本发明涉及分子生物学实验技术领域，具体涉及葱属主要蔬菜作物叶绿体dna提取方法及其质量评价体系的建立。
背景技术：
叶绿体是植物进行光合作用的半自助细胞器，参与了核苷酸、氨基酸、色素蛋白质等多种物质的代谢(陈春梅和陈亮,2014)，最早发现于自养生物蓝藻中，经过进化，以质体的形式存在于植物、藻类和部分原生生物中(neuhausandemes,2000)，随着植物分子生物学的发展，hans和walter(1962)证实了叶绿体基因组的存在。高等植物叶绿体基因组大多在120～160kb之间，其dna以共价、闭合和环状双链的形式存在，且叶绿体dna(chloroplastdna,cpdna)相对保守，已被广泛用于细胞质遗传、植物的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等多方面的研究(palmer,1985；duetal.,2017)。
随着高通量测序技术的发展，目前已完成叶绿体全基因组测序的绿色植物有1411种，而获得高质量的cpdna是开展进一步研究的基础(罗洪等,2015；常伟东等,2016)。目前，cpdna提取方法主要有高盐低ph值法(high-saltlow-ph,hslp)、蔗糖dnase法和密度梯度离心法(bookjansetal.,1984；shietal.,2012；triboushetal.,1998；vieiraetal.,2014)。已有的研究表明，高盐低ph值法具有较广泛的应用范围，已成功的应用于茶树(陈春梅和陈亮,2014)、甘蔗(岑华飞等,2014)、松柏(vieira,etal.,2014)、小麦(侯典云等,2011)、尾叶桉(黎金燕等,2017)、香蕉(龙兴等，2008)、割手密(田春艳等,2016)、芒果(张宇等,2017)等植物，蔗糖dnase法(sucdnase)已经应用到向日葵(triboushetal.,1998)等植物。葱属蔬菜作物富含类黄酮、多糖等次生代谢性物质，严重干扰了细胞器dna的提取效果，湘志新在《大葱叶绿体dna的分离纯化及分子杂交鉴定》中对大葱的心叶除去其管状叶内的粘液，捣碎粉碎，通过差速离心获叶绿体粗制品，在用蔗糖不连续梯度离心的方法纯化叶绿体，再经蛋白酶及sds处理后用酚抽提，乙醇沉淀的方法获得叶绿体dna；该方法步骤繁多还需要刮去粘液，操作繁琐、成本高，产率低，且梯度离心对设备要求高。因此，亟待开发一种可以快速、简单且安全地提取出高质量、高纯度葱属主要蔬菜作物叶绿体dna的方法。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种改进的高盐低ph值法来提取葱属蔬菜作物cpdna。盖树鹏在《大葱胞质雄性不育的rapd标记》硕士论文中用钝刀刮去葱粘液，利用高盐缓冲液提取cpdna，经差速离心、裂解、抽提蛋白质、纯化等步骤获得高纯度cpdna，但是dna产率在20μg/100g材料左右，但也是需要先刮去粘液，而且产率低。本发明的高盐低ph值法来提取葱属蔬菜作物cpdna，直接提取，不需要刮去粘液，操作过程简单方便；且dna产率高达48.2μg/100g材料，比盖树鹏方法的高出2.41倍；dna纯度较高，没有多糖、蛋白质等杂质的污染；cpdna含量高于蔗糖dnase法的5.05倍。
为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种高盐低ph值法来提取葱属主要蔬菜作物叶绿体dna的方法，包括以下步骤：
(1)将新鲜叶片黑暗处理后洗净、搅碎，放入匀浆器内并加入bufferi匀浆；
(2)过滤匀浆，离心；
(3)上述离心所得上清液再次过滤，离心，弃上清，保留沉淀，即得粗体叶绿体；
(4)沉淀中加入bufferii，悬浮定容，离心，保留沉淀。
(5)沉淀中加入bufferiii，悬浮，离心，保留沉淀，即得纯化的叶绿体。
本发明提取dna的方法是基于vieira等(2014)高盐低ph值法，筛选出适合于葱属蔬菜作物cpdna的提取方法以及试剂。
上述提取缓冲液配方为：
bufferi(ph3.8)：0.5-2mol/lnacl,0.25mol/lascorbicacid(vc),10mmol/lsodiummetabisulfite，0.0125mol/lborax,50mmol/ltris-hcl(ph8.0),7mmol/ledta,1％pvp-40,0.1％bsa；
bufferii(ph8.0)：0.5-2mol/lnacl,0.0125mol/lborax,1％pvp-40,50mmol/ltris-hcl(ph8.0),25mmol/ledta,0.1％bsa；
bufferiii：0.5-2mol/lnacl,100mmol/ltris-hcl(ph8.0),50mmol/ledta,10mmol/lβ-me；
优选的，上述bufferi、bufferii和bufferiii中nacl最优浓度为1.5mol/l。
优选的，步骤(1)中所述的新鲜叶片为45-55g；
进一步，优选的，步骤(1)中所述的新鲜叶片为50g；
优选的，步骤(1)中所述的黑暗处理时间为24-48h；
优选的，步骤(1)中所述的剪碎后的长度为0.4-0.6cm；
优选的，步骤(1)中所述的匀浆器内匀浆，匀浆器需提前预冷，匀浆时先低速匀浆20s一次，再高速匀浆15s两次；
优选的，步骤(2)中所述的过滤匀浆，其具体方法为：先用2层纱布过滤匀浆至预冷的烧杯中，再用1层miracloth过滤，将滤液分装到离心瓶中；
优选的，步骤(2)中所述的离心为4℃，200g离心8-12min；
优选的，步骤(3)中所述的过滤为2层miracloth过滤；
优选的，步骤(3)中所述的离心为4℃3220g离心8-12minmin；
优选的，步骤(4)中所述的离心为4℃3220g离心8-12minmin；
优选的，步骤(5)中所述的离心为4℃2000g离心8-12minmin；
根据葱属蔬菜作物富含类黄酮及多糖的特点，本发明中创造性的将常规高盐低ph值法缓冲液bufferi、bufferii、bufferiii中的nacl的浓度由1.25增加到1.5mol/l，使得提取的cpdna产率提高，这是由于nacl会影响细胞渗透压，葱属蔬菜作物富含多糖，细胞内渗透压较高，在缓冲液盐浓度相对低的情况下，细胞外渗透压低而使细胞和细胞器在匀浆液中吸水提前涨破而导致损失dna，本发明通过提高盐浓度，使提取缓冲液与细胞质溶液的相对渗透压差减小，从而dna损失减少；另一方面，同时，提高nacl浓度浓度，能够抑制许多dnase的活性，降低了dna被降解的风险；同时，nacl盐浓度的相对提高，缓冲液密度也随之提高，与蔗糖dnase法相比，导致了线粒体沉淀降低，进而减弱了线粒体dna对叶绿体dna的污染；随后结合优化的提取程序最终提取结果产率高、纯度高、无多糖、蛋白质等杂质的污染。
本发明提供一组葱属蔬菜作物细胞器和细胞核基因拷贝数评估的引物，所述细胞器基因为叶绿体基因matk基因和线粒体基因atp6，细胞核基因核基因lfy基因；所述基因引物序列分别为：matk基因上下游引物为seqidno.1和seqidno.2：atp6基因上下游引物为seqidno.3和seqidno.4；lfyr基因上下游引物为seqidno.5和seqidno.6。
上述引物在葱属蔬菜作物细胞器和细胞核基因拷贝数评估中的应用也在本发明保护范围之内。
本发明还提供了一种叶绿体dna含量的荧光定量比值评价体系，其方法是：以试剂盒提取的总dna作为对照，根据上述引物扩增的各细胞器基因和核基因的扩增效率计算两种方法叶绿体dna的提取效果，确定叶绿体dna提取方法。
上述评价体系在筛选叶绿体dna提取方法中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种高盐低ph法提取葱属主要蔬菜作物叶绿体dna的方法，其dna产率高，高达0.482μg/g·fw，即48.2μg/100g·fw，比盖树鹏在《大葱胞质雄性不育的rapd标记》中提取的叶绿体dna产率为20μg/100g，高出2.41倍；比蔗糖dnase法提取的cpdna产率0.059μg/g·fw高出8.17倍。
(2)本发明提供了一种高盐低ph法提取葱属主要蔬菜作物叶绿体dna的方法，提取的dna纯度高，没有多糖、蛋白质等杂质的污染；
(3)本发明提供了一种叶绿体dna含量的荧光定量比值评价体系，评估了高盐低ph法和蔗糖dnase法对大葱叶绿体dna提取效果，结果表明高盐低ph法优于蔗糖dnase法，即叶绿体dna含量评价表明了高盐低ph值法是蔗糖dnase法的5.05倍，高盐低ph法线粒体dna污染少于蔗糖dnase法。
(4)本方法应用于其他葱属蔬菜作物，也获得了较好的提取效果。且该方法快速、省时、低成本。
(5)本发明为今后葱属作物高效、高纯度、无核污染的叶绿体dna提取研究提供依据，为葱属蔬菜作物细胞器全基因组测序提供了方法基础。
附图说明
图1是nacl浓度梯度测试，其中m：dl15000dnamarker；1：2.0mol/l；2：1.5mol/l；3：1.0mol/l；4：0.5mol/l。
图2是两种方法提取cpdna电泳图片，其中m：dl15000dnamarker；1：采用的是高盐低ph法；2：采用的是蔗糖dnase法。
图3是叶绿体matk、线粒体atp6和核lfy特异性基因检测引物扩增的熔解曲线评估。
图4是叶绿体matk、线粒体atp6和核lfy特异性基因扩增的标准曲线及其样本检测。
图5是高盐低ph法提取不同葱属蔬菜作物叶片的cpdna电泳检测，其中m:15000bpmarker；1：大葱；2：大蒜；3：洋葱；4：韭菜。
具体实施方式
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1材料
章丘大葱2015b、洋葱108m、大蒜和韭菜采自山东省农业科学院蔬菜花卉研究所，组织类型为田间生长的成熟绿色叶片。
2试剂配制
2.1蔗糖dnase法缓冲液试剂
ste：0.4mol/lsucrose,50mmol/ltris(ph7.8),20mmol/ledta,0.2％bsa,0.2％β-me
st：0.4mol/lsucrose,50mmol/ltris(ph7.2),0.1％bsa
net：50mmol/ltris(ph8.0),50mmol/ledta,1.25mol/lnacl
2.2dna提取试剂
100mmol/ltrisph8.0、50mmol/ledtaph8.0、500mmol/lnacl、20％sds、苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)、异丙醇、75％乙醇、te、dnasei、植物dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京，dp321-03)。
实施例1高盐低ph法(参考vieira,etal.,2014)
缓冲液试剂为：
bufferi(ph3.8):1.5mol/lnacl,0.25mol/lascorbicacid(vc),10mmol/lsodiummetabisulfite，0.0125mol/lborax,50mmol/ltris-hcl(ph8.0),7mmol/ledta,1％pvp-40,0.1％bsa；
bufferii(ph8.0):1.5mol/lnacl,0.0125mol/lborax,1％pvp-40,50mmol/ltris-hcl(ph8.0),25mmol/ledta,0.1％bsa；
bufferiii：1.5mol/lnacl,100mmol/ltris-hcl(ph8.0),50mmol/ledta,10mmol/lβ-me。
步骤为：
a.取新鲜叶片50g，黑暗处理24-48h，用无菌双蒸水冲洗干净，并用吸水纸吸除残余水分，将叶片剪成0.5cm长度大小，放入预冷的匀浆器内，加入400mlbufferi,低速匀浆20s一次，高速匀浆15s两次。
b.用2层纱布过滤匀浆至预冷的烧杯中，再用1层miracloth过滤，将滤液分装到离心瓶中，4℃200g离心10min。
c.将上清液通过2层miracloth过滤到新的离心管中，4℃3220g离心15min，弃上清，沉淀即为粗提叶绿体。
d.在沉淀中加入2ml预冷的bufferii，充分悬浮沉淀后，定容到40ml，4℃3220g离心10min，弃上清。
e.沉淀中加入20mlbufferiii,充分悬浮沉后，4℃，2000g离心10min，弃上清液，沉淀即为纯化的叶绿体。
f.纯化的叶绿体提取dna的方法采用sds法，参考(shi,etal.,2012)。0.8％琼脂糖凝胶在0.5×tbe电泳缓冲液中电泳，eb染色观察并拍照。
实施例2不同浓度nacl处理
本实施例与实施例1不同之处在于，省略了步骤d和e，且将bufferi中nacl的浓度分别设为2.0mol/l、1.5mol/l、1.0mol/l和0.5mol/l，即通过获得叶绿体粗体物后直接进行dna提取过程，来筛选nacl浓度对提取量的影响。
由图1可以看出，在0.5-2.0mol/l的nacl浓度梯度间，随着nacl浓度的提高，其dna的产率逐渐提高，在0.5mol/l到1.5mol/l时存在着显著差异，1.5mol/l到2.0mol/l差异较小。因此，本发明选取最优的nacl浓度为1.5mol/l。
对比例1蔗糖dnase法(triboush,etal.,1998)
a.样本处理同高盐低ph值法，缓冲液为ste、st和net(配制如上述2.1蔗糖dnase法缓冲液试剂)。
b.粗提叶绿体沉淀用2mlstebuffer彻底悬浮后，定容到40ml，4℃3200g离心15min，弃上清。
c.每0.1g沉淀用200μlst悬浮，加入0.02mol/lmgcl2，终浓度25μg/mldnasei，37℃消化20min，消除核dna。
d.加入edta至终浓度0.2mol/l，混匀后，静置10-20min，终止消化。
e.向反应液中加入net至离心管最大体积，4℃3220g离心10min，除去dnasei，沉淀即为纯化的叶绿体。
f.纯化的叶绿体提取dna的方法采用sds法，参考(shi,etal.,2012)。0.8％琼脂糖凝胶在0.5×tbe电泳缓冲液中电泳，eb染色观察并拍照。
由图2可以看出，两种方法提取的cpdna分子量相似，均大于15kbp，并且没有多糖、蛋白质和rna等杂质的污染。但是在植物样本鲜重、溶解体积和上样量相同的条件下，高盐低ph值法提取的cpdna电泳条带亮度远大于蔗糖dnase法，与产率检测结果一致，图4的结果进一步证明了高盐低ph值法的有益效果。
实施例3两种方法提取的dna纯度及产量的测定
利用分光光度计，测定od230、od260和od280的值并计算产率。
由大葱cpdna的od260/od280、od260/od230及浓度值(表1)可知，两种方法提取的cpdnaod260/od280值均大于1.8，od260/od230值约为2，上述参数表明，两种方法提取的dna纯度较高，与琼脂糖凝胶电泳图片一致。进一步的产率分析表明，高盐低ph法提取的cpdna产率为0.482μg/g·fw(freshweight，fw)，蔗糖dnase法的产率为0.059μg/g·fw，高盐低ph法是蔗糖dnase法的8.17倍。由此可见，高盐低ph法提取的大葱cpdna产率明显高于蔗糖dnase法。
表1两种方法提取cpdna纯度及产率
实施例4dna拷贝数检测
方法参考(hao,etal.,2014)，首先利用pcr技术扩增叶绿体基因matk、核基因lfy和线粒体基因atp6的片段，本发明设计了多套细胞器评估引物，优选引物序列分别为：matk基因上下游引物为seqidno.1和seqidno.2：atp6基因上下游引物为seqidno.3和seqidno.4；lfy基因上下游引物为seqidno.5和seqidno.6，通过对样本进行pcr检测，发现本发明引物扩增效果稳定，熔解曲线峰值对应的熔点温度一致(如图3)。试验结果证明这组引物可以很好的应用于大葱细胞器的拷贝数检测(如图4)，然后以pcr产物为标准品，同时制备三个片段的标准曲线，获得扩增效率e值。叶绿体提取效果(叶绿体dna与核dna的比值)评价公式为(1)，将总dna(totaldna,tdna)样本设为对照，效果设为1，数字越高，叶绿体dna含量越高，lfy基因设为参考基因。线粒体基因残留分析公式为(2)，对照样本同样为tdna，不同之处在于参考基因变为matk，两种统计均采用pfaffl法进行相对定量分析，公式(1)获得的数值为不同方法获得的样本与总dna样本中叶绿体提取效果的比值，其公式(2)为线粒体残留分析，随后，将待测样本浓度根据预实验结果均稀释至10倍使之处于标准曲线之内(haoetal.,2014)。
(1)
(2)
反应体系为：ddw8μl，mix10μl，上下游引物各0.5μl，模板1μl，共20μl；反应程序为：95℃3min，变性95℃10s，60℃10s，72℃20s，共39个循环，72℃10min，4℃保存。
从叶绿体matk、线粒体atp6和核lfy特异性基因扩增的标准曲线，可以看出他们的扩增效率分别为90.1％、93.8％和92.9％，并且r2均大于0.99(图4)。以试剂盒提取的总dna作为对照，根据各细胞器引物的扩增效率计算两种方法叶绿体dna的提取效果，确定叶绿体dna提取方法。高盐低ph法和蔗糖dnase法提取叶绿体dna的效果与试剂盒提取效果的比值分别为78.38和15.51，高盐低ph法是蔗糖dnase法的5.05倍。然而，两种方法的提取样本中，均含有不同程度的线粒体dna污染(表2)，从污染程度分析，高盐低ph法为0.87，蔗糖dnase法为2.49，高盐低ph法线粒体dna污染程度远小于蔗糖dnase法和kit法。
表2两种方法对cpdna提取效果的比较
注:cq＝quantificationcyclevalues，循环数；e＝efficiencyofamplification，扩增效率；hslp＝highsaltlowph，高盐低ph法；sucdnase＝蔗糖dnase法；kit＝总dna提取试剂盒。对比例2
本发明设计的另外引物组：matk基因上下游引物为seqidno.7和seqidno.8：atp6基因上下游引物为seqidno.9和seqidno.10；lfyr基因上下游引物为seqidno.11和seqidno.12，对实施例4中叶绿体基因matk、核基因lfy和线粒体基因atp6的片段样本进行pcr检测，扩增条件与实施例4相同。
通过扩增表明，该引物组扩增不稳定，易出现非特异性扩增和二聚体现象，无法进行拷贝数检测试验。
所以本发明的引物组可以很好的应用于葱属蔬菜作物细胞器和细胞核基因拷贝数评估。
实施例5高盐低ph值法在不同葱属蔬菜作物叶绿体dna提取中的应用评估
为了验证高盐低ph值法对不同葱属蔬菜作物叶绿体dna样本提取的适用性，随后我们测试了洋葱、大蒜、韭菜样本。高盐低ph值法提取的样本，点样孔清晰，dna带清晰明亮无弥散现象，该方法可以用于多个葱属蔬菜作物叶绿体dna的提取研究(图5)。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
sequencelisting
<110>山东省农业科学院蔬菜花卉研究所
<120>葱属主要蔬菜作物叶绿体dna提取方法及其质量评价体系的建立
<130>2010
<160>12
<170>patentinversion3.3
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