本发明涉及一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。
背景技术：
几丁寡糖是由n-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的低聚合度水溶性甲壳低聚糖，是几丁质经水解生成的一类低聚物。与几丁质相比，几丁寡糖具有更高的水溶性，很容易被吸收利用，它们不仅具有几丁质的部分相似性质，而且一些功能性质更加显著。据报道，几丁寡糖具有抗菌活性、抗肿瘤活性、抵抗细菌侵染的防御能力、降低胆固醇的能力和促进钙吸收的能力、促进双歧杆菌增殖及强的吸湿保湿性能等性质，因此几丁寡糖在食品、医药、农业、日化用品等领域均具有广泛应用。目前，几丁寡糖的合成主要通过化学降解法和酶降解法，但前者需利用强酸或者强氧化剂处理，环境污染较为严重，而后者需要利用虾壳蟹壳为原料制备几丁质底物，易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
微生物细胞中存在着可能是最大数量的天然糖供体，利用微生物进行寡糖的生物合成，可直接或间接的利用天然糖供体进行目的寡糖的规模合成，使得许多天然或非天然的功能性寡糖的应用成为可能。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级几丁寡糖的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径调控严密，且没有几丁寡糖合成关键基因，并不会形成几丁寡糖的积累。如何改造枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径，供需前体物质，以及建立几丁寡糖代谢途径是一个值得深入探讨的问题。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种积累几丁寡糖的重组枯草芽孢杆菌，是将百脉根根瘤菌来源的n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因(nodc)克隆到表达载体pp43nmk，然后转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)，通过改造代谢途径，实现几丁寡糖的积累。
在本发明的一种实施方式中，所述n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶的基因如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，采用载体pp43nmk表达n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶nodc。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：
1)构建重组质粒：克隆百脉根根瘤菌来源的n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodc，连接到重组表达质粒上；
2)构建产几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌：将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌，得到产几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为bacillussubtilis168；所述重组表达载体为pp43nmk。
本发明的第三个目的是提供一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产几丁寡糖的方法，是应用所述积累几丁寡糖的重组枯草芽孢杆菌进行发酵，于35～37℃、200～220rpm下培养10～16h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于35～37℃、180～220rpm条件下发酵36～54h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是应用所述积累几丁寡糖的重组枯草芽孢杆菌进行发酵，于37℃、220rpm下培养10～16h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下发酵36～54h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基按g/l计含有：葡萄糖60，蛋白胨6，硫酸铵6，酵母粉12，木糖5，k2hpo4·3h2o12.5，kh2po42.5，mgso4·7h2o3，及微量元素10ml/l。
本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在制备含有几丁寡糖的产品方面的应用。
有益效果：本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现几丁寡糖在胞外积累，其浓度可达到136mg/l，其中，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为8mg/l，28mg/l和100mg/l，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产几丁寡糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
种子培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖60，蛋白胨6，硫酸铵6，酵母粉12，木糖5，k2hpo4·3h2o12.5，kh2po42.5，mgso4·7h2o3,微量元素10ml/l。
微量元素溶液(g/l)：mnso4·5h2o1.0，cocl2·6h2o0.4，namoo4·2h2o0.2，znso4·7h2o0.2，alcl3·6h2o0.1，cucl2·h2o0.1，h3bo40.05，含5mhcl。
培养条件：将37℃、220rpm下培养10h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养48h。
几丁寡糖的测定方法：
高效液相色谱(hplc)检测法：agilent1200，uv检测器，nh2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速1ml/min，柱温35℃，进样体积为10μl。
实施例1重组质粒的构建
根据ncbi上公布的百脉根根瘤菌(mesorhizobiumloti，genbank：maff303099)中的n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodc，通过密码子优化，基因合成seqidno.2所示的序列，设计引物：nodc-f:5’-
ataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgggcaaaaactacaagctctg-3’，
nodc-r:5’-acgatgtagatgttagacatgtgtacattcctctcttaccccgggttatgaaagtgcttcaaactgttgcc-3’，使用上述引物，以合成n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodc为模板扩增nodc基因片段，质粒pp43nmk经kpni和hindiii双酶切线性化后与以上扩增基因片段通过gibsonassemblyclongingkit(newenglandbiolabs)连接，构建重组质粒，双酶切验证及测序，确认重组质粒pp43nmk-nodc构建成功。
实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建
将构建好的表达载体pp43nmk-nodc转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168)。采用nodc-f及gna1-r引物挑选转化子进行菌落pcr，出现1200bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
实施例3发酵生产几丁寡糖
将37℃、220rpm下培养10h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养48h。最终发酵上清液中几丁寡糖浓度可达到136mg/l，其中，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为8mg/l，28mg/l和100mg/l。过表达n-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodc，实现了几丁寡糖在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
sequencelisting
<110>江南大学
<120>一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>424
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
metasnleuphealaseralaserthrvalalailecyssertyrala
151015
leuleuserthrvaltyrlysthralaglnvalphetyrthrleupro
202530
thrasnvalproprothrserglyaspproproserglygluprotrp
354045
proservalaspvalileileprocystyrasnglualaproargthr
505560
leuseraspcysleualaserilealaserglnasptyralaglylys
65707580
leuglnvaltyrvalvalaspaspglyseralaasnargaspalaleu
859095
valglyvalhisgluglutyralaglyaspproargpheasnpheval
100105110
alaleuprolysasnvalglylysarglysalaglnilealaalaile
115120125
argargsercysglyaspleuvalleuasnvalaspseraspthrile
130135140
leualaproaspvalilethrargleualaleulysmetglnaspgln
145150155160
alavalglyalaalametglyglnleualaalaserasnargserglu
165170175
thrtrpleuthrargleuileaspmetglutyrtrpleualacysasn
180185190
glugluargalaalaglnalaargpheglyalavalmetcyscyscys
195200205
glyprocysalamettyrargargseralaleuvalserleuleuasp
210215220
glntyrgluthrglnargpheargglylysproserasppheglyglu
225230235240
asparghisleuthrileleumetleulysalaglypheargthrglu
245250255
tyrvalproglualavalalaalathrvalvalproasnsermetgly
260265270
protyrleuargglnglnleuargtrpalaargserthrpheargasp
275280285
thrleuleualapheglnleuleuargglyleuasniletyrleuthr
290295300
leuaspvalileglyglnasnileglyproleuleuleuserleuser
305310315320
ileleualaglyleualaglnphevalthrthrglythrvalprotrp
325330335
thralacysleumetilealaalametthrilevalargcysserval
340345350
alaalapheargalaargglnleuargpheleuglypheserleuhis
355360365
thrleuileasnilepheleuleuleuproleulysalatyralaleu
370375380
cysthrleuserasnserasptrpleuserargserseralaalaasn
385390395400
valglnaspthrglyaspalaleuprolysproasnleuvalglyser
405410415
aspalaalatyrsergluglngln
420
<210>2
<211>1275
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
atgaacctgtttgcgagcgcgagcacggtggcgatttgcagctacgcattactgagcaca60
gtttacaaaacggcgcaagttttttacacgctgccgaccaacgtgccgccgacgagcgga120
gatcctccgagtggagaaccgtggccgtctgttgatgttattattccgtgctataatgag180
gcgccgagaacattatcagattgcctggcttcaattgcaagtcaagattacgcaggcaag240
ctccaagtttatgtggttgatgatggctctgcaaatcgcgacgcactggtgggcgtgcat300
gaagaatacgcgggcgatccgcgctttaattttgtagcattaccgaaaaatgtgggaaaa360
agaaaagcacaaatcgcagcaattcgcagatcatgcggagatcttgttctgaatgttgat420
agcgatacaattctggcacctgatgtgattacaagactggcactgaaaatgcaagatcaa480
gcagttggcgcggcaatgggccaactggcggcgagtaatagatctgaaacgtggctgaca540
agactgattgatatggaatattggctggcatgcaacgaagaaagagcagcacaagcaaga600
tttggagcagtaatgtgttgctgtggaccgtgcgcaatgtacagaagaagcgctctggtg660
agcctgctggatcaatatgagactcaaagattcagaggaaaaccgtcagattttggcgag720
gatagacatctgacgattctgatgcttaaagcaggctttagaacagaatatgttccggaa780
gctgttgcagcaacagtagttccgaattcaatggggccgtatcttcggcagcaattaagg840
tgggcaagatcaacatttagggatacattactggcgtttcaactgcttagaggcctgaat900
atttatctgaccctggatgttattggtcaaaatattggccctcttcttctcagcttatct960
attctggcgggcctggcacaatttgttacaacaggcacagttccttggacagcttgctta1020
atgattgcagcaatgacaattgtgagatgctcagttgcagcttttagagcacggcaactg1080
agatttctgggcttttcactgcatacactcattaatattttcctgctgttgcctctgaaa1140
gcgtatgcactgtgcacattgtcaaacagcgattggttgagtcgctcatcagcagcaaat1200
gttcaagatacgggcgatgcactgccgaagccgaacttggttggctcagatgcagcatat1260
tccgaacaacaataa1275
<210>3
<211>68
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
ataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgggcaaaaactac60
aagctctg68
<210>4
<211>71
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
acgatgtagatgttagacatgtgtacattcctctcttaccccgggttatgaaagtgcttc60
aaactgttgcc71