本发明涉及生物工程技术，尤其是涉及生物活性多肽的制备方法，同时涉及其应用。
背景技术：
中华鳖(pelodiscussinensis)是一种重要的淡水名贵经济动物，也是中国传统的营养保健佳品，在《中国药典》中记载中华鳖背甲(鳖甲)具有滋阴补阳、软坚散结、退热除蒸的功效，主治阴虚发热症瘕、虚风内动等症，中华鳖甲药理作用十分显著，已广泛用于中药饮片中。我国水产动物资源丰富，水产养殖业发展迅速，2015年中国中华鳖养殖产量达34.16万吨，产值近200亿元，成为渔业重要产业，可以为胶原蛋白肽的提取提供丰富的来源。虽然目前从多种水产动物中提取胶原肽的工艺日益成熟，但以中华鳖这种具有很高的营养价值和药用价值的水生经济动物研究较少。现在已有一些关于中华鳖整体结构和裙边中胶原制备的研究报道，但是针对中华鳖的特征性营养部位(如背甲)的提取报道非常缺乏。中华鳖甲提取的胶原粗肽具有良好的抗氧化活性，但粗肽中成分复杂，含有未酶解的蛋白质，分子量不同的肽段，小分子氨基酸盐离子等，影响了胶原肽的活性。传统的胶原肽的分离方法对肽类抗氧化活性破坏较严重，且分离是制约该工艺发展的瓶颈技术；由于鳖甲组织较硬，前处理比较困难，其精深加工领域尚处于初级阶段。
近年来，与水提法、酸提法、碱提法等常规提取方法相比，复合酶提法由于提取效果良好、营养价值提高、工艺环保等多种优点，备受人们的关注。例如中国专利cn107034259b公开了一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法，其步骤包括：a、清洗；b、脱盐；c、碱液浸泡除杂蛋白；d、醇浸泡；e、超声酶提；f、盐析；g、重复盐析；h、透析。该方法组合使用除盐、除杂蛋白、除脂肪，与添加单一的酶解相比，可以同时消除多种影响因子，更有利于胶原蛋白的提纯。但是这种方法中，(1)没有使用热水浸提，(2)获得的中华鳖源胶原蛋白分子量较大，不利于机体的吸收利用；鳖甲中胶原蛋白并没有良好的抗氧化活性，并且这一提取过程仅适用于骨类蛋白源，对其它的软组织胶原蛋白肽的提取作用较弱。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种高抗氧化中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，提取率高且提取成本低、环境友好。
本发明的技术方案是提供一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
s1.粉碎：取中华鳖营养部位(例如特征性背甲、裙边)清洗干净，粉碎；
s2.碱液除杂蛋白：将步骤s1所得中华鳖组织置于naoh溶液中浸泡；
s3.醇除脂肪：取步骤s2所得中华鳖组织洗涤，沥干后置于乙醚溶液中浸泡；
s4.热水浸提：取步骤s3所得中华鳖组织经蒸馏水洗涤，沥干后加入中华鳖组织质量15～25倍的水，温度升高至90～110℃加热10～20min，冷却；
s5.酶解：取步骤s4热水浸提后的中华鳖组织混合液，调ph为7～7.5，加入木瓜蛋白酶搅拌，过滤得滤液；
s6.离心：在3～5℃下，将步骤s5所得滤液以8000～10000×g离心25～35min后得上清液即为粗胶原蛋白；
s7.盐析：取步骤s6所得粗胶原蛋白加入nacl析出絮状沉淀，于3～5℃8000～10000×g离心25～35min得沉淀物，用冰醋酸重新溶解，重复盐析，8000～10000×g离心25～35min得沉淀物为胶原蛋白；
s8.透析：将步骤s7所得胶原蛋白采用乙酸溶解，并用乙酸作为透析液进行透析。
其中，
步骤s1中中华鳖组织为背甲，并剃去裙边与肌肉后清洗干净，粉碎前先采用骨钳钳成块并置于液氮浸泡，粉碎后放入-20℃保存备用；先钳成块并浸于液氮更加有利于中华鳖背甲粉碎且采用液氮浸泡冷冻快速对中华鳖背甲中的有效成分影响小；
步骤s2中naoh溶液质量为中华鳖组织质量的15～25倍，naoh溶液浓度为0.05～0.15mol/l，浸泡温度为20℃，浸泡时间为3～5h；
步骤s3中乙醚溶液质量为中华鳖组织质量的15～25倍，乙醚溶液质量浓度为10％，浸泡温度为15～30℃，浸泡时间为24h；
步骤s5中木瓜蛋白酶加入量为250～300u/g，50℃下搅拌5～7h；
步骤s7中加入nacl至nacl溶液浓度为0.8～1.0mol/l；冰醋酸溶液浓度为0.5mol/l；
步骤s8溶解用乙酸浓度为0.5mol，透析用乙酸浓度为0.05～0.1mol/l，透析时间为72h，每6～10h更换一次乙酸透析液，冷冻干燥后至-20℃保存待用。
进一步地，透析结束后还包括二次酶解和离子交换层析步骤；
进一步地，当进行二次酶解和离子交换层析步骤时可以省略步骤s4热水浸提。
二次酶解步骤为取步骤s8所得中华鳖组织胶原蛋白，按胶原蛋白质量10～15倍添加ph为7.4浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，再加入250～300u/g木瓜蛋白酶，并在50℃下搅拌5～7h，冷冻干燥后备用；离子交换层析步骤为取二次酶解后的中华鳖组织胶原蛋白，按料液比10:1mg/ml溶解于0.05mol/l、ph6的tris缓冲液、吸光值214nm、温度10℃、每分钟上涨0.1mol的速度使其达到1mol/lnacl条件下进行线性梯度洗脱，流速为1ml/min，接取出cp-1峰样品，冷冻干燥后即得高抗氧化中华鳖组织胶原蛋白肽。
本发明还给出中华鳖胶原蛋白肽在制备具有抗氧化功能的药品、保健品、护肤美容用品中的应用。
本发明的优点和有益效果：本发明通过粉碎、碱液除杂蛋白、醇除脂肪、热水浸提、酶解、离心、盐析等步骤得到高抗氧化中华鳖组织胶原蛋白肽，具体说采用复合酶解方法工艺，提取率较高，既能有效提取胶原蛋白肽，又能低成本获得具有良好抗氧化的胶原蛋白肽，并对环境污染小，可充分有效开发和利用中华鳖组织，避免水产生物资源浪费，并提高中华鳖养殖业的经济效益。特别是酶解与热水浸提相互配合，酶解中木瓜蛋白酶对热水浸提后的中华鳖组织混合液酶解，避免了使用碱提法和单纯水提法对蛋白功能性质的影响，酶解后的中华鳖组织胶原蛋白大大提高了营养价值；此外热水处理后的胶原蛋白肽抗氧化活性效果明显提高，这是当前普遍采用的水提法和单酶酶解所不能达到的。
附图说明
图1是本发明中华鳖背甲酶解胶原蛋白抗氧化活性测定结果，图中：a为对比例1样品测定结果，b为实施例1样品测定结果，c为实施例3样品测定结果，d为实施例2样品测定结果。
图2是本发明中华鳖背甲酶解胶原蛋白进行梯度洗脱的离子交换层析图谱，其中cp-1为目的样品出峰。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。本发明采用粉碎、碱液除杂蛋白、醇除脂肪、热水浸提、酶解、离心、盐析等步骤提取中华鳖组织胶原蛋白，申请人发现热水浸提与酶解配合以及进行二次酶解能够有效提高提取效率以及蛋白肽的抗氧化活性，热水浸提能够使中华鳖组织胶原蛋白充分进入提取液中并且使活性氨基酸残基初步暴露，进一步地酶解过程中胶原蛋白大量裂解，主要裂解胶原蛋白中的盐键和二氢键，同时酶解改变多序列氨基酸固定排列组合，其中含有相对分子量较小的氨基酸序列等活性成分可使机体更充分地消化吸收，并且活性成分分子量降低、活性基团暴露，与自由基碰撞几率更高也更容易发生反应，因此抗氧化活性越高。以下实施例及对比例以中华鳖背甲为例说明本发明具体过程和效果。
实施例1
本发明提供一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
s1.粉碎：取中华鳖背甲，剃去裙边与肌肉后清洗干净，粉碎；进一步地粉碎过程为将中华鳖背甲采用骨钳钳成块液氮浸泡后放入粉碎机粉碎；再放入-20℃冰箱保存备用；
s2.碱液除杂蛋白：将步骤s1所得中华鳖背甲置于naoh溶液中浸泡，进一步地，所用naoh溶液质量为中华鳖背甲质量的20倍，浓度为0.1mol/l，浸泡温度为20℃，浸泡时间为4h。
s3.醇除脂肪：取步骤s2所得中华鳖背甲反复洗涤，沥干后加入中华鳖背甲质量20倍的质量浓度为10％的乙醚溶液，于25℃浸泡24h，以去除脂肪；
s4.热水浸提：取步骤s3所得中华鳖背甲经蒸馏水反复洗涤，沥干后再加入以中华鳖背甲质量20倍的水溶液，温度升高至100℃加热15min后，冷却；
s5.酶解：取步骤s4热水浸提后的中华鳖背甲混合液，用磷酸盐缓冲液调至ph为7.4。加入300u/g木瓜蛋白酶，并在50℃下磁力搅拌5h后过滤得液体；
s6.离心：在4℃下，将步骤s5所得滤液以10000×g离心30min后得上清液即为粗胶原蛋白；
s7.盐析：取步骤s6所得粗胶原蛋白加入nacl至溶液浓度为1.0mol/l，析出絮状沉淀，于4℃10000×g离心30min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重复盐析一次，10000×g离心30min得沉淀物为胶原蛋白；
s8.透析：将步骤s7所得胶原蛋白采用乙酸溶解，并用乙酸作为透析液进行透析，进一步地透析用乙酸浓度为0.1mol/l，透析时间为72h，每6～10h更换一次乙酸透析液，冷冻干燥后至-20℃保存待用。
实施例2
本发明提供一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
s1.粉碎：取中华鳖背甲，剃去裙边与肌肉后清洗干净，粉碎；进一步地粉碎过程为将中华鳖背甲采用骨钳钳成块液氮浸泡后放入粉碎机粉碎；再放入-20℃冰箱保存备用；
s2.碱液除杂蛋白：将步骤s1所得中华鳖背甲置于naoh溶液中浸泡，进一步地，所用naoh溶液质量为中华鳖背甲质量的20倍，浓度为0.1mol/l，浸泡温度为20℃，浸泡时间为4h。
s3.醇除脂肪：取步骤s2所得中华鳖背甲反复洗涤，沥干后加入中华鳖背甲质量20倍的质量浓度为10％的乙醚溶液，于25℃浸泡24h，以去除脂肪；
s4.热水浸提：取步骤s3所得中华鳖背甲经蒸馏水反复洗涤，沥干后再加入以中华鳖背甲质量20倍的水溶液，温度升高至100℃加热15min后，冷却；
s5.酶解：取步骤s4热水浸提后的中华鳖背甲混合液，用磷酸盐缓冲液调至ph为7.4。加入300u/g木瓜蛋白酶，并在50℃下磁力搅拌5h后过滤得液体；
s6.离心：在4℃下，将步骤s5所得滤液以10000×g离心30min后得上清液即为粗胶原蛋白；
s7.盐析：取步骤s6所得粗胶原蛋白加入nacl至溶液浓度为1.0mol/l，析出絮状沉淀，于4℃10000×g离心30min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重复盐析一次，10000×g离心30min得沉淀物为胶原蛋白；
s8.将步骤s7所得胶原蛋白采用乙酸溶解，并用乙酸作为透析液进行透析，进一步地透析用乙酸浓度为0.1mol/l，透析时间为72h，每6～10h更换一次乙酸透析液，冷冻干燥后至-20℃保存待用；
s9.二次酶解：取步骤s8所得中华鳖背甲胶原蛋白，按胶原蛋白质量10～15倍添加ph为7.4浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，再加入250～300u/g木瓜蛋白酶，并在50℃下搅拌5h，冷冻干燥后备用；
s10.离子交换层析：取二次酶解后的中华鳖背甲胶原蛋白，按料液比10:1mg/ml溶解于0.05mol/l、ph6的tris缓冲液，吸光值214nm、温度10℃、每分钟上涨0.1mol的速度使其达到1mol/lnacl条件下进行线性梯度洗脱，流速为1ml/min，接取出cp-1峰样品，冷冻干燥后即得高抗氧化中华鳖背甲胶原蛋白肽。
实施例3
制备方法为省略步骤s4的热水浸提，其他同实施例2。
对比例1
制备方法为省略步骤s4的热水浸提，其他同实施例1。
取实施例1、2、3以及对比例1所得样品进行抗氧化活性检测(以oh·和dpph·清除率来表征抗氧化活性)：
通过测定oh·清除率来测定上述中华鳖背甲胶原蛋白肽的抗氧化活性，分别将对比例1、实施例1、2、3的胶原蛋白肽样品溶解于0.5mol/l的醋酸溶液，分别配置成10mg/ml的溶液，以vc做阳性对照；在试管中分别加入10mmol/l水杨酸-乙醇溶液、酶解液、10mmol/lfeso4溶液、蒸馏水，最后加入100mmol/lh2o2启动fenton反应，摇匀后于510nm处测定吸光度a1；取0.5ml蒸馏水代替10mmol/lfeso4溶液，测得的吸光度为a2；取0.5ml蒸馏水代替酶解液，测得的吸光度为a3；分别测定3次
oh·的清除率＝[1-(a1-a2)/a3]×100％；
通过测定dpph·清除率来测定上述中华鳖背甲胶原蛋白肽的抗氧化活性，分别将对比例1和实施例1、2、3的胶原蛋白肽样品溶解于0.5mol/l的醋酸溶液，分别配置成10mg/ml的溶液，以vc做阳性对照。在10ml比色皿中依次加入4.0mldpph·溶液和鳖甲胶原蛋白肽，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(a)，吸光值记为a1，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为a2，对照试验只加dpph·的乙醇溶液，其吸光值记为a3；分别测定三次
dpph·清除率＝[1-(a1-a2)/a3]×100％。
测定结果如图1所示，未经热水浸提的酶解产物dpph自由基清除率为48.31±0.61％，oh自由基清除率27.21±0.16％；经热水浸提后酶解产物dpph自由基清除率为55.78±1.31％，oh自由基清除率34.19±1.42％；经二次酶解后，产物dpph自由基清除率为67.41±3.17％，oh自由基清除率为43.32±2.01％；经热水浸提与酶解后，产物dpph自由基清除率为75.66±0.16％，oh自由基清除率为61.31±2.91％；可见热水浸提对目标产物抗氧化基团或者结构的形成有利，能够提高dpph自由基和oh自由基清除率，同样二次酶解可使抗氧化基团或者结构形成，并且降低分子量提高酶解产物与自由基的反应几率从而提高抗氧化效果；而当热水浸提与酶解共同作用时，既进一步促进了中华鳖胶原蛋白肽形成抗氧化结构或者基团，同时分子量有效降低从而表现抗氧化性大大提高。由此可见经过本发明方法处理后中华鳖酶解产物抗氧化活性能够有效提高。此外由于本发明方法未使用盐酸来去除骨中的矿物质，因此本发明方法同样适用于无需除去矿物质的软体组织例如中华鳖裙边组织等，同时未使用盐酸还能防止软体组织中的胶原蛋白大量溶解于盐酸严重降低提取效率。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物工程技术领域的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。