本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种pedv和tgev引物序列及二重rt-pcr的检测方法。
背景技术：
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,tgev)是引起猪病毒性腹泻的主要病原，均具有较强的传染性，尤其以哺乳仔猪的易感性最强，致死率高。两种病毒均属于冠状病毒属成员，在致病性和流行病学上极为相似，以呕吐、腹泻、脱水为主要特征，病理变化相似，临床上不易分辨。两种病毒极易感染仔猪，具有相似的临床症状、流行病学和病理变化，并常常出现混合感染。因此，仅仅依靠临床观察难以将其区分，需要结合实验室诊断。
近年来，pedv在我国多个省市的发病率呈上升趋势，是困扰养猪业的主要疾病之一。自2010年冬季以来，我国10多个省市爆发pedv，病猪表现出水样腹泻、急性肠炎、呕吐等典型症状，死亡率极高，给我国养猪业造成重创，引起了养猪业的高度重视。这次疫情的主要致病原是pedv，然而，从一些病死猪体内也分离出tgev。
因此，研究一种高效、快捷的诊断技术来区分pedv和tgev是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种根据pedve基因序列及tgevn基因分别设计pedv及tgev的引物，通过采用二重rt-pcr的检测方法能够高效、快捷的分辨出pedv和tgev。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种pedv和tgev的二重rt-pcr检测的引物序列，
pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
tgev的引物序列序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4。
优选地，pedv及tgev的引物序列根据pedve基因序列及tgevn基因设计获得。
本发明还提供一种对于pedv和tgev的二重pt-pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：从猪肠道组织样品中提取总rna；
步骤(2)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板并采用引物序列进行pcr反应，获得pcr产物；将pcr产物经过琼脂糖胶电泳后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
本发明有益效果：本发明中通过采用根据pedve基因序列及tgevn基因分别设计pedv及tgev的引物序列，通过二重pt-pcr的检测方法，且改变pcr的反应程序，获得了一种能够快速且精确的检测并分辨出pedv及tgev的方法。
优选地，步骤(3)中所述pcr反应程序为90℃-95℃预变性2-3min；92℃-95℃变性26-32s；48℃-62℃退火26-30s；70℃-73℃延伸1-3min；共35个循环；最后70℃-73℃延伸6-10min；在3℃-5℃保存。
优选地，步骤(3)中所述pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；58.1℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃-5℃保存。
优选地，步骤(2)中所述猪肠道组织样品选自猪粪便和小肠组织。
优选地，步骤(3)中所述琼脂糖胶为1％-3％的琼脂糖胶，所述电泳电压为110v，电泳时间为30-35min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二重rt-pcr的检测方法，通过采用本发明中的两种引物经过pcr反应，高效、快捷的分辨出pedv和tgev。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明中实施例1-8中的pcr产物经琼脂糖凝胶的电泳图；
图2附图为本发明中对比例1中的pcr产物经琼脂糖凝胶的电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种对于pedv和tgev的二重pt-pcr检测方法。
实施例1
对于pedv和tgev的二重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev引物序列如下：tgev的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；48.0℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
实施例2
对于pedv和tgev的二重pt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev引物序列如下：tgev的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；50.1℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
实施例3
对于pedv和tgev的二重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev引物序列如下：tgev的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；51.7℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
实施例4
对于pedv和tgev的二重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev引物序列如下：tgev的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；53.7℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
实施例5
对于pedv和tgev的二重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev引物序列如下：tgev的引物序列序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；56.0℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
实施例6
对于pedv和tgev的二重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev病毒引物序列如下：tgev病毒的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；58.1℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
实施例7
对于pedv和tgev的二重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev引物序列如下：tgev的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；60.9℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
实施例8
对于pedv和tgev的二重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev病毒引物序列如下：tgev的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；62.0℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
附图2为实施例1-8的电泳图，从附图2中可以看出在53.7℃-62.0℃的范围内，能够较好的检测出两种病毒，从电泳图中可以看出在58.1℃时的条带是最清晰的，因此，最佳退火温度为58.1℃。
对比例1
步骤(1)：根据pedve基因序列设计pedv引物序列如下：pedv的引物序列为序列1：atgctacaattagtgaatg，seqidno:1；序列2：ttatacgtcaataacagtac，seqidno:2；
根据tgevn基因设计tgev引物序列如下：tgev的引物序列为序列3：tagacaaactcgctatcgca，seqidno:3；序列4:ttctatctggtcgccatctt，seqidno:4；
步骤(2)：采用rna小量制备试剂盒，从感染tgev、pedv、hcv、prv及rv的猪肠道组织中提取总rna；
步骤(3)：将步骤(2)中提取的总rna反转录为cdna，以cdna为模板进行pcr反应，获得pcr产物；pcr反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；58.1℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将pcr产物经过琼脂糖胶在电压为110v下电泳35min后，用geldoctmxr紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。
附图2为对比例1的电泳图，1-5分别为tgev、pedv、hcv、prv及rv，从图中看出，两种引物能够检测的tgev及pedv，而对于对比例1中的hcv、prv及rv在附图中无条带，不能够检测出其病毒。
样本检测
将2014年1月至2016年12月收集的135份疑似患有pedv和tgev的仔猪肠道组织样片总rna，分别采用常规的rt-pcr为对照组和实施例6中的二重pcr检测方法为试验组检测pedv和tgev。结果如表1
表1
通过表1中，可以得出采用本发明中最优的实施例6检测的样本更加精确，而采用常规的方法并不能检出pedv及tgev混合的病毒。表明本发明中的检测方法灵敏度高。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110>龙岩学院
<120>一种pedv和tgev引物序列及二重rt-pcr的检测方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>porcineepidemicdiarrheavirus
<400>1
atgctacaattagtgaatg19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>porcineepidemicdiarrheavirus
<400>2
ttatacgtcaataacagtac20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>porcinetransmissiblegastroenteritisvirus
<400>3
tagacaaactcgctatcgca20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>porcinetransmissiblegastroenteritisvirus
<400>4
ttctatctggtcgccatctt20