一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法与流程

本发明属于原位杂交
技术领域：
，具体涉及一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交的方法。
背景技术：
：红螯螯虾(cheraxquadricariratus)，俗称澳洲淡水龙虾，原产澳大利亚北部热带区域和新几内亚南部，隶属于光壳虾属，具有生长快、抗逆强、肉质细嫩、出肉率高等特点，是世界淡水名贵经济虾类之一。和其他淡水十足类动物一样，红螯螯虾雄性个体比雌性生长得更快、体型也更大。红螯螯奸已经得到了广泛的养殖尤其是在近十年来由于其生物学特性比较明显，红螯螯奸的养殖业发展的速度很快。然而，目前对于该虾性表型分化和二态性发育的机制尚不清楚。原位杂交组织(或细胞)化学(insituhybridizationhistochemistry，ishh)简称原位杂交(insituhybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的dna或rna为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法，广泛应用于实验室分析mrna在生物组织内的分布和富集程度。因此建立适用于红螯螯虾性腺组织的石蜡切片mrna原位杂交技术，对性别决定相关基因进行组织定位和功能研究，有助于加快揭示与阐明红螯螯虾性别决定与分化的分子作用机制，从而推动螯虾性别控制育种技术的发展。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种对dsx基因的显示有明确的特异性，实现了对dsx基因mrna水平的显示作用的适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交用探针的方法。本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：本发明提供一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交用探针的方法，按照如下步骤：s1步骤：以逆转录得到的红螯螯虾性腺组织cdna为模板，利用引物通过pcr反应扩增得到dsx基因的部分orf序列，该序列作为dsx基因mrna特异的探针序列；s2步骤：构建dsx基因mrna原位杂交的探针质粒，将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；s3步骤：制备dsx基因mrna原位杂交探针。红螯螯虾的性别决定双性基因都是dsx的同源基因，双性基因dsx处于性别决定信号通路最下游，相对上游性别决定重要基因来说，其相当保守，变化的仅仅是其拼接形式；且调控拼接的拼接增强或抑制因子以及与之相结合的反式作用元件，在同一亚目内几乎没变化，不同亚目间有规律可循。优选地，dsx基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。优选地，引物的正向引物为：5’-gaattctaatacgactcactataggga-3’；反向引物为：5’-cctatagtgagtcgtattaaagctt-3’。本发明探针对dsx基因的显示有明确的特异性，实现了对dsx基因mrna水平的显示作用。一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交用探针，采用上述方法制得。优选地，探针序列为如seqidno.3所示。本发明的另一个目的在于提供一种石蜡切片脱蜡效果佳，酶解效果好，杂交信号强，细胞着色好，能够清晰地描述翘嘴鲌性别相关基因在性腺中的表达定位，准确性高的适于红螯螯虾性腺组织mrna冰冻切片原位杂交的方法。本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：本发明提供一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交的方法，包括性腺组织包埋、石蜡切片、原位杂交和拍照记录，原位杂交采用上述探针。优选地，原位杂交包括如下步骤：1)石蜡切片脱蜡：将切片依次用二甲苯、无水乙醇、85％酒精、75％酒精、depc水洗进行脱蜡；2)消化：将水洗后切片于修复液中煮沸，自然冷却后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶k消化，冲洗；3)预杂交：将消化后切片上滴加预杂交液，孵育；4)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液，杂交过夜后洗涤；3)封闭：滴加封闭血清bsa，倾去封闭液，然后滴加anti-dig-hrp，孵育；4)dab显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色；5)复染细胞核：用苏木素染液复染，水洗后经1％盐酸酒精分化，水洗，氨水返蓝，冲洗；6)封片：中性树胶封片。优选地，二甲苯中含有0.03-0.06％三氯乙醛和2.8-3.0％苯芴醇。三氯乙醛和苯芴醇的存在一方面促进甲苯快速溶解用于支撑组织和细胞的石蜡，在石蜡切片脱蜡效果佳的同时避免组织收缩和细胞变形，使得组织仍保持在原位，组织形态保持完完整；另一方面能够增加抗体对细胞膜的通透性，在dab显色和苏木素染液复染的过程中，使得细胞着色好，核质分明，结构清晰，组织、细胞更加透明清晰，便于观察，提高原位杂交的准确性；此外，还能增加dna链的韧性，避免dna链与蛋白质形成复合物而阻碍蛋白酶的消化，提高酶解效果，最终提高原位杂交的准确性。优选地，探针杂交液的浓度为50ng/ul。优选地，性腺组织包埋包括如下步骤：将组织取出洗净后立即放入固定液中固定2-12h，固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明探针对dsx基因的显示有明确的特异性，实现了对dsx基因mrna水平的显示作用；本发明在红螯螯虾中建立了石蜡切片mrna原位杂交的方法来研究相关基因在性腺中的表达模式，能够清晰地描述红螯螯虾性别相关基因在性腺中的表达定位，对于性别调控基因的鉴定具有重要的意义；本发明方法在石蜡切片脱蜡效果佳的同时避免组织收缩和细胞变形，使得组织仍保持在原位，组织形态保持完完整，还能提高酶解效果，使得细胞着色好，核质分明，最终提高原位杂交的准确性。本发明采用了上述技术方案提供一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交的方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。附图说明图1是本发明实施例1中红螯螯虾dsx基因在性腺组织中的石蜡切片原位杂交分析的示意图。具体实施方式下面，结合具体实施例对本发明一实施方式的一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交的方法作进一步说明。实施例1：一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交用探针的方法，按照如下步骤：s1步骤：根据翘嘴鲌dsx基因编码区序列设计构建dsx探针载体的引物序列，正反向引物分别带有ecori和xhol酶切位点，如下所示：正向引物为：5’-gaattctaatacgactcactataggga-3’，反向引物为：5’-cctatagtgagtcgtattaaagctt-3’；s2步骤：以逆转录得到的红螯螯虾性腺组织cdna为模板，利用引物通过pcr反应扩增得到dsx基因的部分orf序列，该序列作为dsx蛋白特异的探针序列，pcr方法为94℃4min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，32cycle；72℃延伸7min，利用axygen凝胶回收试剂盒纯化目的片段；s3步骤：将目的片段和pbluescriptiisk载体用ecori和xhol进行双酶切处理，反应体系如表1所示，加完试剂后混合充分，37℃水浴中消化4h，结束后进行纯化；表1双酶切反应体系组分体积目的片段或载体3μg10×hbuffer7μlecori3.5μlxhol3.5μlddh2o补充至70μls4步骤：将酶切后的载体和目的片段于16℃水浴中连接，随后转化、测序，通过序列分析鉴定到正确的重组质粒；s5步骤：选择ecori或xhol对质粒进行单酶切，37℃水浴酶切4h，得到线性化的重组质粒，并用axygen的cleanup试剂盒进行纯化。随后以此为模板，转录带地高辛标记的反义rna探针，具体体系如表2所示，加完试剂后混合均匀，37℃水浴反应2.5h，紧接着加入2μlrna酶free的dnasei消化质粒模板，37℃孵育20min，之后加入2μl的0.2medta，冰上静置待消化反应终止；表2转录rna探针反应体s6步骤：消化结束后，使用miniquickspinrnacolumns(roche)对rna探针进行纯化，并对纯化产物进行电泳和浓度检测，最后剩余样品加入等体积去离子甲酰胺，轻混分装后置于-80℃保存，制得dsx基因的mrna原位杂交探针。红螯螯虾的性别决定双性基因都是dsx的同源基因，双性基因dsx处于性别决定信号通路最下游，相对上游性别决定重要基因来说，其相当保守，变化的仅仅是其拼接形式；且调控拼接的拼接增强或抑制因子以及与之相结合的反式作用元件，在同一亚目内几乎没变化，不同亚目间有规律可循。上述dsx基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交用探针，采用上述方法制得。上述探针序列为如seqidno.3所示，具体为：gaattctaatacgactcactatagggatggctatggcgcctaagaagaaattcgattttttcaatggtggtcggggaattgtcctgaccgacacaactgatgtggaagaatcgtctgtagagcagcagccaccagagcccaaggtagtgcaggagtcttatggttatggaggcgactatgggcgctactctggttcttccgagggctacgtaacccccagctctcctgggggctatatgcctccagggggctatgtcccccccagatctccagggggctatgtcgtccccagatctccagggggctgtgtgtcctctagatctccaggggagtatgtgccccctgacagcccgaatgttcatcagtaccacggtgaccctatagtgagtcgtattaaagctt。实施例2：一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交的方法，包括性腺组织包埋、石蜡切片、原位杂交和拍照记录，原位杂交采用上述探针。上述原位杂交包括如下步骤：1)组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液(depc水配制)中固定2-12h；2)脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋；3)切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62℃烤箱烤片2h；4)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-depc水洗；5)消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10-15分钟，自然冷却后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶k(20ug/ml)37℃消化30min，纯水冲洗后pbs洗3次×5min；6)预杂交：滴加预杂交液，37℃孵育1h；7)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液，浓度50ng/ul，恒温箱37℃度杂交过夜；8)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×ssc，37℃洗10min，1×ssc，37℃洗2×5min，0.5×ssc室温洗10min，若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤；9)滴加封闭液：滴加封闭血清bsa，室温30min；10)滴加鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti-dig-hrp)：倾去封闭液，滴加anti-dig-hrp。37℃孵育40min，后pbs洗4次×5min；11)dab显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色；12)复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，1％盐酸酒精分化数秒，自来水洗，氨水返蓝，流水冲洗；13)封片：中性树胶封片；14)显微镜检，图像采集分析，结果如图1所示，图1中左图为精巢，右图为卵巢，信号在精巢，由此可知，dsx基因在精巢中信号较强，而在卵巢未能检测到信号，表明dsx基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。实施例3：为了提高石蜡切片脱蜡效果，进一步的优化方案为：石蜡切片脱蜡至水步骤中二甲苯中含有0.03-0.06％三氯乙醛和2.8-3.0％苯芴醇。三氯乙醛和苯芴醇的存在一方面促进甲苯快速溶解用于支撑组织和细胞的石蜡，避免组织收缩和细胞变形，使得组织仍保持在原位，组织形态保持完完整；另一方面能够增加抗体对细胞膜的通透性，在dab显色和苏木素染液复染的过程中，使得细胞着色好，核质分明，结构清晰，组织、细胞更加透明清晰，便于观察，提高原位杂交的准确性；此外，还能增加dna链的韧性，避免dna链与蛋白质形成复合物而阻碍蛋白酶的消化，提高酶解效果，最终提高原位杂交的准确性。上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。序列表<110>浙江省淡水水产研究所<120>一种适于红螯螯虾性腺组织mrna石蜡切片原位杂交的方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gaattctaatacgactcactataggga27<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cctatagtgagtcgtattaaagctt25<210>3<211>402<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaattctaatacgactcactatagggatggctatggcgcctaagaagaaattcgattttt60tcaatggtggtcggggaattgtcctgaccgacacaactgatgtggaagaatcgtctgtag120agcagcagccaccagagcccaaggtagtgcaggagtcttatggttatggaggcgactatg180ggcgctactctggttcttccgagggctacgtaacccccagctctcctgggggctatatgc240ctccagggggctatgtcccccccagatctccagggggctatgtcgtccccagatctccag300ggggctgtgtgtcctctagatctccaggggagtatgtgccccctgacagcccgaatgttc360atcagtaccacggtgaccctatagtgagtcgtattaaagctt402当前第1页12