肉色橘红、肉质细脆甜，集外形美观和高品质于一身，在上海、海南、华北大面积推广种植并于2007年开始在美国加州商业化生产，成为我国第一个具有自主知识产权在国外种植成功的厚皮甜瓜品种。随着“黄皮9818”品种种植面积不断扩大，种子需求量和制种面积不断增加，种子真实性和纯度的高通量快速准确鉴定将有利于该品种的进一步推广种植。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于ssr分子标记对新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”杂交种纯度高通量鉴定的方法。
其具体技术方案为：
一种基于ssr分子标记对新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”杂交种纯度高通量鉴定的方法，包括以下步骤：
步骤1.dna提取：采用碱裂解法，将待检测种子在30℃培养箱中保湿催芽24-36小时，取约2cm下胚轴置于96孔pcr板中，加入50ulbuffera溶液(100mmnaoh+2％tween20)，盖上硅胶盖置于pcr仪中95℃热浴10分钟，打开硅胶盖，加入50ulbufferb溶液(100mmtris-hcl+2mmedta)，盖上硅胶盖上下颠倒10次混匀，置于be-6100微孔板迷你离心机中瞬时离心，上清液即可用于pcr扩增。
步骤2.pcr扩增：pcr单管反应总体系为10ul，2*easytaqpcrsupermixforpage(北京全式金生物技术有限公司)5ul，forwardprimer和reverseprimer各0.25ul(引物信息如表1所示)，ddh2o3.5ul，dna模板1ul。pcr扩增程序为94℃预变性5min；27个扩增循环，94℃变性30s，57℃30s，72℃30s；72℃10min；4℃保存。采用表1中组合1引物进行鉴定时，cmttcn273和ecm206进行双重pcr扩增，cmbr007和cmagan268引物分别扩增；采用表1中组合2和组合3引物进行鉴定时，每对引物分别扩增。
步骤3.pcr扩增产物的混合：组合1：利用8道effendorf移液器分别取步骤2中cmttcn273和ecm206双重pcr产物4ul，cmbr007引物pcr产物3ul和cmagan268引物pcr产物6ul，置于一个新的96孔板中(同一待检测样品不同引物pcr扩增产物混为一个样品)，利用be-6100微孔板迷你离心机中瞬时离心混匀；组合2：利用8道effendorf移液器分别取cmbr064和cmbr109两对引物的pcr扩增产物各3ul，置于一个新的96孔板中(同一待检测样品不同引物pcr扩增产物混为一个样品)，利用be-6100微孔板迷你离心机中瞬时离心混匀；组合3：利用8道effendorf移液器分别取ecm78和ecm91两对引物的pcr扩增产物各3ul，置于一个新的96孔板中(同一待检测样品不同引物pcr扩增产物混为一个样品)，利用be-6100微孔板迷你离心机中瞬时离心混匀。
步骤4.pcr扩增产物的检测：将步骤3中混合后样品，每孔取6ul经8％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1*tbe，电压170v，电泳60min。电泳结束后采用银染法染色。将凝胶剥离出来置于固定液(100ml无水乙醇+5ml冰醋酸+895ml去离子水)中，摇床震荡10min；去离子水冲洗一遍，置于染色液(3gagno3+1l去离子水)中，摇床震荡10min；去离子水冲洗一遍，置于显影液(13gnaoh+995ml去离子水+5ml甲醛)，摇床震荡至凝胶变黄，条带显现后即倒掉显影液，加入去离子水清洗一遍，立即照相并统计带型。将检测样品与“黄皮9818”双亲带型进行比较，表现为双亲互补型的是“黄皮9818”杂交种；仅有亲本带型的为非杂交种；出现其它带型的为外来杂种子。
表1ssr引物信息
步骤5.杂交种纯度的计算：利用步骤4中的统计结果计算送检“黄皮9818”品种杂交种纯度。送检样品“黄皮9818”品种杂交种纯度(％)＝(总检测种子数-非杂交种数-外来杂种子数)/总检测种子数*100％。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明筛选获得了8对分布于不同染色体且条带大小具有明显差异的双亲互补型ssr引物，用于新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”品种杂交种纯度和真实性鉴定，并提供了“黄皮9818”杂交种纯度和真实性高通量鉴定的方法。本发明较传统鉴定方法简单快捷、准确高效，且成本低廉，不受季节限制。从dna提取至获得样品杂交种纯度，1名工作人员在4-5h内即可完成对(96*2)192个种子的检测，多名工作人员配合批量规模化操作，效率还可进一步提高。
附图说明：
图1为“黄皮9818”母本、父本和杂交种子的8对ssr标记扩增图谱；
图2为利用组合1对“黄皮9818”杂交种纯度和真实性的鉴定图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
dna提取。鉴定时采用碱裂解法，将抽取的待检测种子样品110粒在30℃培养箱中保湿催芽30小时，随机取96粒约2cm的下胚轴置于96孔pcr板中，加入50ulbuffera溶液(100mmnaoh+2％tween20)，盖上硅胶盖置于pcr仪中95℃热浴10分钟，打开硅胶盖，加入50ulbufferb溶液(100mmtris-hcl+2mmedta)，盖上硅胶盖上下颠倒10次混匀，置于be-6100微孔板迷你离心机中瞬时离心，上清液用于pcr扩增。“黄皮9818”母本、父本和杂交种分别取6粒种子下胚轴提取dna，利用q3000超微量分光光度计测定浓度后，等量混合6粒种子dna，用于呈共显性双亲互补型引物的筛选。
pcr扩增。pcr单管反应总体系为10ul，各组分分别为2*easytaqpcrsupermixforpage(北京全式金生物技术有限公司)5ul，forwardprimer和reverseprimer各0.25ul(引物信息如表1所示)，ddh2o3.5ul，dna模板1ul。利用组合1进行鉴定，取3个1.5ml离心管置于离心管板上，分别编号为1、2和3，每管加入350ulddh2o，再分别加入2*easytaqpcrsupermixforpage(北京全式金生物技术有限公司)500ul，向管1中加入cmttcn273和ecm206正向引物和反向引物各12.5ul；向管2中加入cmbr007正向引物和反向引物各25ul；向管3中加入cmagan268正向引物和反向引物各25ul。将3个离心管上下颠倒5次，瞬时离心备用。取3个96孔板分别编号1、2和3。向1号96孔板第一列每一孔分别加入112ul1号离心管中混合物，然后利用8道effendorf移液器分装至剩余11列每孔中，每孔9ul。同1号96孔板操作类似，将2号离心管和3号离心管中混合物分装至2号和3号96孔板中，每孔9ul。利用8道effendorf移液器吸取1ul样品dna加入到3个96孔板的对应孔中。pcr反应程序为94℃预变性5min；27个扩增循环，94℃30s，57℃30s，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存。
pcr扩增产物的混合。利用8道effendorf移液器分别取步骤2中cmttcn273和ecm206双重pcr产物4ul，cmbr007引物pcr产物3ul和cmagan268引物pcr产物6ul，置于一个新的96孔板中(同一待检测样品不同引物pcr扩增产物混为一个样品)，利用be-6100微孔板迷你离心机中瞬时离心混匀。
pcr扩增产物的检测。取6ulpcr扩增产物利用8％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离。电泳缓冲液为1*tbe，电压170v，电泳60min。电泳结束后采用银染法染色。将凝胶剥离出来置于固定液(100ml无水乙醇+5ml冰醋酸+895ml去离子水)中，摇床震荡10min；去离子水冲洗一遍，置于染色液(3gagno3+1l去离子水)中，摇床震荡10min；去离子水冲洗一遍，置于显影液(13gnaoh+995ml去离子水+5ml甲醛)，摇床震荡至凝胶变黄，条带显现后即倒掉显影液，加入去离子水清洗一遍，立即照相并统计带型。
数据统计分析。选择“黄皮9818”杂交种带型为其双亲互补带型的引物用于其杂交种纯度和真实性的鉴定。将检测样品与“黄皮9818”双亲带型进行比较，表现为双亲互补型的是“黄皮9818”杂交种；仅有亲本带型的为非杂交种；出现其它带型的为外来杂种子。杂交种纯度的计算：送检样品“黄皮9818”品种杂交种纯度(％)＝(总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂种子数)/总检测种子数*100％。
结果与分析。
1.从合成的200对引物中筛选获得8对在“黄皮9818”母本、父本和杂交种呈共显性双亲互补带型的引物，如图1所示，具体引物信息详见表1。根据pcr产物大小，可将8对引物初步分为3个组合，在实际应用过程中可根据需要进行调整，在保证电泳条带不重合的前提下重新组合。在试验中，仅发现cmttcn273和ecm206能够进行双重pcr，cmbr007和cmagan268，cmbr064和cmbr109，ecm78和ecm91在进行双重pcr或多重pcr时均不能正常扩增，在后期应用过程中可进一步尝试不同引物组合进行多重pcr，以进一步提高效率，降低成本。
2.利用表1中组合1进行“黄皮9818”品种杂交种纯度和真实性鉴定
利用表1中组合1引物对5家农户生产的“黄皮9818”杂交种各96粒样品进行pcr检测。结果见表2，1、3和5号农户生产的“黄皮9818”种子纯度为100％，2号农户生产的“黄皮9818”种子检测到一粒母本种子，纯度为99％，4号农户生产的“黄皮9818”种子中不仅检测到1粒母本种子，还检测到1粒杂种子，纯度为98％，如图2所示，样品中母本种子和杂种子用箭头进行了标识。与在吐鲁番基地对5家农户生产的“黄皮9818”种子纯度的传统鉴定结果(表3)相比较，鉴定结果基本一致。
表2利用组合1引物对5家制种户抽检样品“黄皮9818”品种杂交种纯度的鉴定
表3对5家制种户抽检样品“黄皮9818”品种杂交种纯度的传统鉴定
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围。
序列表
<110>新疆农业科学院哈密瓜研究中心
<120>一种基于ssr分子标记对新疆厚皮甜瓜“黄皮9818”杂交种纯度高通量鉴定的方法
<160>16
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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<213>人工序列(artificialsequence)
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