基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及一种肿瘤诊断试剂盒，具体涉及一种基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒。

背景技术：

vonhippel-lindau(vhl)疾病(omim193300)是一种常染色体显性遗传综合征，具有在各种器官系统中发展各种良性和恶性肿瘤的可能。其遗传是由位于染色体上的vhl基因中的种系突变引起的，表现出显著的表型变异性、年龄依赖性外显率以及家族间变异。vhl特征性肿瘤包括：中枢神经系统(cns)和视网膜血管母细胞瘤(hbs)、透明细胞肾癌、神经内分泌肿瘤、胰腺囊肿、嗜铬细胞瘤等。大多数患有vhl的患者会感染cns-hbs，发病率介于34.3％至72％之间。

vhl疾病发生在世界各地的各个个民族。两性均受到同等影响，患病率为1：30,000～1：50,000(近似发生率为1：36,000)，其中，80％的基因变异发生在复制父母的基因以生育婴儿的过程中，20％的新突变发生在以前并没有vhl改动的过程中。这种“从头突变”大约发生了4,400,000例，很少患者可能有体细胞镶嵌现象，这使得诊断更加困难。

vhl基因中的种系突变或畸变已被确定为导致该疾病的根本原因。vhl突变数据库中列出了超过1500种不同的种系突变(http://www.umd.be:2020/)。除了导致vhl2c型的突变外，vhl基因的所有突变似乎易于发生特征性hbs。然而，目前还不清楚未知的修饰基因和环境的影响。基因型-表型相关性的研究表明，通过错义、无义/缺失以及移码的等位基因失活导致了vhl-hbs肿瘤的发生。

然而，我们发现了这样一个案例：一个家族中有三名hbs患者，他们具有vhl疾病的临床表型，但该疾病并不是由于vhl基因突变引起的，而是由于发生了体细胞高甲基化介导的等位基因vhl失活造成的，也就是说，这样的血管母细胞瘤是一种血管母细胞瘤的新亚型，即基因印记亚型血管母细胞瘤，与先前vhl基因突变型的最大的区别，该亚型不遵守孟德尔遗传规律。

及时确定hbs患者及其高危人群是否是基因印记亚型血管母细胞瘤，对于病人的预后和治疗意义至关重要，因为该亚型有一定的可逆转性和使用目前的某些药物可治疗性(属于基因表观修饰范畴)。但是，现有技术中还无法实现对基因印记亚型血管母细胞瘤的诊断。

技术实现要素：

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒。

本发明提供了一种基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒，具有这样的特征，包括：用于在甲基化特异性pcr中对vhl启动子进行扩增的引物组，该引物组包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物，其中，所述第一引物的序列如seqno:1和seqno:2所示，所述第二引物的序列如seqno:3和seqno:4所示，所述第三引物的序列如seqno:5和seqno:6所示，所述第四引物的序列如seqno:7和seqno:8所示。

在本发明提供的基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒中，还可以具有这样的特征，还包括：用于对所述基因组dna进行亚硫酸氢盐处理的试剂。

在本发明提供的基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒中，还可以具有这样的特征，还包括：pcr缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及taqdna聚合酶。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒，因为包括引物组，该引物组包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物，通过该引物组能够在甲基化特异性pcr中对受试者基因组dna中的vhl启动子进行扩增，通过对扩增后的vhl启动子进行甲基化序列分析能够诊断出受试者是否患有基因印记亚型血管母细胞瘤。

附图说明

图1是本发明的实施例三中vhl基因的四个特定基因座；

图2是本发明的实施例三中采用基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒对基因印记亚型血管母细胞瘤患者进行检测的检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒作具体阐述。

以下实施例中所使用的qiaampdnaminikit(qiageninc，chatsworth，ca)、wizard基因组dna纯化试剂盒(promega,madison,wi,u.s.a.)均为市售试剂盒。

<实施例一>

本实施例提供了一种基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒，该试剂盒包括：用于对基因组dna进行亚硫酸氢盐处理的试剂、用于在甲基化特异性pcr中对vhl启动子进行扩增的引物组、pcr缓冲液以及三磷酸脱氧核苷酸以及taqdna聚合酶。

其中，用于对基因组dna进行亚硫酸氢盐处理的试剂包括：2mnaoh、3m亚硫酸氢钠以及10mm氢醌。这三种试剂分别盛放在不同的容器中。

引物组包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物。

第一引物包括第一上游引物和第一下游引物，其中，第一上游引物的序列如seqno:1所示，第一下游引物的序列如seqno:2所示。

第二引物包括第二上游引物和第二下游引物，其中，第二上游引物的序列如seqno:3所示，第二下游引物的序列如seqno:4所示。

第三引物包括第三上游引物和第三下游引物，其中，第三上游引物的序列如seqno:5所示，第三下游引物的序列如seqno:6所示。

第四引物包括第四上游引物和第四下游引物，其中，第四上游引物的序列如seqno:7所示，第四下游引物的序列如seqno:8所示。

上述引物的浓度均为0.8mm。

pcr缓冲液为1×pcr缓冲液(购自newenglandbiolabs)。

三磷酸脱氧核苷酸的浓度为2.5mm。

taqdna聚合酶的浓度为2.5u。

<实施例二>

本实施例提供了一种利用实施例一中的基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒对人的组织或血液进行基因印记亚型血管母细胞瘤诊断的方法。

该方法包括以下步骤：

步骤一、基因组dna提取。

使用qiaampdnaminikit(qiageninc，chatsworth，ca)提取受试者组织或外周血的基因组dna，然后使用wizard基因组dna纯化试剂盒(promega,madison,wi,u.s.a.)对进行基因组dna纯化。

步骤二、亚硫酸氢盐处理。

取纯化后的基因组dna1μg，用2mnaoh变性，然后在3m亚硫酸氢钠和10mm氢醌中于55℃温育17小时，然后使用epitectbisulfite试剂盒(axygen)对基因组dna进行亚硫酸氢盐处理得到修饰dna。

步骤三、甲基化特异性pcr。

pcr体系包括：1×pcr缓冲液(newenglandbiolabs)、三磷酸脱氧核苷酸(各2.5mm)、引物组(各0.8mm)、50ng修饰dna以及2.5utaqdna聚合酶(newenglandbiolabs)。

pcr循环条件为：每次循环95℃120s，60℃15s，72℃30s，共进行25次循环。

步骤四、测序。

将每个pcr加载(20μl)到含有溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上，并在uv照射下显现。从凝胶上切下未甲基化和甲基化的产物，使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen)纯化，并在appliedbiosystemsprism377dna测序系统上测序。

步骤五、结果判定。

根据测序结果，判断vhl启动子的甲基化cpg位置是包括如图1所示的vhl基因的四个特定基因座，如果判断结果为是，则表明该受试者患有基因印记亚型血管母细胞瘤。

<实施例三>

本实施例为采用实施例一中基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒并按照实施例二中的诊断方法对三组受试者的组织或血液进行基因印记亚型血管母细胞瘤诊断实验。

三组受试者包括：实验组、阳性对照组以及阴性对照组。

其中，实验组包括三名已确诊的因印记亚型血管母细胞瘤患者，这三名患者都没有vhl基因突变且都患有血管母细胞瘤。阳性对照组包括三名已确诊的vhl基因突变的血管母细胞瘤患者。阴性对照组包括三名身体健康的志愿者。

在本实施例中，分别采集三组受试者的5ml血液作为实验样本进行实验。

以上所有受试者的样本采集均经复旦大学华山医院伦理委员会同意，并与受试者签署知情同意书。

实验结果如下：

图2是本发明的实施例三中采用基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒对基因印记亚型血管母细胞瘤患者进行检测的检测结果图。

如图2所示，图2(a)为实验组三名受试者的vhl启动子的甲基化cpg位置示意图；图2(b)为实验组三名受试者的vhl启动子的甲基化cpg位置与vhl基因的四个特定基因座进行比对的对比图。由图2(a)可以看出，三名受试者有四个共享的甲基化cpg位置(见methylatedsitestogether)；由图2(b)可以看出，该四个共享的甲基化cpg位置分别对应vhl基因的四个特定基因座。即，实验组三名受试者的vhl启动子的甲基化cpg位置都包括vhl基因的四个特定基因座，因此诊断结果为因印记亚型血管母细胞瘤患者。

阳性对照组以及阴性对照组均不同时具有上述四个共享的甲基化cpg位置(见methylatedsitestogether)，即仅具有上述四个共享的甲基化cpg位置中的零个或一个或两个或三个。

实施例的作用与效果

根据实施例一所涉及的基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒，因为包括引物组，该引物组包括第一引物、第二引物、第三引物以及第四引物，通过该引物组能够在甲基化特异性pcr中对受试者基因组dna中的vhl启动子进行扩增，通过对扩增后的vhl启动子进行甲基化序列分析能够诊断出受试者是否患有基因印记亚型血管母细胞瘤，具有良好的临床应用前景和广泛的商业前景。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

序列表

<110>复旦大学附属华山医院

<120>基因印记亚型血管母细胞瘤诊断试剂盒

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgttatttaggttgtagtgtagtagtat28

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<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaaaacccatcatatttcctaccttcact29

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<400>3

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<212>dna

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<400>7

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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