本发明属于基因工程及微生物发酵技术领域，具体涉及通过导入异源甘氨酸转氨酶，构建非天然的新型5-氨基乙酰丙酸生产途径的方法。
背景技术：
：
5一氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinicacid，简称5-ala)，是生物体合成叶绿素、血红素、维生素b12等必不可少的物质。5-ala在农业、医药及有机合成中都有重要应用。研究表明，5-ala调节叶绿素的合成，提高光合作用效率及促进植物组织分化的生理功能，可以作为农业中植物生长调节剂，此外还可以作为除草剂及杀虫剂，且具有生物降解性，又不引起害虫产生抗药性，是一种新型绿色农药。而由于5-ala的市场售价较高，应用成本大，一时还难以直接应用。在医学上，5-ala可以作为一种新型光动力药物，不仅用于局部或全身的皮肤癌的治疗，还可用于膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断。同时还可用于各种皮肤病及类风湿关节炎等疾病的治疗。
5-ala早期以化学合成为主，原料可以是马尿酸、琥珀酸、四氢糠胺及乙酰丙酸等，但是大部分化学方法具有原料成本高，反应条件要求苛刻，反应溶剂毒性高及收率低等缺点。
近年来，随着合成生物学技术的发展，生物法合成5-ala逐渐替代的传统化学法路线，成为研究的重点。生物合成5-ala目前研究较多时c4途径，即利用三羧酸循环中的丁二酰辅酶a和甘氨酸经5-ala合成酶的作用生成5-ala，外源添加丁二酸及甘氨酸都对ala产量有明显提升。目前基因工程改造方面的研究都集中在对原有5-ala的合成途径，即原料丁二酰辅酶a、甘氨酸的生产途径优化上，尚未有新的5-ala合成途径报道。在原料供给方面，甘氨酸作为5-ala合成的原料之一，其合成途径较长，难以调控强化，而且在甘氨酸合成途径会生成一分子的5,10-亚甲基四氢叶酸，在损失碳源的同时也造成代谢调控的负担。目前多数研究仍以外源添加甘氨酸为原料供给，少数关于甘氨酸供给的调控也未发挥明显作用。
技术实现要素：
：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种通过导入异源甘氨酸转氨酶构建新型5-氨基乙酰丙酸合成途径的方法，从而实现由葡萄糖到5-ala的高效转化，解决目前c4生产途径中外源添加甘氨酸的问题，并且避免了原c4途径中生成甘氨酸损失的一分子碳。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一，是提供一株生产5-ala的基因工程菌，该菌株包含5-ala合成酶基因hema，乙醛酸转氨酶基因，以及增强表达的异柠檬酸裂解酶基因acea基因。
所述的乙醛酸转氨酶为以乙醛酸为氨基受体，其他氨基酸为氨基供体的转氨酶，包括但不限于丙氨酸-乙醛酸转氨酶、谷氨酸-乙醛酸转氨酶、谷胺酰胺-乙醛酸转氨酶，以及可能的丙酮酸-甘氨酸转氨酶、酮戊二酸-甘氨酸转氨酶；
所述的乙醛酸转氨酶来源于人、高等动物、植物、真菌或古细菌；
优选地，所述乙醛酸转氨酶基因为来自人体的丙氨酸-乙醛酸转氨酶编码基因agxt基因；
所述增强表达的方式可以是表达外源的acea基因，也可以是过表达宿主中的本底acea基因，或者敲除宿主中抑制acea基因表达的基因；
所述抑制acea基因表达的基因为iclr基因或acra基因；
所述基因工程菌的宿主包括但不限于大肠杆菌(escherichiacoli)、球形红细菌(rhodobactersphaeroides)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)；
优选地，所述宿主为大肠杆菌；
更优选地，所述宿主为大肠杆菌e.colibl21star(de3)；
优选地，所述hema基因的表达载体为petduet-1；
优选地，所述外源acea基因的表达载体为prsfduet-1；
优选地，所述agxt基因的表达载体为prsfduet-1；
所述hema基因的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示；
所述agxt基因的核苷酸序列如序列表seqidno.2所示；
所述acea基因的核苷酸序列如序列表seqidno.3所示。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二，是提供一种采用上述基因工程菌生产5-ala的方法，具体如下：
将经过种子培养的上述基因工程菌，以0.5％-1％体积比接种量接种到发酵培养基，37℃，300-800r/min培养，待菌体od达到0.5-0.6时，添加0.1-0.5mmiptg诱导基因表达，调节温度至30℃，用25％氨水调节ph使之维持在6.8-7.2，补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/l，发酵时间16-24h。
发酵培养基组成：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母粉5g/l，卡那霉素50μg/ml，氨苄霉素100μg/ml，ph7.0。
有益效果：
1、本发明提供的基因工程菌带有5-ala合成酶基因(hema)，导入了甘氨酸转氨酶基因(agxt)及异柠檬酸裂解酶基因(acea)，提供了一种5-ala新型合成途径，并提高了发酵生产5-ala产量。异柠檬酸裂解酶(acea)激活生产菌株中的乙醛酸循环，使异柠檬酸裂解得到乙醛酸和ala合成的原料之一丁二酸，乙醛酸在外源导入的甘氨酸转氨酶(agxt)作用下生成另一生产5-ala原料——甘氨酸，继而生成5-ala(合成途径见图1)。这一途径解决了传统5-ala生物合成途径-c4途径中，甘氨酸合成途径难以调控，需要外源添加的问题，并且避免了原c4途径中生成甘氨酸损失的一分子碳。为5-ala的生物合成提供更为有效、经济的途径开辟了新思路。
2、采用本发明提供的基因工程菌生产5-ala发酵液产量达到520-550mg/l，较c4途径产量提高38％左右。
附图说明：
图1新型5-氨基乙酰丙酸生产途径；
图2实施例4发酵过程曲线。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。
ala分析方法：采用分光光度法：将标准试剂或样品10μl，加入190μl的0.5m乙酸钠溶液，10μl的乙酰丙酮，加热煮沸15min。冷却加入200μl的改良ehrlich’s试剂，反应10min，检测554nm下吸光度。
以下实施例所使用培养基：
lb固体培养基(g/l)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，琼脂15，ph7.0；
发酵培养基(g/l)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，ph7.0。
以下实施例生产5-ala所使用培养条件：
种子培养：100ml摇瓶中加入15ml发酵培养基，对于含有表达载体petduet-1的菌种加入氨苄霉素(100μg/ml)，对于含有表达载体prsfduet-1的菌株加入加入卡那霉素(50μg/ml)，对于同时含有两种表达载体的菌株同时加入两种抗生素。接入100μl保存的甘油菌液，37℃，220r/min培养8小时。
发酵培养：向1.5l发酵罐中加入500ml发酵培养基，根据转入质粒的抗性添加卡那霉素(50μg/ml)或氨苄霉素(100μg/ml)，以0.5％-1％体积比接种量接种到发酵培养基，37℃，300-800r/min培养，待菌体od达到0.5-0.6时，添加0.1-0.5mmiptg诱导基因表达，调节温度至30℃，用25％氨水调节ph使之维持在6.8-7.2，补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/l，发酵时间16-24h。
实施例1：5-ala生物合成新途径的体外验证
①将不同来源的乙醛酸转氨酶分别连接到表达载体pet21a上，构建重组表达载体，分别为：人(homosapiens)来源的丙氨酸-乙醛酸转氨酶pet21a-agxt；酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)来源的丙氨酸-乙醛酸转氨酶pet21a-scta；甲基生丝微菌(hyphomicrobiummethylovorum)来源的丙氨酸-乙醛酸转氨酶pet21a-hmta；
②构建异柠檬酸裂解酶基因表达载体pet21a-acea；
③构建丁二酰辅酶a合成酶表达载体pet22b-succd；
④构建5-ala合成酶表达载体pet22b-hema。
将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主e.colibl21star(de3)中，37℃发酵培养至od达到0.5-0.6时，添加0.1mmiptg诱导基因表达，30℃继续培养10h后收集菌体，超声破碎后取上清，分别得到乙醛酸转氨酶(3种)、异柠檬酸裂解酶、丁二酰辅酶a合成酶及5-ala合成酶破菌液，备用。
向总体积为1mlph为6.5的tris·hcl缓冲液中加入终浓度为10mm的异柠檬酸，10mm丙氨酸，10mmatp，3mm乙酰辅酶a，1mm磷酸吡哆醛(plp),1mm氯化镁，加入上述步骤获得的异柠檬酸裂解酶、乙醛酸转氨酶(3种来源分3组添加)、丁二酰辅酶a合成酶及5-ala合成酶破菌液各150μl，30℃下震荡反应6h，检测其5-ala浓度，计算转化率。
其中来源于人的乙醛酸转氨酶重组表达载体pet21a-agxt的表达产物与异柠檬酸裂解酶、丁二酰辅酶a合成酶及5-ala合成酶的组合对合成5-ala的转化率最高可达91％，pet21a-scta和pet21a-hmta的转化率分别为85％和78％。这证明了确实可以通过新途径(图1)将异柠檬酸转化为5-ala。后续选择来源于人的乙醛酸转氨酶作为继续研究对象。
实施例2：含有5-ala合成酶基因、乙醛酸转氨酶基因及异柠檬酸裂解酶基因的质粒构建
(1)基因合成与扩增：将来源于球形红细菌(rhodobactersphaeroides)的5-ala合成酶基因hema(seqidno.1所示)与乙醛酸转氨酶基因agxt(seqidno.2所示)分别送与南京金斯瑞生物公司合成，获得质粒puc-hema与puc-agxt。用引物acea-if与acea-ir从大肠杆菌mg1655中扩增出异柠檬酸裂解酶基因acea备用。
(2)质粒petduet-1-hema的构建：用引物acycduet-vecf与duetdown1从质粒petduet-1中扩增出载体片段(backbone)，用引物duetup2与t7terminator从质粒puc-hema中扩增出插入片段(in-hema)，将两个片段纯化回收后通过吉布森组装(gibsonassembly)的方式连接。连接产物转化至大肠杆菌top10感受态中，次日挑选菌株测序验证，正确的克隆命名为top10(petduet-1-hema)。
(3)质粒prsfduet-agxt-acea的构建：用引物acycduet-vecf与acycduet-vecr从质粒prsfduet-1中扩增出载体片段(backbone)，用引物rs-hema-01f与rsf-agxt-r从质粒puc-agxt中扩增出插入片段(in-agxt)。将三个片段(backbone，acea和in-agxt)纯化回收后通过吉布森组装(gibsonassembly)的方式连接。连接产物转化至大肠杆菌top10感受态中，次日挑选菌株测序验证，正确的克隆命名为top10(prsfduet-agxt-acea)。
所用引物序列如下：
实施例3：含有5-ala生物合成新途径重组菌株的构建
向20mllb培养基中接入大肠杆菌e.colibl21star(de3)保存甘油菌种100μl，37℃，220r/min培养5小时至od值到达0.5，取2ml菌液离心，弃去上清，菌体沉淀用0.1m氯化钙重旋洗涤，离心后弃去上清，重复洗涤一遍，菌体沉淀用0.1m氯化钙重旋，获得e.colibl21star(de3)菌体感受态细胞。
分别从实施例2获得的top10(petduet-1-hema)和top10(prsfduet-agxt-acea)中提取质粒petduet-1-hema和质粒prsfduet-1-agxt-acea。
向e.colibl21star(de3)菌体感受态细胞加入2μlpetduet-1-hema质粒，冰上静置30分钟，42℃度水浴放置90秒，再放置在冰上5分钟，加入800μllb培养基，37℃培养1小时，取200μl均匀涂在带有氨苄霉素(100μg/ml)的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落培养获得对照组菌株，记为hema。
向e.colibl21star(de3)菌体感受态细胞加入5μlpetduet-1-hema质粒及5μlprsfduet-1-agxt-acea质粒，冰上静置30分钟，42℃度水浴放置90秒，再放置在冰上5分钟，加入800μllb培养基，37℃培养1小时，取200μl均匀涂在带有氨苄霉素(100μg/ml)及卡那霉素(50μg/ml)的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落培养获得实验组菌株，记为hema/agxt-acea。
实施例4：5-ala生物合成新途径重组菌株的发酵验证
将对照组菌株hema和实验组菌株hema/agxt-acea按前述方法进行发酵培养：
种子培养：100ml摇瓶中加入15ml发酵培养基，对于含有表达载体petduet-1的菌种加入氨苄霉素(100μg/ml)，对于含有表达载体prsfduet-1的菌株加入加入卡那霉素(50μg/ml)，对于同时含有两种表达载体的菌株同时加入两种抗生素。接入100μl保存的甘油菌液，37℃，220r/min培养8小时。
发酵培养：向1.5l发酵罐中加入500ml发酵培养基，据转入质粒的抗性添加卡那霉素(50μg/ml)和/或氨苄霉素(100μg/ml)，以0.5％体积比接种量接种到发酵培养基，37℃，400r/min培养，待菌体od达到0.5-0.6时，添加0.1mmiptg诱导基因表达，调节温度至30℃，用25％氨水调节ph使之维持在7.0，补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/l，发酵24h记录发酵过程曲线。
发酵培养基(g/l)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，ph7.0。
结果显示(见图2)，导入新合成途径的实验组菌株hema/agxt-acea发酵18小时ala产量可达521±4mg/l,较对照组hema(378±3mg/l)有明显提高，产量提高了38％。需要说明的是，由于宿主菌中存在5-ala水合酶(hemb)，会消耗生产的5-ala，因而在发酵中后期，发酵液中5-ala含量开始降低。
实施例55-ala生物合成新途径重组菌株的发酵方法
将实施例3所得实验组菌株hema/agxt-acea按前述方法进行发酵培养：
种子培养：100ml摇瓶中加入15ml发酵培养基，对于含有表达载体petduet-1的菌种加入氨苄霉素(100μg/ml)，对于含有表达载体prsfduet-1的菌株加入加入卡那霉素(50μg/ml)，对于同时含有两种表达载体的菌株同时加入两种抗生素。接入100μl保存的甘油菌液，37℃，220r/min培养8小时。
发酵培养：向1.5l发酵罐中加入500ml发酵培养基(发酵培养基组成：蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，酵母粉5g/l，卡那霉素50μg/ml，氨苄霉素100μg/ml，ph7.0)，以1.0％体积比接种量将种子液接种到发酵培养基，37℃，800r/min培养，待菌体od达到0.5-0.6时，添加0.5mmiptg诱导基因表达，调节温度至30℃，用25％氨水调节ph使之维持在6.8，补加葡萄糖使终浓度维持在5-10g/l，发酵16h，发酵液中ala产量可达550mg/l。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110>北京化工大学
<120>一种乙醛酸转氨酶介导的5-氨基乙酰丙酸生物合成途径
<130>1
<141>2018-04-13
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1224
<212>dna
<213>球形红细菌(rhodobactersphaeroides)
<400>1
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