本发明涉及丁酸梭菌发酵工艺技术领域，具体涉及一种高产芽孢态丁酸梭菌的多级发酵生产方法。
背景技术：
丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)，即丁酸梭状芽孢杆菌，又名酪酸菌，是梭状芽孢菌属中的一个种，存在于奶酪、天然酸奶、人与动物的肠道及粪便等中。丁酸梭菌是一种直的或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，是一株已被研究认可的益生菌，在临床医学和畜牧业方面广泛应用于整肠药物、保健食品、饲料添加剂和微生物肥料等，是一种较理想的具有广泛开发应用前景的微生态制剂。丁酸梭菌通过动物肠道时，能耐胃酸及胆汁酸盐，很好地保证了其性能的发挥，主要作用是在动物后肠道(如盲肠和结肠)将碳水化合物按糖酵解途径生产丙酮酸，再由丙酮酸合成丁酸。丁酸梭菌的主要作用如下：(1)促进肠道内有益菌群(双歧杆菌、乳酸菌、粪杆菌等)的增殖和发育，抑制肠道内葡萄球菌、念珠菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌等有害菌和腐败菌的生长繁殖，减少胺类、吲哚类物质的产生，而丁酸梭菌本身由于不能分解蛋白质，会减少氨、吲哚、硫化氢等有害物质的产生；(2)在肠道内产生维生素b族、维生素k、淀粉酶，有良好的保健作用；(3)丁酸梭菌的代谢物丁酸是肠上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质；(4)对多种抗生素有较强的耐受性，与抗生素并用时不会影响其生物作用，并能大幅度降低伪膜性肠炎的发病率；(5)丁酸梭菌是厌氧梭状芽孢杆菌，在体内不受胃酸、消化酶、胆汁酸等影响其生物作用，在体外室温下能长期保存；(6)丁酸梭菌是人体和动物肠道内正常菌群之一，在肠道内阻止有害菌的定植和入侵、纠正肠道内菌群紊乱。益生菌类微生态制剂在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善环境等方面的积极作用已经得到了公认，但是目前真正符合生产要求的高质量微生态制剂产品还很少。
丁酸梭菌由于生物学特性，在临床上具有非常显著的治疗应用前景，而且因其具有芽孢形态，有较高的实用价值。直接将丁酸梭菌及丁酸盐的复合物作为人和动物的益生菌产品，用于调理胃肠，已经被广泛接纳了。如何通过高密度液体厌氧发酵丁酸梭菌及丁酸盐复合物、提升产品使用效果、降低生产成本，具有显著的经济利益和社会效益。现有的丁酸梭菌厌氧发酵工艺存在以下缺陷：(1)厌氧条件不充分，容易残留少量氧气；(2)发酵过程的缺乏补料工艺；(3)得到发酵菌数为10-15×108cfu/ml的菌液；(4)培养物是以芽孢形成率为成熟指标，而不是以更能反映产品质量的菌粉中活芽孢数及丁酸盐含量为成熟指标，影响产品的质量。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高产芽孢态丁酸梭菌的多级发酵生产方法，遵循严格的厌氧发酵工艺，促进丁酸梭菌繁殖，显著提高菌液菌数，大大降低芽孢在烘干过程中的死亡率，降低生产成本，具有显著的经济效益。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种高产芽孢态丁酸梭菌的多级发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)配制种子培养基，使用氢氧化钠溶液调节ph至7.0-7.2，表面覆盖2-3cm液体石蜡，121℃、20min灭菌，冷却至室温，接种1％的丁酸梭菌菌液，密封放入培养箱37℃培养24h，80℃水浴保持10min，制得一级种子液培养；
(2)种子罐空消操作后，加入种子培养基，使用氢氧化钠溶液调节ph至7.0-7.2，表面覆盖2-3cm液体石蜡，121℃、20min灭菌，冷却至38℃以下，接种1％的一级种子液，37℃培养14-24h，加热蒸汽夹套，80℃保温10min，制得二级种子液；
(3)配制发酵培养基，使用氢氧化钠溶液调节ph至7.5-8.0，发酵罐空消操作后，安装ph电极并校准，加入并溶解发酵培养基，121℃、20min灭菌后，向发酵罐内通入高纯氮气后，搅拌并降温至发酵罐内温度低于38℃，密封发酵罐并通过补充氮气保持发酵罐内正压，全程搅拌，开启移种管道阀门，排空移种管道内空气，接种0.5-2％的二级种子液，37℃发酵18-24h，加热蒸汽夹套，80℃保温10min，完成一级发酵；
(4)使用高纯氮气将步骤(3)的发酵菌液压至空消操作后的二级发酵罐中，30-37℃控温发酵，控制ph值，当发酵菌液开始产气后，补料葡萄糖，全程搅拌，发酵18-28h，放罐，结束发酵培养；
(5)粗粉碎农作物制得吸附剂，将吸附剂与步骤(4)的发酵菌液混合均匀，干燥后进行细粉碎，制成菌粉，流化床烘干菌粉。
进一步的，所述氢氧化钠溶液的质量分数是10-20％。
进一步的，所述步骤(4)中控制ph值的操作过程是：将碳酸钠溶于蒸馏水中制得质量分数为10-20％的碳酸钠溶液，121℃、20min灭菌，使用高纯氮气排空管道空气，向二级发酵罐中流加碳酸钠溶液，控制二级发酵罐中发酵菌液的ph值为7.0-8.0。
进一步的，所述步骤(4)中补料葡萄糖的操作过程是：向空消操作后的种子罐中加入发酵培养基，再加入葡萄糖并溶解，115℃、20min灭菌后制得补料培养基，当二级发酵罐中的发酵菌液开始产气后，高纯氮气排空管道空气，以0.05l/min的流速补充补料培养基至二级发酵罐中，补料时间为10-12h。
进一步的，所述步骤(3)和步骤(4)中全程搅拌的搅拌速度为100r/min。
进一步的，所述农作物为玉米胚芽粕，所述步骤(4)的发酵菌液与吸附剂的料液比(ml/g)为1:5-6。
进一步的，所述流化床的进风温度为50-70℃，所述流化床的出风温度为30-50℃。
由于采用上述的技术方案，本发明的有益如下：
本发明采用严格的厌氧发酵工艺，促进丁酸梭菌的繁殖，明显提高菌液菌数50％，一级发酵和二级发酵全程控制100r/min的搅拌速度，严格氮气保护，开启搅拌，排除溶氧风险，二级发酵培养时补料葡萄糖，提供充足的碳源，促进菌种繁殖，提高菌数20-30％，最终菌液菌数达到25-30亿/ml，远大于现有技术中的10-15亿/ml，并且增加发酵菌液中丁酸盐含量60-80％，发酵菌液中丁酸盐含量为160-180μmol/ml。本发明采用农作物玉米胚芽粕制得吸附剂，制得的的吸附剂质量轻、吸水性好，采用1:5-6的低吸附比吸附菌液中芽孢，菌粉菌数达到2-3亿/g，可以很大程度降低芽孢在烘干过程中的死亡率，极大地降低生产成本，提高产品的质量。本发明发酵制得的丁酸梭菌及其产物丁酸盐的复合物能够应用到饲料添加剂中，降低成本，具有显著的经济效益。
附图说明
图1是实施例1发酵结束时的镜检照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种高产芽孢态丁酸梭菌的多级发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)配制300ml种子培养基，种子培养基为每1000ml蒸馏水中含有酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、0.5％美蓝0.2ml，使用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节种子培养基的ph至7.1，表面覆盖2cm液体石蜡，121℃、20min灭菌，冷却至室温，接种1％(相对于种子培养基)的丁酸梭菌菌液，密封放入培养箱37℃培养24h，80℃水浴保持10min，制得一级种子液培养；
(2)50l种子罐空消操作后，加入35l种子培养基，使用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节ph至7.1，表面覆盖2cm液体石蜡，121℃、20min灭菌，冷却至35℃，接种1％(相对于种子培养基)的一级种子液，37℃培养16h，加热蒸汽夹套，80℃保温10min，制得二级种子液；
(3)配制发酵培养基，发酵培养基：每100ml蒸馏水中含有糖蜜3g，豆粕粉5g，硫酸铵0.1g，na2co30.1g，玉米粉2g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.2g，kh2po40.1g，mgso4·7h2o0.02g，cacl20.01g，泡敌0.1g，使用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节ph至7.6，2t的发酵罐空消操作后，安装ph电极并校准，加入并溶解1400l发酵培养基，121℃、20min灭菌后，向2t的发酵罐内通入高纯氮气后，搅拌并降温至发酵罐内温度至35℃，密封发酵罐并通过补充氮气保持发酵罐内正压，全程搅拌，搅拌速度为100r/min，开启移种管道阀门，排空移种管道内空气，接种1％(相对于发酵培养基)的二级种子液，37℃发酵24h，加热蒸汽夹套，80℃保温10min，完成一级发酵；
(4)使用高纯氮气将步骤(3)的发酵菌液压至空消操作后的60t的二级发酵罐中，35℃控温发酵，将碳酸钠溶于蒸馏水中制得质量分数为10％的碳酸钠溶液，121℃、20min灭菌，使用高纯氮气排空管道空气，向60t的二级发酵罐中流加碳酸钠溶液，控制60t的二级发酵罐中发酵菌液的ph值为7.5，发酵3h后，发酵菌液开始产气，高纯氮气排空管道空气，以0.05l/min的流速向二级发酵罐中加入补料培养基，补料培养基的加入时间为12h，全程搅拌，搅拌速度为100r/min，总共发酵28h，放罐，结束发酵培养，补料培养基的制备：向空消操作后的50l的种子罐中加入1.4t发酵培养基，再加入20kg葡萄糖并溶解，115℃、20min灭菌后制得补料培养基；
(5)粗粉碎玉米胚芽粕制得吸附剂，将玉米胚芽粕吸附剂与步骤(4)的发酵菌液混合均匀，步骤(4)的发酵菌液与玉米胚芽粕吸附剂的料液比(ml/g)为1:6，干燥后进行细粉碎，制成菌粉，流化床烘干菌粉，流化床的进风温度为60℃，流化床的出风温度为35℃。
实施例2：
一种高产芽孢态丁酸梭菌的多级发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)配制300ml种子培养基，种子培养基为每1000ml蒸馏水中含有酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、0.5％美蓝0.2ml，使用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节种子培养基的ph至7.1，表面覆盖3cm液体石蜡，121℃、20min灭菌，冷却至室温，接种1％(相对于种子培养基)的丁酸梭菌菌液，密封放入培养箱37℃培养24h，80℃水浴保持10min，制得一级种子液培养；
(2)50l种子罐空消操作后，加入35l种子培养基，使用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节ph至7.1，表面覆盖3cm液体石蜡，121℃、20min灭菌，冷却至35℃，接种1％(相对于种子培养基)的一级种子液，37℃培养18h，加热蒸汽夹套，80℃保温10min，制得二级种子液；
(3)配制发酵培养基，发酵培养基：每100ml蒸馏水中含有糖蜜3g，豆粕粉5g，硫酸铵0.1g，na2co30.1g，玉米粉2g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.2g，kh2po40.1g，mgso4·7h2o0.02g，cacl20.01g，泡敌0.1g，使用质量分数为10％的氢氧化钠溶液调节ph至7.6，2t的发酵罐空消操作后，安装ph电极并校准，加入并溶解1400l发酵培养基，121℃、20min灭菌后，向2t的发酵罐内通入高纯氮气后，搅拌并降温至发酵罐内温度至35℃，密封发酵罐并通过补充氮气保持发酵罐内正压，全程搅拌，搅拌速度为100r/min，开启移种管道阀门，排空移种管道内空气，接种1％(相对于发酵培养基)的二级种子液，37℃发酵18h，加热蒸汽夹套，80℃保温10min，完成一级发酵；
(4)使用高纯氮气将步骤(3)的发酵菌液压至空消操作后的60t的二级发酵罐中，35℃控温发酵，将碳酸钠溶于蒸馏水中制得质量分数为15％的碳酸钠溶液，121℃、20min灭菌，使用高纯氮气排空管道空气，向60t的二级发酵罐中流加碳酸钠溶液，控制60t的二级发酵罐中发酵菌液的ph值为7.5，发酵3h后，发酵菌液开始产气，高纯氮气排空管道空气，以0.05l/min的流速向二级发酵罐中加入补料培养基，补料培养基的加入时间为10h，全程搅拌，搅拌速度为100r/min，总共发酵18h，放罐，结束发酵培养，补料培养基的制备：向空消操作后的50l的种子罐中加入1.4t发酵培养基，再加入20kg葡萄糖并溶解，115℃、20min灭菌后制得补料培养基；
(5)粗粉碎玉米胚芽粕制得吸附剂，将玉米胚芽粕吸附剂与步骤(4)的发酵菌液混合均匀，步骤(4)的发酵菌液与玉米胚芽粕吸附剂的料液比(ml/g)为1:5，干燥后进行细粉碎，制成菌粉，流化床烘干菌粉，流化床的进风温度为55℃，流化床的出风温度为30℃。
对实施例1和2的发酵菌液和菌粉菌数进行含量检测，并根据菌液吸附倍数计算得到丁酸钠的含量，实施例1中发酵菌液丁酸梭菌活菌数为25亿/ml，丁酸钠含量为160μmol/ml，菌粉中丁酸梭菌活菌数为2.1亿/g，丁酸钠147μmol/ml；实施例2中，发酵菌液丁酸梭菌活菌数为30亿/ml，丁酸钠含量为180μmol/ml，菌粉中丁酸梭菌活菌数为3亿/g，丁酸钠162μmol/ml，大于现有技术中的10-15亿/ml。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。