藏獒分子标记的特异性引物及检测方法与流程

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及家犬品种藏獒单核苷酸变异及微卫星标记的特异性引物及检测方法技术领域。

背景技术：

藏獒(tibetanmastiff)隶属于食肉目犬科犬属灰狼种的家犬亚种(canislupusfamiliaris)，是青藏高原特有的家犬品种，主要分布于青藏高原及喜马拉雅山脉，包括尼泊尔、印度、不丹。历史上，藏獒主要被当地牧民饲养，用于保护畜牧牲口免于野外捕食动物的侵害。近年来，由于其独特适应高原的表型和能力备受市场追捧，过度贸易、错误引种、随意繁殖、人为炒作等市场行为使藏獒种质资源面临巨大威胁。为了科学保护藏獒种质资源，实现资源的可持续发展与利用，开展该种的特异遗传变异标记及群体遗传特征分析以及分子标记育种具有重要意义。目前，尚未见藏獒遗传分子标记开发的相关报道。

技术实现要素：

本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种藏獒分子标记用的特异性引物并交代了详细的检测方法，对藏獒犬的遗传特征、谱系地理格局、群体结构的分析，以及种质资源的科学保护与利用均具有重要的应用价值。

本发明采用如下技术方案实现。

一种snp分子标记引物，本发明该分子标记引物择一包含以下引物对；

tm-p1：f:tgcaaggaggaggaagaagg，

r:ctcccagtctcttgcctctg；

tm-p2：f:tgcaaggaggaggaagaagg，

r:ctcccagtctcttgcctctg；

tm-e：f:cattcagtcagcatttctgc

r:gggctgcaggttgcgagggt；

tm-m：f:ttcttacatggcagctggtg，

r:cttttccctgtgagctctgg；

tm-m1：f:gctgcaatccacaatgaaga，

r:atgcagtcagaaccccaagt；

tm-h1：f:gaggcttcaaatgccttgag，

r:catgccttaggggcagtaaa；

tm-h2：f:gaggcttcaaatgccttgag，

r:catgccttaggggcagtaaa；

tm-c：f:agtccccagaaggttccatg，

r:gcaaccggtggaaagtttct；

tm-s：f:ggcctccatgcttagctcta，

r:agcaccttacagactccacc；其中f为上游引物，r为下游引物。

一种snp分子标记引物组，本发明该引物组包含以下任意两组引物对及其以上的组合；tm-p1、tm-p2、tm-e、tm-m、tm-m1、tm-h1、tm-h2、tm-c、tm-s；具体序列如上述记载。

一种ssr分子标记引物，本发明该分子标记引物择一包含以下引物对；

tm-cas5：f:tccctcctcagcagagagtc，

r:aacctcagggctattcatttca；

tm-cas6：f:tccctctccctgtgtctctg，

r:caatccttgagcatgaaacg；

tm-cas7：f:actgtcctggtgccacctac，

r:caacatcctctcccctgaaa；

tm-cas8：f:ccacaaaagacccacccata，

r:cttcatggagcctgcttttc；

tm-cas9：f:gcttttgctgtgtcccaaag，

r:aactgtggccatcattagca；

tm-cas10：f:tggcaacatgctgaaagtgt，

r:aggtgggctctgtgaccata；

tm-cas11：f:ctccctctgcctgtcttctg，

r:cttgggtgcagagctagtcc；

tm-cas12：f:tacatcagcccctgctttct，

r:ttggctttagttcagatggaag；其中f为上游引物，r为下游引物。

一种ssr分子标记引物组，本发明该引物组包含以下任意两组引物对及其以上的组合；tm-cas5、tm-cas6、tm-cas7、tm-cas8、tm-cas9、tm-cas10、tm-cas11、tm-cas12；具体序列如上述记载。

一种结合snp和ssr分子标记引物组，本发明该引物组包含至少两组引物对，即：引物对a和引物对b；所述的引物对a为属于snp分子标记引物组中的引物对；所述的引物对b为属于ssr分子标记引物组中的引物对；snp分子标记引物组中的引物对为，tm-p1、tm-p2、tm-e、tm-m、tm-m1、tm-h1、tm-h2、tm-c、tm-s；具体序列如上述记载。属于ssr分子标记引物组中的引物对为，tm-p1、tm-p2、tm-e、tm-m、tm-m1、tm-h1、tm-h2、tm-c、tm-s；具体序列如上述记载。

使用上述引物或引物组的用途，该用途为鉴定或区分藏獒犬和其它家犬。

本发明提供一种藏獒单核苷酸标记的检测方法，包括以下步骤：

(1)、提取藏獒基因组dna；

(2)、以步骤(1)提取的基因组dna为模板，利用所述的藏獒单核苷酸标记的特异性引物中的每个单核苷酸多态位点的特异性引物分别进行pcr扩增；

(3)、利用abi3730测序仪对pcr扩增产物进行测序；

(4)检测单核苷酸多态位点。

本发明通过构建藏獒群体基因组数据库，筛选具有藏獒特异变异的单核苷酸多态位点，设计单核苷酸多态位点的特异性引物，并对这些单核苷酸多态位点在藏獒中的特异性进行了检测，开发了9个在藏獒中具有特异变异的单核苷酸多态位点。9个单核苷酸多态位点的编号分别为：tm-p1，tm-p2，tm-e，tm-m，tm-m1，tm-h1，tm-h2，tm-c，tm-s；其核苷酸序列分别如表1所示。

利用本发明中的藏獒单核苷酸标记的特异性引物对100个家犬样品(包含50只藏獒，50只其它犬种)进行了检测，结果表明，9个单核苷酸多态位点能够有效扩增，扩增效率达到100％，利用abi3730测序仪检测表明，9个单核苷酸多态位点均表现出藏獒特异的变异，说明本发明中的9对单核苷酸标记的特异性引物能够用于藏獒的品种遗传特征鉴定工作。

本发明公开了一组能够高效扩增藏獒群体单核苷酸标记的特异性引物及检测方法，且本发明的单核苷酸多态位点具有藏獒群体特异的变异，因此，本发明提供的藏獒单核苷酸标记的特异性引物及检测方法可应用于在藏獒的品种遗传特征鉴定等领域。

本发明提供一种藏獒微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取藏獒基因组dna；

(2)、以步骤(1)提取的基因组dna为模板，利用所述的藏獒微卫星标记的特异性引物中的每个微卫星位点的特异性引物分别进行pcr扩增；

(3)、利用abi3730测序仪对pcr扩增产物进行多态性检测。

本发明通过构建藏獒群体基因组数据库，筛选含有微卫星序列的dna序列，设计微卫星位点的特异性引物，并对这些微卫星位点进行了多态性检测，开发了8个多态性丰富的藏獒微卫星位点。8个微卫星位点的编号分别为：tm-cas5，tm-cas6，tm-cas7，tm-cas8，tm-cas9，tm-cas10，tm-cas11，tm-cas12；其核苷酸序列分别如表2所示。

利用本发明中的藏獒微卫星标记的特异性引物对100个家犬样品(包含50只藏獒，50只其它犬种)进行了检测，结果表明，9个微卫星位点能够有效扩增，扩增效率达到100％，利用abi3730测序仪检测表明，9个微卫星位点均表现出丰富的多态性，具有藏獒特异的变异特征，且均符合哈迪-温伯格平衡。说明本发明中的9对微卫星标记的特异性引物能够用于藏獒的品种遗传特征鉴定、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等工作。

本发明公开了一组能够高效扩增藏獒群体微卫星标记的特异性引物及检测方法，且本发明的微卫星位点多态性丰富，具有藏獒群体特异的变异，因此，本发明提供的藏獒微卫星标记的特异性引物及检测方法可应用于在藏獒的品种遗传特征鉴定、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等领域，为下一步分子遗传学研究奠定了基础。

下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1a为本发明使用引物对tm-e扩增所得的单核苷酸pcr产物的琼脂糖胶电泳图。

图1b为本发明使用引物对tm-m扩增所得的单核苷酸pcr产物的琼脂糖胶电泳图。

图1c为本发明使用引物对tm-m1扩增所得的单核苷酸pcr产物的琼脂糖胶电泳图。

图2为采用本发明方法分辨藏獒和其它家犬的示意图。

图3为采用本发明方法分辨藏獒亚群体的示意图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例：

一、藏獒基因组dna的提取

1、试剂配制：

消化缓冲液：称取tris1.2114g，edta37.224g，sds5g，用灭菌超纯水定容只1000ml(终浓度为tris10mmol/l，edta0.1mol/l，sds0.5％)，调节至ph值至8.0，4度保存备用。

2、dna抽提：

分别提取100个家犬血液样品200μl，加400μl消化缓冲液，40μl蛋白酶k(10mg/ml)，混匀后于55℃消化5小时；消化清透后，加入600μl水饱和酚，轻轻颠倒混匀30分钟，6000rpm/min离心10分钟，抽提上清；再加入300μl水饱和酚，300μl氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀30分钟，6000rpm/min离心10分钟，抽提上清；再加入600μl氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀30分钟，6000rpm/min离心10分钟，抽提上清；再加入800μl预冷的异丙醇，于-20℃静置过夜，13000rpm/min离心10分钟，弃上清；再加预冷的70％乙醇，小心吹打洗涤沉淀，13000rpm/min离心10分钟，弃上清；晾干乙醇，加入50μl超纯水溶解沉淀，置于-20℃保存备用。

二、藏獒特异单核苷酸及微卫星分子标记的挖掘

通过大规模基因组测序构建家犬群体基因组数据库，通过比较藏獒群体和其它家犬群体的基因组差异，鉴定藏獒特异的单核苷酸多态位点变异以及藏獒基因组受选择区域的微卫星位点。

三、特异性引物设计

用primer3软件设计单核苷酸和微卫星引物，引物退火温度控制在50℃以上。单核苷酸pcr产物长度控制在350～800bp之间，微卫星pcr产物长度控制在150～500bp之间。

8个单核苷酸多态位点tm-p1，tm-p2，tm-e，tm-m，tm-m1，tm-h1，tm-c，tm-s和1个插入缺失变异位点tm-h2的引物序列、突变类型、退火温度如表1所示。

表1.8个单核苷酸多态位点及1个插入缺失变异位点的特异性引物序列、突变类型及退火温度

表中f表示上游引物，r表示下游引物。

8个微卫星位点cast5,，cast6，cast7，cast8，cast9，cast10，cast11，cast12的引物序列、核心重复、退火温度如表2所示。

表2.8个微卫星位点特异性引物序列、核心重复及退火温度

表中f表示上游引物，r表示下游引物

四、单核苷酸多态位点引物及微卫星引物在家犬群体中扩增

利用本发明的单核苷酸多态位点引物及微卫星引物对100只家犬样本进行pcr扩增。pcr反应体系如表3所示：

表3.pcr反应体系

pcr反应程序如表4所示。

表4.pcr反应程序

五、琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物

1、试剂配制：

10×tbe：54.495gtris，27.81g硼酸，14.615gedta，ph调至8.0～8.2，定容至500ml(终浓度0.9mol/ltris，0.9mol/l硼酸，0.1mol/ledta)，高压灭菌，室温保存备用；

0.5×tbe：量取50ml10×tbe溶液，加超纯水定容至1000ml，室温保存备用。2、制胶：

称取0.2g琼脂糖粉，加0.5×tbe定容至100ml(终浓度2％)，高温溶解，凝胶凝固。

3、电泳

1、单核苷酸pcr产物10μl，加入5μl6×loadingbuffer，混匀后上样，电泳。电压120v/cm，恒压电泳40分钟。

2、微卫星pcr产物1μl，加入0.5μl6×loadingbuffer，混匀后上样，电泳。电压120v/cm，恒压电泳40分钟。

部分pcr产物的琼脂糖胶电泳如图1a、1b、1c所示，由于篇幅关系，只提供部分pcr产物的琼脂糖胶电泳图。dnamacker为dl2000(从上到下依次是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)

六、单核苷酸pcr产物测序

1、pcr产物回收：

在紫外灯照射下，将目的条带切下，放入干净ep管中，按照通用“dna产物纯化回收试剂盒”提供的步骤回收及纯化。

2、将回收产物作为dna模板分别用正下游引物进行测序反应，反应体系如表5所示。

表5.测序反应体系

测序反应程序如表6所示。

表6.测序反应程序

3、纯化测序反应产物：

吸取30μl预冷的75％异丙醇，加入测序反应产物，混匀后于-20℃放置30分钟。

4℃环境下以3800rpm/min的速度离心30分钟。

弃上清，烘干测序反应产物。

加入75μlddh2o，4℃放置2小时溶解。

4、测序：

通过abi3730测序仪进行测序。

七、等位基因型分析

八、利用seqman软件分析snp位点的等位基因型

九、单核苷酸多态位点的遗传学参数计算

用plink软件计算等位基因频率、观测杂合度和期望杂合度；检测位点是否符合哈迪-温伯格平衡；评估位点在藏獒群体和其它家犬群体的分化程度，计算fst值。本发明用上述方法获得9个单核苷酸多态位点标记，各单核苷酸多态位点的遗传学参数如表7所示，所有位点均在藏獒和其它家犬群体间表现出高分化，并且都符合哈迪-温伯格平衡。

表7.单核苷酸多态位点在家犬群体中的遗传学参数

九、微卫星pcr产物长度测定

1、pcr产物变性：

吸取900μlhidye放入ep管中，加入7.4μl的liz500分子内标，混匀后分装到96孔板，每孔加9μl混合液。

吸取1μlpcr产物加入分装好的hidye混合液中

95℃变性10分钟

马上放入-20℃冷却5分钟

4℃放置2小时

2、pcr产物长度测定

通过abi3730测序仪进行长度测定

十、微卫星位点的遗传学参数计算

用genescan软件读取每个微卫星pcr产物的长度；用genealex软件计算等位基因数、群体分化系数fst，哈迪-温伯格平衡；用cervus3.0软件计算每个微卫星位点的多态信息含量。本发明用上述方法获得8个微卫星标记，各微卫星位点的遗传学参数如表8所示，所有位点均为高度多态性位点(多态信息含量>0.5)，并且都符合哈迪-温伯格平衡(p>0.05)。

表8.微卫星位点在家犬群体中的遗传学参数

十一、整合单核苷酸多态位点和微卫星位点信息聚类家犬个体

用structure软件分析每个家犬个体的单核苷酸多态位点和微卫星位点遗传信息，并以此将所有家犬个体进行聚类分析。本发明用上述方法获得9个单核苷酸多态位点标记，8个微卫星标记，整合17个位点的遗传信息通过structure软件进行mcmc分析，如图2所示分辨藏獒和其它家犬，如图3所示分辨藏獒亚群体。

图2.17个位点的聚类分析，假设有2个群体。

图3.17个位点的聚类分析，假设有3个群体。

以上所述的仅是本发明的具体实施例，方案中公知的具体参数等常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

<110>云南中科藏獒种质资源技术开发有限公司

<120>藏獒分子标记的特异性引物及检测方法

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