本发明涉及生物能源和植物生物技术领域，具体地说，涉及一种缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶(lpaat)的基因及其应用。
背景技术：
目前，各种矿产资源如煤、石油、天然气等，随着不断的开发和利用而逐渐耗尽，人类急需寻找新的能源，特别是可再生能源。科学家认为生物乙醇和生物柴油是两个重要的液体生物燃料，并且有可能通过大规模生产生物质来替代石油类燃料。生物柴油由于其具有来源比较广泛、可以降解、热值高及对环境比较友好等优点，已经成为世界各国开发新能源的一个热点。其中，微藻因含油量高、其养殖可不占用耕地并能与废水处理相结合等特点，利用微藻制备生物柴油也成为科学家越来越关注的焦点。不同种类微藻合成三酰甘油(triacylglycerol，tag)的能力不同。研究发现，绿藻、硅藻等真核微藻的油脂含量比较高，有希望成为生产生物柴油的可开发资源。缺刻缘绿藻(myrmeciaincisareisiglh4301)是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门(chlorophyta)。该藻能大量积累tag，尤其是在缺氮条件下，是潜在的生产微藻生物柴油藻种。
植物及微藻油脂的主要成分是甘油三脂肪酸酯，该物质又被称为三酰甘油，即tag，它是一种中性脂，在植物及藻类的生长与发育中起着重要作用。tag的从头合成是沿着肯尼迪(kennedy)途径，即在内质网上经3种酰基转移酶的先后作用，脂肪酸逐步添加在甘油-3-磷酸的骨架上而形成的(caoetal.，2006；baraletal.，2012)。这3种酰基转移酶分别为甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate1-acyltransferase，gpat)、溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidicacidacyltransferase，lpaat)和二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerolo-acyltransferase，dgat)。其中，lpaat能将脂肪酸-coa添加到溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid，lpa)甘油骨架的sn-2位，从而生成磷脂酸(phosphatidicacid，pa)。其产物pa，一方面可用于沿着肯尼迪途径继续合成tag，另一方面可用于合成膜磷脂类物质(weselakeetal.，2009)。因而，lpaat基因是油脂合成的关键基因。
《中山大学》2010硕士论文“花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆和功能初步研究”，根据植物溶血磷脂酸酰基转移酶保守的氨基酸序列，通过比对同源性较高的区域，设计改良的简并引物进行pcr，从花生cdna文库中钓取出一个lpaat基因cdna片段，再根据获得的部分序列设计基因特异性引物，通过cdna末端快速扩增技术(race)获得该cdna的3′-和5′-末端序列，从而得到全长为1561个碱基的cdna序列，分析表明该序列具有一个长度为1131bp，编码376个氨基酸的开放阅读框(orf)，生物信息学分析表明该氨基酸序列具有保守的酰基转移酶结构域，将该基因的氨基酸序列进行比对分析发现其与蓖麻lpaat(ricinuscommunisputativelysophosphatidicacidacyltransferase,lpaat,genbank登录号：acb30546.1)的氨基酸同源性为90％，和油桐(verniciafordiiputativeglycerol-3-phosphateacyltransferase,genbank登录号：act32030.1)同源相似性为90％，故将其命名为ahlpaat(arachishypogaealysophosphatidicacidacyltransferase)。还克隆了该基因的dna序列(全长为3822bp)。
然而，目前还未见克隆缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因，尤其是可利用价值高的缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其应用。
第一方面，本发明提供了一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列选自下列中的任一种：
a)seqidno:2所示的氨基酸序列；
b)seqidno:2的第52-331位所示的氨基酸序列；
c)seqidno:3所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码如上所述的多肽。
优选地，所述的核苷酸序列其序列含有下列中的任一种：
a)seqidno.1所示的核苷酸序列；
b)seqidno:1的第140-1135位所示的核苷酸序列；
c)seqidno:1的第293-1135位所示的核苷酸序列；
d)至少包含seqidno:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与seqidno:1具备70％以上的同源性；
e)与以上a)、b)、c)或d)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含seqidno:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与seqidno:1具备80％以上的同源性。
更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含seqidno:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与seqidno:1具备90％以上的同源性。
更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含seqidno:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与seqidno:1具备95％以上的同源性。
更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含seqidno:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与seqidno:1具备99％以上的同源性。
第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述的重组表达载体是由如上所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。
第四方面，本发明提供了一种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种：
a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；
b)用如上所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。
优选地，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、不具备细胞全能性的植物细胞或不具备细胞全能性的动物细胞。
第五方面，本发明提供了如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体、如上所述的宿主细胞在增加油脂产量中的用途。
优选地，所述的增加油脂产量指增加磷脂酸产量或三酰甘油产量。
本发明优点在于：
缺刻缘绿藻富含花生四烯酸(arachidonicacid，ara，20:4δ5,8,11,14)，且其tag中2/3的脂肪酸为ara(欧阳珑玲等，2016)。为了解析ara如何以储藏脂的形式存在于藻细胞中，基于微藻tag从头合成的肯尼迪途径，本发明基于发明人丰富的研究经验，尤其是生物信息学分析经验，利用cdna末端快速扩增(rapidamplificationofcdnaends，race)技术克隆了缺刻缘绿藻lpaat这个被认为是tag合成的关键酶的基因。该基因的cdna全长序列长为1375bp，开放阅读框(orf)序列长为996bp，编码331个氨基酸残基；3’-非翻译区(utr)序列长为240bp，5’-utr序列长为139bp。它具有酰基转移酶结构域plsc，与auxenochlorellaprotothecoides的lpaat(genbank登录号：xp_011396467)序列具有59％的同源性，因而，将该克隆的基因命名为milpaat。它至少具有一个跨膜区。为了进一步明确milpaat编码蛋白的功能，本发明构建了milpaat的原核表达载体，经转化大肠杆菌(escherichiacoli)bl21并诱导培养后，纯化获得重组表达的milpaat成熟蛋白。对重组的milpaat成熟蛋白进行体外酶活性检测，酶催化反应产物的薄层色谱结果显示，重组的milpaat成熟蛋白可以将lpa合成为pa。这个结果表明milpaat编码的蛋白具有lpaat的功能，能将lpa催化合成为pa，后者沿着肯尼迪途径，在藻细胞中可进一步被合成为tag，本发明的milpaat及其编码的蛋白具备重要的应用价值。本发明为利用milpaat基因在粮油作物中过表达以增加三酰甘油的产量奠定了基础。
附图说明
图1.缺刻缘绿藻lpaat基因3’-/5’-race扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。m：dl2000dna分子量标准品(天根生化)；泳道1：3’-race第二轮巢式引物pcr扩增产物；泳道2：5’-race第二轮巢式引物pcr扩增产物。
图2.pet28a质粒图谱(上)及多克隆位点区域的序列(下)。
图3.诱导表达milpaat成熟蛋白的sds-page电泳图谱(左)、利用抗聚组氨酸标签的抗体进行western免疫印迹图谱(中)和纯化的可溶性重组表达milpaat成熟蛋白的sds-page电泳图谱(右)。m：预染蛋白分子量标准(fermenbtas)；泳道1和4：携带空载质粒pet28a的大肠杆菌的可溶性蛋白；泳道2：转milpaat基因大肠杆菌的全菌蛋白；泳道3：利用抗聚组氨酸标签的抗体对转milpaat基因的全菌蛋白进行的western免疫印迹；泳道5：利用250mm浓度的咪唑亲和纯化的可溶性重组表达milpaat成熟蛋白的电泳图谱。
图4.重组表达milpaat成熟蛋白的酶催化反应产物的薄层色谱层析图谱。pa和lpa：分别是磷脂酸和溶血磷脂酸的标准品；重组milpaat：指在反应体系中加入重组表达的milpaat成熟蛋白；对照：指反应体系中未加入重组表达的milpaat成熟蛋白。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明采用的主要操作步骤包括：
1)在温度为25℃、光照强度为115μmolphotons/(m2·s)、光暗比为12h/12h的条件下，于bg-11培养基中培养缺刻缘绿藻。收集藻细胞，并利用trizol法提取总rna。
2)基于本实验室获得的缺刻缘绿藻转录组数据库(ouyangetal.，2013)，通过ncbi的blastx比对，发现contig10781与胶球藻(coccomyxasubellipsoidea)c-169部分lpaat序列(genbank登录号：xp_005650277)有70％的相似度。根据这段序列设计引物，利用反转录pcr(reversetranscription-pcr，rt-pcr)首先克隆并验证contig10781的序列；然后利用cdna末端快速扩增(rapidamplificationofcdnaends，race)技术，拼接得到其cdna全长序列；最后，基于拼接的全长序列设计引物，以缺刻缘绿藻反转录的cdna为模板对milpaat的cdna全长序列进行验证与克隆，获得该基因的全长cdna序列。
3)利用trizol法提取rna后，经反转录试剂盒合成cdna第一链。根据milpaat的开放阅读框(orf)序列及pet28a载体多克隆位点的序列设计引物，以cdna为模板利用pcr扩增技术克隆milpaat不含有导肽的orf序列并构建pmd-19t/milpaat质粒。
4)对pet28a载体和pmd-19t/milpaat质粒分别进行双酶切(hindiii/xhoi)后，回收目的片段，再用t4连接酶连接得到重组载体pet28a-milpaat，将其转化、涂板、测序验证后提取质粒。
5)将提取的重组质粒pet28a-milpaat利用热激法转化大肠杆菌bl21的感受态细胞。然后，将转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(kan)的lb固体培养基上，筛选得到转pet28a-milpaat的大肠杆菌。
6)将转目的基因、转pet28a空载体的bl21大肠杆菌经1mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)在37℃下诱导培养4h后，收集大肠杆菌，液氮反复冻融3次后于-80℃冰箱中保存。
7)对反复冻融的大肠杆菌进行超声破碎，以提取重组表达的milpaat成熟蛋白，再利用his6-tag镍柱按照说明书纯化原核重组的milpaat成熟蛋白，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)技术检测原核重组蛋白表达情况，并利用抗his6-tag的抗体对表达的蛋白进行western免疫印迹检测。
8)在具有lpa及脂肪酸-coa的反应体系中加入纯化的原核重组milpaat成熟蛋白，反应一定时间后，利用薄层色谱层析(tlc)法检测磷脂酸(pa)的产生，证实了原核重组的milpaat成熟蛋白在体外能将lpa合成为pa，从而说明了自缺刻缘绿藻中克隆到的milpaat所编码蛋白具有lpaat的功能。
具体实验过程如下：
1、材料
1)本实验室的缺刻缘绿藻(myrmeciaincisareisiglh4301)来自捷克布拉格查理斯大学藻类培养中心(culturecollectionofalgaeofcharlesuniversityofprague，caup)。在温度为25℃、光照强度为115μmolphotons/(m2·s)、光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为bg-11。培养过程中每2个礼拜更新一次bg-11培养基，并且每天不定时地摇晃3-4次。
2)胶回收试剂盒、大肠杆菌(escherichiacoli)dh5α及bl21感受态细胞、his6-tag抗体、hrp标记的羊抗兔抗体、增强型hrp-dab显色试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；pmd-19t质粒、pet-28a质粒、反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司(takara)；trizol购自invitrogen公司；smarttmracecdna扩增试剂盒购自clontech公司；bio-scaletmminiprofinitytmimaccartridges镍柱购自bio-rad公司；其他试剂均为国产或进口，分析纯。
2、方法
1)待藻细胞长至指数生长期，4℃下以5500revolutions/min(rpm)的转速离心10min，并用灭菌去离子水洗涤3次后再同样离心收集藻细胞。取100mg刚离心收集的新鲜缺刻缘绿藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分迅速地研磨1.5min。
2)参照trizol法的说明书，提取缺刻缘绿藻的总rna，-20℃保存备用。
3)基于缺刻缘绿藻转录组数据库中得到的contig10781序列，设计引物10781(l)(ctatcactcttcccacctacagc，seqidno:4)和10781(r)
(atgtagtatggatctgcgatcagg，seqidno:5)对contig10781序列进行验证。根据已验证的contig10781序列设计3’/5’-race基因特异性引物，包括两次5’-race所用基因特异性引物5’race2(r)
(cagggtgaaggtccataggtagaaa，seqidno:6，巢式引物)和5’
race2(l)(tggtctctgctctatgcctttctgg，seqidno:7)，及两次3’-race所用基因特异性引物3’race2(r)
(aaccgctcgttcaagttcatctcca，seqidno:8)和3’race2(l)
(cacaacctgcccaagaatgatgagc，seqidno:9，巢式引物)。利用clontech公司的smarttmracecdna扩增试剂盒进行pcr扩增。5’-race第一轮的pcr反应条件为：94℃预变性5min；25个循环包括94℃变性30s，62.5℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。所用引物为5’race2(l)和upm(试剂盒中所带引物)；第二轮pcr反应取1μl第一轮pcr产物作为反应模板，所用引物为5’race2(r)和nup(试剂盒中所带引物)，反应条件同第一轮pcr。3’-race反应条件同5’-race。不过，第一轮的pcr引物为3’race2(r)和upm；第二轮pcr反应也是取1μl第一轮pcr产物作为反应模板，但所用引物为3’race2(l)和nup。
4)利用天根生化科技(北京)有限公司生产的胶回收试剂盒并按照其说明回收pcr产物。然后按照宝生物工程(大连)有限公司提供的说明，将pcr产物过夜连接至pmd-19t载体。连接体系为：5μl的solutioni(试剂盒携带)，4μl的胶回收产物，1μl的pmd-19t载体。然后通过热激法将携带目的片段的pmd-19t转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞。转化过程如下：将连接反应液加入到100μl的大肠杆菌dh5α感受态细胞中，轻轻涡旋震荡离心管的内容物；将离心管完全埋入冰中冰浴30min；42℃热激90s后，冰上放置1min；每个离心管加890μl含氨苄青霉素钠(amp)的lb液体培养基，在37℃下以180rpm的转速震荡培养2～3h，然后保存于4℃冰箱中。通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆菌落。方法如下：取100μl转化液平铺于含有5-溴-4氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal，400μl)、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，200μl)、amp(200μl)的lb琼脂平板培养基上，37℃倒置培养10～14h，形成单菌落；挑取3～5个单个白斑菌落，于含amp的lb(2～3ml)液体培养基中，在37℃下以180rpm的转速震荡培养10～16h。利用菌落pcr验证阳性克隆的菌体是否含有目的基因。其反应体系为：2×rtprimermix12.5μl，无rnase的水9.5μl，目的基因片段克隆相同的上游和下游引物各1μl，菌液模板1μl；菌落pcr反应程序为：94℃预变性3min，30个循环包含94℃变性50s、64℃退火45s、72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。分装1ml已验证的阳性克隆菌液送到上海生工生物工程有限公司测序，获得目的基因的序列。
5)基于利用race技术克隆并拼接得到的milpaat全长cdna序列，设计引物克隆并验证milpaat的全长cdna序列。提取缺刻缘绿藻总rna，利用rt-pct反转录试剂盒得到cdna。以缺刻缘绿藻cdna为模板，设计引物2cdna(l)
(cagtggtatcaacgcagagtacat，seqidno:10)和2cdna(r)
(acacagaagtcagagactctacaac，seqidno:11)对序列进行验证。pcr反应程序为：94℃预变性5min，30个循环包含94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1.5min，最后72℃延伸10min。按4)的方法对pcr产物进行胶回收、连接、转化、菌落pcr验证和测序等。
6)为了在大肠杆菌中重组表达milpaat并确定其功能，在上述milpaat全长cdna序列克隆及生物信息学分析的基础上，设计带酶切位点的引物，克隆milpaat不含有导肽的开读框架(orf)序列。pcr上游引物rcf为aagcttatgcacatgaagccctgct(seqidno:12，小写字母为hindiii酶切位点)，下游引物rcr为ctcgagtcactccgtctgcctgcgct(seqidno:13，小写字母为xhoi酶切位点)。pcr反应程序：94℃预变性3min，30个循环包含94℃变性50s、64℃退火45s、72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。按照4)的方法对pcr产物进行胶回收、连接、转化、菌落pcr验证和测序等。
7)重组表达milpaat的质粒构建。从6)中获得的大肠杆菌dh5α中抽提携带milpaat不含有导肽orf的pmd-19t质粒，用限制性内切酶hindiii和xhoi进行双酶切消化反应；同时，对pet28a质粒也进行同样的双酶切反应。酶切反应体系为：2μl的10×m缓冲液，质粒dna约2μg，hindiii及xhoi各1μl，加无rnase水至20μl。置于pcr仪中，在37℃下进行4h的消化反应。然后，按照4)的方法对酶切后的目的片段进行胶回收，并用t4dna连接酶将酶切后胶回收的目的片段与pet28a片段连接得到重组表达载体pet28a-milpaat。连接反应体系为：2.5μl的t4缓冲液，milpaat片段dna约0.3pmol，pet28a载体dna约0.03pmol，1μl的t4dna连接酶，加无rnase水至25μl。16℃连接过夜。将连接后得到的重组表达载体pet28a-milpaat转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，按照4)的方法进行细菌培养、菌落pcr验证和测序。
8)从大肠杆菌dh5α中抽提重组表达质粒pet28a-milpaat，利用热激法将该质粒转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中。通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆菌落并按照4)的方法通过菌落pcr验证后，送上海生工生物工程有限公司测序。另外，按上述同样方法将空载质粒pet28a转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中。
9)将测序无误含有重组表达质粒pet28a-milpaat的菌液，按1:1000的比例接种于含卡那霉素(kan)的lb液体培养基，在37℃下以180rpm的转速震荡培养过夜以活化。取2ml活化好的菌液接种至200ml含kan的lb液体培养基，同样条件下扩大培养，约2～3h后，菌细胞在600nm处检测的光密度值在0.6～1.0左右。此时，加入1mm的iptg，同样条件下培养4h以诱导重组蛋白milpaat的表达。然后将培养液置于冰上冷却15min使细胞停止生长。4℃条件下以5500rpm的转速离心5min收集大肠杆菌，用20ml预冷的无菌水洗涤细胞2次，同样条件下离心收集菌体；再用20ml预冷的1×pbs(0.137mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4、2mmkh2po4)溶液洗涤细胞2次，然后置于15ml预冷的1×pbs溶液中。取适量刚收集的细胞按1:1的比例加入蛋白上样缓冲液混合后沸水煮10min。利用sds-page进行凝胶电泳并利用抗聚组氨酸标签的抗体进行western免疫印迹，分析转重组表达质粒pet28a-milpaat的细菌中重组蛋白milpaat的表达情况。western免疫印迹方法如下：将转膜用的滤纸、海绵和硝酸纤维素膜(nc膜)以及电泳好的蛋白凝胶浸泡在转膜缓冲液(3.03gtris、14.4g甘氨酸、200ml甲醇，用水定容至1000ml)中，在100v电压、200ma电流条件下电泳45min，将蛋白质从凝胶上电转至nc膜上；将电转的nc膜先用丽春红染色，判断蛋白质是否成功转移至nc膜；然后用去离子水清洗膜5min，以洗去膜表面的染液；再用tbst(0.137mnacl、2.7mmkcl、0.025mtris，ph7.4，用前加入0.05％tween20)溶液洗涤三次，每次5min；用封闭液(tbst配制的5％脱脂奶粉)封闭洗涤的nc膜1h，然后再用tbst溶液洗涤3次，每次5min；加入用封闭液稀释(稀释倍数1/2000)的抗his6-tag抗体，在常温下用脱色摇床平缓摇动1h，再用tbst溶液洗涤3次，每次10min；加入用封闭液稀释(稀释倍数1/6000)的hrp标记的羊抗兔二抗，同一抗一样孵育1h，洗3次，每次10min；最后按增强型hrp-dab底物显色试剂盒的说明书在暗室中配好显色液，然后在显色液中漂洗处理好nc膜直至目的条带出现，再放入超纯水中冲洗干净膜上残余的显色液，晾干后拍照保存。
10)将上述sds-page检测后余下的转目的基因大肠杆菌通过液氮反复冻融3次后于-80℃冰箱保存。实验时，将保存于-80℃冰箱的大肠杆菌细胞置于37℃金属浴中以融化，利用160w功率的超声破碎机超声5s、间隔5s以破碎菌体，至澄清(约1h)。4℃条件下以12000rpm的转速离心15min，分别收集上清和沉淀两部分，其中沉淀部分再用与上清相同体积的1×pbs溶解。利用sds-page分析上清和沉淀中重组蛋白milpaat的表达情况。
11)上清中可溶性重组表达蛋白milpaat的纯化。取新的5ml预装镍柱先用2倍于柱床体积的20％乙醇以2ml/min的流速洗涤，再用2倍于柱床体积的预冷无菌水以相同的流速洗涤，镍柱即达到平衡，可用于蛋白纯化；用5倍于柱床体积的漂洗缓冲液(含5mm咪唑、50mmkh2po4和300mmkcl，ph8.0)平衡镍柱，流速控制在2ml/min左右；将上清中的可溶性蛋白用0.22μm滤器过滤，防止细胞碎片等杂质堵塞镍柱，然后以0.5ml/min的流速加入到平衡后的镍柱中；分别用5mm、10mm、20mm、250mm等不同浓度的咪唑清洗镍柱以确定可以纯化获得目的蛋白的理想洗脱浓度，收集洗脱液，利用sds-page检测目的重组表达蛋白milpaat的纯化情况。
12)利用薄层色谱层析法检测milpaat的酶催化反应产物。在玻璃反应管中加入酶反应体系[400μl纯化后的目的蛋白milpaat，30μl的溶血磷脂酸(lpa)，10μl的ara-coa，50μl的tris-hcl(25mm，ph7.6)，50μl的kcl(0.4m)]，于30℃水浴锅中反应10min后，加入1.33ml甲醇:氯仿:乙酸(50:50:1，v/v)终止反应并且涡旋，再加133μl灭菌水，涡旋，以5500rpm的转速离心15min。吸取下层有机相转移至新的反应管中，加入660μl氯仿，相同条件下离心，再次从水相中提取有机相。混合两次抽提的有机相，然后用氮气吹干，加入20μl氯仿溶解。在薄板上用毛细吸管点样，然后展开，所用展开剂为乙酸乙酯:异丙醇:氯仿:无水甲醇:0.25％kcl(25:25:25:10:9，v/v)，展开距离为12.5cm，时间约1h。然后将薄板用硫酸铜溶液(20gcuso4、80mlh3po4溶解在1l水里)显色，置于180℃烘箱烤20min。对比lpa和pa标样，检查薄板上pa的生成情况。
3、结果
1)milpaat的基因序列克隆。利用race技术自缺刻缘绿藻中扩增该基因的5’-及3’-末端序列，3’-/5’-race第二轮巢式pcr所用引物分别为3’race2(l)和5’race2(r)，扩增结果如图1所示。3’-末端测序结果表明所得目的片段大小为719bp，并且有明显的polya尾巴；5’-末端测序结果表明所得目的片段大小为407bp。将5’-末端及3’-末端序列与验证的contig8647序列进行拼接后，得到一长度为1404bp的cdna序列。对该cdna序列重新设计一对引物2cdna(r)和2cdna(l)进行pcr反应并测序验证，得到一长度为1375bp准确的cdna全长序列(seqidno:1)。经生物信息学预测，它的5’-非翻译区(utr)长139bp，3’-utr长240bp(不含polya尾巴)，开放阅读框(orf)序列长996bp，编码一个由331个氨基酸组成且分子量为37.7kd的前体蛋白。该氨基酸序列与auxenochlorellaprotothecoides中预测定位于叶绿体lpaat(xp_011396467)的序列具有59％的同源性，因而将其命名为milpaat。对milpaat的orf所编码蛋白进行生物信息学分析后，我们了解到，在milpaat的氨基端存在由51个氨基酸组成的导肽，说明在缺刻缘绿藻细胞中，该前体蛋白氨基端的前51个氨基酸将被切除，只以280个氨基酸组成的成熟蛋白行使功能，预测的成熟蛋白分子量为31.78kd。
2)原核重组milpaat表达质粒的构建及蛋白的纯化。根据上述milpaat成熟蛋白的基因序列以及表达质粒pet28a多克隆位点的序列(图2)，为了能使用his6-tag亲和层析方法更方便地纯化得到重组表达的milpaat成熟蛋白以进行功能鉴定，本发明设计了一对带酶切位点的引物rcf和rcr，克隆到milpaat不含有导肽序列的orf，并将该序列连接至hindiii和xhoi酶切的pet28a上。在构建好的milpaat成熟蛋白重组表达质粒上，因在插入目的片段的上游存在6个his编码序列以及质粒上携带的适用其它酶切位点的序列(图2)，这样在成熟蛋白的280个氨基酸基础上又增加了44个氨基酸，因而重组表达蛋白的预测分子量为36.57kd。将重组表达质粒pet28a-milpaat转化至大肠杆菌bl21后，再利用iptg诱导蛋白表达。通过对重组表达蛋白milpaat进行sds-page检测以及利用商用his6-tag通用抗体进行western印迹分析，在免疫印迹图谱(图3中)上只出现一分子量大小约36.57kd的单一信号，它与预测的分子量大小及诱导表达蛋白电泳结果(图3左)一致，说明已成功地重组表达了不含有导肽的milpaat，即milpaat的成熟蛋白。利用his6-tag镍柱并使用不同浓度的咪唑纯化原核重组表达的成熟milpaat，sds-page检测结果(图3右)显示250mm的咪唑浓度有利于成熟milpaat的纯化，表明利用该浓度的咪唑进行亲和层析可以获得相对成分比较单一、分子量大小为36.57kd的重组表达milpaat。而在只含有空载质粒pet28a作为阴性对照的大肠杆菌上清可溶性蛋白的泳道上没有出现该大小的条带，进一步表明本发明已成功地重组表达并纯化了成熟的milpaat。
3)酶促反应产物的薄层层析检测。将上述纯化的成熟milpaat添加到含有反应物溶血磷脂酸(lpa)与ara-coa及缓冲液0.4mkcl、25mmtris-hcl(ph7.6)的反应体系中，10min后终止反应，对反应的产物进行薄层层析。薄层色谱结果(图4)显示，在添加纯化的重组表达milpaat成熟蛋白的反应体系中能检测到磷脂酸(pa)的产生，而在没有添加该重组蛋白的反应体系中却没有检测到pa的产生。表明这个经纯化的重组成熟milpaat在体外具有lpaat的活性。说明它在藻细胞中能沿着kennedy途径进行磷脂酸的合成以进一步合成tag。
以下是关于本发明部分序列的特别说明：
seqidno:1——milpaat的cdna全长序列(下划线为起始或终止密码子，阴影部分为导肽所对应的cdna序列)
aagcagtggtatcaacgcagagtacatggggacatttgcgttgatcaaggtcactgcagcacgcgtcctgcaaacgacaagcagcgccctgtacgctgcctttgtgtagcagctgtgcagtttcacttgcagttcaggcatgcacatgaagccctgctatcactcttcccacctacagcaccattcctgcggactgcagcctggcaaccagcccatctacagagttcaaagccgtttagcgcccacagcgcccagcccaaggccatgccagcacaggcggcaaacttgcaggctgtcctcaacaccaagcctgccaaggcgtacaaggaagcaaatggcttgctcagcatcctccttagctctggctgttgacccaccgtccccagaaaggcatagagcagagaccatactagcaagcgttaaggggctgcttttctacctatggaccttcaccctgtccctgccgctgttcgtgaccatgctcgtcattgcacccttcatggccgtccttgacaagcatagacggcttgcacagcactttgtgaacaacatctgggcaaaggtgtcaacctggcccttctaccgagtacggattgatgggcgacacaacctgcccaagaatgatgagccagctgtctatgtagccaatcatgcgagtttcctggacatctatacgctgttccatctcaaccgctcgttcaagttcatctccaagaccagcaacttcctcatcccaatcattggctggagcatgttcctgacagggcatgtccggctgaaccgcgtggaccgcaagagccagatcaagtgcctgtccaagtgccgcgagctgctttcggagggcgcctccgtgctgttcttccccgagggcacgcgcagcaaggacgggaagatccaggacttcaaaaagggcgcgttcagcgtggctgccaaggccaaggtgccggttgtgcccatcacgctggtgggcaccggacgcatcatgcccaacaagcaggagtccaaaatgttcccgggcaatgtgcatgtgattgtccatccgcgcgtggagccgaaggatcctgacgccatgatggctgaggcatacgacctgatcgcagatccatactacatcgagcgcaggcagacggagtgatgatatcagataagcatgttcaagaataaagggtgttgcaaggcatgcccccaagcgatgcgccaggattgctggttttgtttcgtgacccaggcacaggttggcatgcttgggtaacacacgcttggttgcggtagcaagggctgtgttggggtgcaaactgtgaatgcttacaggtgactgcttcagttgtagagtctctgacttctgtgtactgacatgtaatgtgtgggatttctgaaaaaaaaaaaaaaaaa
seqidno：2-milpaat的orf所编码蛋白的氨基酸序列(阴影部分为导肽序列)
mhmkpcyhsshlqhhscglqpgnqpiyrvqsrlaptapsprpcqhrrqtcrlsstpslprrtrkqmacsasslalavdppsperhraetilasvkgllfylwtftlslplfvtmlviapfmavldkhrrlaqhfvnniwakvstwpfyrvridgrhnlpkndepavyvanhasfldiytlfhlnrsfkfisktsnflipiigwsmfltghvrlnrvdrksqikclskcrellsegasvlffpegtrskdgkiqdfkkgafsvaakakvpvvpitlvgtgrimpnkqeskmfpgnvhvivhprvepkdpdammaeaydliadpyyierrqte
seqidno：3——原核重组表达milpaat成熟蛋白的氨基酸序列(阴影部分为载体中所携带供基因工程操作的碱基所编码的氨基酸序列)
mgsshhhhhhssglvprgshmasmtggqqmgrgsefelrrqasmlsstpslprrtrkqmacsasslalavdppsperhraetilasvkgllfylwtftlslplfvtmlviapfmavldkhrrlaqhfvnniwakvstwpfyrvridgrhnlpkndepavyvanhasfldiytlfhlnrsfkfisktsnflipiigwsmfltghvrlnrvdrksqikclskcrellsegasvlffpegtrskdgkiqdfkkgafsvaakakvpvvpitlvgtgrimpnkqeskmfpgnvhvivhprvepkdpdammaeaydliadpyyierrqte
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>上海海洋大学
<120>缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其应用
<130>/
<160>13
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1392
<212>dna
<213>myrmeciaincisa
<400>1
aagcagtggtatcaacgcagagtacatggggacatttgcgttgatcaaggtcactgcagc60
acgcgtcctgcaaacgacaagcagcgccctgtacgctgcctttgtgtagcagctgtgcag120
tttcacttgcagttcaggcatgcacatgaagccctgctatcactcttcccacctacagca180
ccattcctgcggactgcagcctggcaaccagcccatctacagagttcaaagccgtttagc240
gcccacagcgcccagcccaaggccatgccagcacaggcggcaaacttgcaggctgtcctc300
aacaccaagcctgccaaggcgtacaaggaagcaaatggcttgctcagcatcctccttagc360
tctggctgttgacccaccgtccccagaaaggcatagagcagagaccatactagcaagcgt420
taaggggctgcttttctacctatggaccttcaccctgtccctgccgctgttcgtgaccat480
gctcgtcattgcacccttcatggccgtccttgacaagcatagacggcttgcacagcactt540
tgtgaacaacatctgggcaaaggtgtcaacctggcccttctaccgagtacggattgatgg600
gcgacacaacctgcccaagaatgatgagccagctgtctatgtagccaatcatgcgagttt660
cctggacatctatacgctgttccatctcaaccgctcgttcaagttcatctccaagaccag720
caacttcctcatcccaatcattggctggagcatgttcctgacagggcatgtccggctgaa780
ccgcgtggaccgcaagagccagatcaagtgcctgtccaagtgccgcgagctgctttcgga840
gggcgcctccgtgctgttcttccccgagggcacgcgcagcaaggacgggaagatccagga900
cttcaaaaagggcgcgttcagcgtggctgccaaggccaaggtgccggttgtgcccatcac960
gctggtgggcaccggacgcatcatgcccaacaagcaggagtccaaaatgttcccgggcaa1020
tgtgcatgtgattgtccatccgcgcgtggagccgaaggatcctgacgccatgatggctga1080
ggcatacgacctgatcgcagatccatactacatcgagcgcaggcagacggagtgatgata1140
tcagataagcatgttcaagaataaagggtgttgcaaggcatgcccccaagcgatgcgcca1200
ggattgctggttttgtttcgtgacccaggcacaggttggcatgcttgggtaacacacgct1260
tggttgcggtagcaagggctgtgttggggtgcaaactgtgaatgcttacaggtgactgct1320
tcagttgtagagtctctgacttctgtgtactgacatgtaatgtgtgggatttctgaaaaa1380
aaaaaaaaaaaa1392
<210>2
<211>331
<212>prt
<213>myrmeciaincisa
<400>2
methismetlysprocystyrhisserserhisleuglnhishisser
151015
cysglyleuglnproglyasnglnproiletyrargvalglnserarg
202530
leualaprothralaproserproargprocysglnhisargarggln
354045
thrcysargleuserserthrproserleuproargargthrarglys
505560
glnmetalacysseralaserserleualaleualavalasppropro
65707580
serprogluarghisargalagluthrileleualaservallysgly
859095
leuleuphetyrleutrpthrphethrleuserleuproleupheval
100105110
thrmetleuvalilealaprophemetalavalleuasplyshisarg
115120125
argleualaglnhisphevalasnasniletrpalalysvalserthr
130135140
trpprophetyrargvalargileaspglyarghisasnleuprolys
145150155160
asnaspgluproalavaltyrvalalaasnhisalaserpheleuasp
165170175
iletyrthrleuphehisleuasnargserphelyspheileserlys
180185190
thrserasnpheleuileproileileglytrpsermetpheleuthr
195200205
glyhisvalargleuasnargvalasparglysserglnilelyscys
210215220
leuserlyscysarggluleuleusergluglyalaservalleuphe
225230235240
pheprogluglythrargserlysaspglylysileglnaspphelys
245250255
lysglyalapheservalalaalalysalalysvalprovalvalpro
260265270
ilethrleuvalglythrglyargilemetproasnlysglngluser
275280285
lysmetpheproglyasnvalhisvalilevalhisproargvalglu
290295300
prolysaspproaspalametmetalaglualatyraspleuileala
305310315320
aspprotyrtyrilegluargargglnthrglu
325330
<210>3
<211>324
<212>prt
<213>myrmeciaincisa
<400>3
metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalpro
151015
argglyserhismetalasermetthrglyglyglnglnmetglyarg
202530
glysergluphegluleuargargglnalasermetleuserserthr
354045
proserleuproargargthrarglysglnmetalacysseralaser
505560
serleualaleualavalaspproproserprogluarghisargala
65707580
gluthrileleualaservallysglyleuleuphetyrleutrpthr
859095
phethrleuserleuproleuphevalthrmetleuvalilealapro
100105110
phemetalavalleuasplyshisargargleualaglnhispheval
115120125
asnasniletrpalalysvalserthrtrpprophetyrargvalarg
130135140
ileaspglyarghisasnleuprolysasnaspgluproalavaltyr
145150155160
valalaasnhisalaserpheleuaspiletyrthrleuphehisleu
165170175
asnargserphelyspheileserlysthrserasnpheleuilepro
180185190
ileileglytrpsermetpheleuthrglyhisvalargleuasnarg
195200205
valasparglysserglnilelyscysleuserlyscysarggluleu
210215220
leusergluglyalaservalleuphepheprogluglythrargser
225230235240
lysaspglylysileglnaspphelyslysglyalapheservalala
245250255
alalysalalysvalprovalvalproilethrleuvalglythrgly
260265270
argilemetproasnlysglngluserlysmetpheproglyasnval
275280285
hisvalilevalhisproargvalgluprolysaspproaspalamet
290295300
metalaglualatyraspleuilealaaspprotyrtyrilegluarg
305310315320
argglnthrglu
<210>4
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
ctatcactcttcccacctacagc23
<210>5
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
atgtagtatggatctgcgatcagg24
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
cagggtgaaggtccataggtagaaa25
<210>7
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
tggtctctgctctatgcctttctgg25
<210>8
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
aaccgctcgttcaagttcatctcca25
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>9
cacaacctgcccaagaatgatgagc25
<210>10
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<400>10
cagtggtatcaacgcagagtacat24
<210>11
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>11
acacagaagtcagagactctacaac25
<210>12
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>12
aagcttatgcacatgaagccctgct25
<210>13
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<400>13
ctcgagtcactccgtctgcctgcgct26