本发明属于遗传育种技术领域,具体涉及一种与长牡蛎快速生长相关的snp位点。
背景技术：
长牡蛎(crassostreagigas)又称太平洋牡蛎，是世界上养殖范围最广、产量最大的海产经济贝类，也是我国重要的传统养殖品种。目前我国长牡蛎养殖业稳定发展的同时也开始面临诸多严峻问题：随着养殖集约化的不断提高及海洋环境污染和赤潮等问题的频繁出现，长牡蛎的养殖环境日益恶化；由于不规范的累代养殖导致近亲交配，养殖长牡蛎的种质退化现象日趋严重，出现了生长慢、出肉率低、死亡率增高等问题，严重影响长牡蛎产业的可持续发展；随着消费水平的提高和市场竞争的加剧，国内外的消费市场对长牡蛎的品质要求不断提升。因此，培育优质、高产、抗逆的优良品种，是我国长牡蛎产业健康可持续发展的必由之路。
随着分子生物学与基因组学的发展，长牡蛎的育种研究也正在经历由传统的选择、杂交育种到基于基因组信息的分子育种的转变。基于基因组的分子育种核心内容是对基因型和表型多态性的研究，其中单核苷酸多态性(snp)标记因其分布广(尤其是在基因区也有分布)、可实现高通量检测等优点，逐渐成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从dna水平上进行选择育种，克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素，提高了选择的准确性,并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。通过发现与长牡蛎快速生长有关的基因，提高快长亲本的筛选效率，并可预测后代的生长性状，提高优良品种的育种效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种与长牡蛎快速生长相关的snp位点标记及其应用。
本发明首先提供一种与长牡蛎生长相关的snp位点，所述的snp位点位于基因lob的外显子中，是序列为seqidno:1的自5'端起第341位，其碱基为g或t；此标记的基因型个体的gg型壳宽显著大于tt基因型和tg基因型个体(p<0.05)，改变了氨基酸序列的构成(ttg/ttt)，由亮氨酸变成了苯丙氨酸(leu/phe)。
本发明再一个方面提供一种用于检测上述snp位点的方法，是使用引物对来扩增待检测样品的核酸，再通过测序确定是否存在snp位点；
所述的引物对，其一种核苷酸序列信息如下：
正向引物f1：caacagtcgtgagagacagc(seqidno:2)；
反向引物r1：cctagacaatgaacgtac(seqidno:3)；
本发明还提供一种用于检测上述snp位点的试剂盒，所述的试剂盒包含上述的引物对。
本发明所提供的snp位点用于筛选长牡蛎育种亲本；其一种具体的操作方法如下：
1)提取待检样品基因组dna；
2)以提取得到的dna为模板，利用特异性引物对进行pcr扩增,得到pcr产物；
3)对pcr扩增产物进行测序，根据测序结果确定样品的snp标记的基因型来筛选快速生长亲本；即筛选snp标记为gg的基因型的个体。
本发明所发现的snp标记的应用，可大大降低长牡蛎亲本筛选的盲目性，可以快速获得生长速度快且遗传稳定的长牡蛎个体用来育种或育苗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：与长牡蛎快速生长相关的标记的获得
1、在长牡蛎基因组全测序完成的基础上，申请人通过gwas关联分析技术得到与生长相关的基因—bhlh家族。对长牡蛎bhlh家族进行了分类，包括a到f组共89个基因，在此基础上选择了5个候选基因用重测序的方法进行snp的筛选，选择417个个体的野生群体。所得到的63个位点再在288个个体的野生群体中用基因芯片的方法进行验证，最后用生物学软件进行与生长性状关联分析得到newchr4_588155snp标记。newchr4_588155标记的基因型个体的gg型壳宽显著大于tt基因型和tg基因型个体，位于基因lob的外显子中(seqidno:1)，改变了氨基酸序列的构成(ttg/ttt)，由亮氨酸变成了苯丙氨酸(leu/phe)。
2、长牡蛎snp位点不同基因型与生长性状的关联分析
417个个体的野生群体长牡蛎，分别测得壳高、壳长、壳宽、全体重和软体重这5个指标，所有的测量数据均符合正太分布。利用重测序的方法对lob基因上newchr4_588155标记在417个长牡蛎个体进行snp分型后,用spss分析了不同基因型和壳高、壳长、壳宽、全体重和软体重进行关联分析。发现gg型个体的壳高、壳长、壳宽、全体重和软体重均大于tt和tg型个体。
3、288个个体的野生群体长牡蛎，分别测得壳高、壳长、壳宽、全体重和软体重这5个指标，所有的测量数据均符合正太分布。利用基因芯片的方法对lob基因上突变位点在288个长牡蛎个体进行snp分型后,用spss分析了不同基因型和壳高、壳长、壳宽、全体重和软体重进行关联分析。发现gg型个体的壳高、壳长、壳宽、全体重和软体重均大于tt和tg型个体。
表1长牡蛎个位点不同基因型在两个群体中与生长性状的关联分析
注：表中数值为平均值士标准误差,同一列不同上标字母表示差异显著(p<0.05)。
实施例2：snp标记在筛选快速生长的长牡蛎亲本中的应用
制作评估筛选快速生长长牡蛎亲本snp标记的试剂盒，用于检测lob基因的snp位点newchr4_588155。
该试剂盒含有所需检测snp位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物的试剂，其中，位点newchr4_588155的特异性扩增引物序列为seqidno:2和seqidno:3，该试剂盒还包括相应技术所需的常用试剂如，(10×pcr(含mg2+)缓冲液，dntp(10mm)，双蒸水，酶等。另外还可以有标准品和对照如确定基因)。
扩增反应体系包括：cdna1.0μl，10×pcr(含mg2+)缓冲液2.5μl，浓度10mm的dntp2.0μl，浓度10μm的上游引物1.0μl，浓度10μm的下游引物1.0μl，浓度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，双蒸水：17.3μl；扩增条件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；将扩增pcr产物进行测序进行基因分型。
利用试剂盒来检测snp位点，对快速生长的长牡蛎亲本进行筛选，包括如下步骤：
(1)从待测亲本中剪取外套膜边缘样品，提取dna；
(2)以提取得到的dna为模板，利用特异性引物进行初次pcr扩增，得到初次pcr产物；
扩增反应体系包括：cdna1.0μl，10×pcr缓冲液(含mg2+)2.5μl，浓度10mm的dntp2.0μl，浓度10μm的上游引物1.0μl，浓度10μm的下游引物1.0μl，浓度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，双蒸水：17.3μl；扩增条件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；引物为
正向引物f1：caacagtcgtgagagacagc(seqidno:2)；
反向引物r1：cctagacaatgaacgtac(seqidno:3)；
将初次获得的pcr产物进行测序，获得测序结果后根据结果确定待测长牡蛎lob基因的snp标记的基因型是否为gg纯合体来筛选长牡蛎快速生长个体。
结果显示，经过snp试剂盒筛选出的牡蛎亲本育种之后的到的子一代共500个个体中，发现gg型个体的壳高、壳长、壳宽、全体重和软体重均大于tt和tg型个体()，证明此snp标记试剂盒是可以快速的选育优良性状的牡蛎亲本。
表2：筛选的亲本繁殖的子代的生长统计表
注：表中数值为平均值士标准误差,同一列不同上标字母表示差异显著(p<0.05)。
上述反应体系、反应条件和后续的基因分型及评估方法，可以根据本领域公知常识或者惯用技术手段进行变化或者替换。该试剂盒的价值在于快速得到有snp标记的长牡蛎亲本，从而进行分子标记辅助育种，提高优良品种的育种效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>浙江万里学院
<120>一种与长牡蛎快速生长相关的snp位点
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>831
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgtctgcaaacggctcaactacagtcaccgttaaaatagaagagggggaggatagcggt60
gtctatggcatgaattcatcatgtgacttatctacgtcatttaactcttcggaacatcga120
tcccgagtccctgatgaaattcgactgcgcatcaacagtcgtgagagacagcgcatgcac180
gaattgaacgacgctctgatggcattaaggagtgtgttaccccaatctcagggatcgtcc240
ctaaagaaactctccaaacagtctacccttgtacatgcgcgggaacacatcctatctcta300
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tcagacagtttatgttactctttgccgcatgatgacactaccagctatcagatcacgtca660
gcgccatcggacactgacaggagaaatcccccagaattccatattccctcaaagtaccag720
aattccacatcaacaaaacccgttctgaagttttccgtagattcgttacttggactttca780
aataaatgtgatggtgattctccagtgaaaagcgttgacattatgtgttag831
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
caacagtcgtgagagacagc20
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cctagacaatgaacgtac18