功能化的孔板、其制备和使用方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年9月21日提交的题为“功能化的孔板、其制备和使用方法”的美国临时申请号62/734,924；以及于2019年8月29日提交的题为“功能化的孔板、其制备和使用方法”的美国临时申请号62/893,712的权益，其中每一个的公开内容均通过引用整体并入本文。

发明背景

免疫疗法为成功治疗癌症提供了一种潜在的强大方法。由呈递抗原的树突状细胞导致的t淋巴细胞活化是制备用于免疫疗法的靶向肿瘤的细胞毒性t淋巴细胞的一方面。由树突状细胞导致的活化可以通过使用更可重现和可以更好表征的技术来改善。本发明的一些实施方案包括配置为活化t淋巴细胞的孔板的经修饰的表面、使用此类经修饰的表面来活化t淋巴细胞的相关方法以及包含此类被活化的t淋巴细胞的组合物。

技术实现要素：

在第一方面，提供了一种孔板，其包括具有第一区域的表面，该第一区域是呈递反应性部分的共价功能化的区域或呈活化部分的共价功能化的区域，其中该反应性部分是叠氮基部分、生物素部分或链霉亲和素部分，并且该活化部分是淋巴细胞活化部分。第一区域的面积可以为至少0.5mm²(例如，约0.5mm²至约50mm²，约1.0mm²至约40mm²，约2mm²至约35mm²，约3mm²至约30mm²或者约4mm²至约25mm²)。第一区域可以是基本上是圆形的，并且其直径为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm或者约1.5mm至约3.0mm)。第一区域的各个反应性部分或活化部分的密度可以为至少50/um²。反应性部分或活化部分可以经由连接基(例如有机连接基)共价连接至表面。连接基可以具有5至约20个主链原子、约10至约40个主链原子或约15至约50个主链原子，该主链原子选自碳、硅、氮和氧。孔板的表面可以还包括第二区域，该第二区域是包括表面封闭配体的共价修饰的区域。任选地，第二区域可以围绕第一区域。在一些实施方案中，每个表面封闭配体可以包括亲水性的或带负电荷的部分。在一些实施方案中，每个表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。孔板的表面可以包括玻璃或聚苯乙烯。在一些变型中，孔板的表面可以包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

在一些变型中，反应性部分可以是链霉亲和素，并且链霉亲和素官能团共价附接到孔板表面的第一区域。在其他变型中，反应性部分可以是链霉亲和素，并且链霉亲和素官能团非共价附接到生物素部分，该生物素部分本身共价附接到孔板表面的第一区域。

在一些变型中，第一区域可以是包含多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体的呈递活化部分的共价功能化的区域。表面的第一区域上的主活化分子配体与共活化分子配体的比率可以为约1:10至约2:1(例如，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1或者约1:2至约1:1)。在一些实施方案中，多个特异性结合的主活化分子配体中的每个配体可以包含主要组织相容性复合体(mhc)分子，其被配置为与t细胞的t细胞受体(tcr)结合。mhc分子可以是i类或ii类分子，并且可以还包括抗原肽。抗原肽可以是肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。在一些变型中，多个特异性结合的共活化分子配体中的每个配体可包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约100:1至约1:100(例如，约20:1至约1:20或者约3:1至约1:3)。在一些变型中，tcr共活化分子可以包括cd28结合蛋白(例如，cd80分子或抗cd28抗体)或其保留与cd28的结合能力的片段。在一些变型中，辅助tcr活化分子可以包括cd2结合蛋白(例如，cd58分子或抗cd2抗体)或其保留与cd2的结合活性的片段。

多个特异性结合的主活化分子配体在第一区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，并且任选地，在第一区域中的密度可以为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。多个特异性结合的共活化分子配体在第一区域中的密度为至少1×10²个分子/平方微米，并且任选地，在第一区域中的密度为约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

另一方面，提供了一种孔板，其中该孔板的一个或多个孔(例如，所有孔)中的每一个包括表面和其第一区域，其中该第一区域是呈递反应性部分的共价功能化的区域或者呈递活化部分的共价功能化的区域，就像如上文或本文其他部分所述的具有表面和第一区域的任何孔板一样。一个或多个孔中的每一个的第一区域可以位于相应的孔的底部表面上。每个第一区域的面积可以是一个或多个相应孔的底部表面的面积的小于约50％(例如，小于约40％，小于约30％，小于约25％，小于约20％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％)。在一些实施方案中，一个或多个孔中的每一个还包含第二区域，该第二区域是包括表面封闭配体的共价修饰的区域。每个第二区域可以任选地围绕相应的孔的第一区域。第二区域的每个表面封闭配体(当存在时)可以包括亲水性的或带负电荷的部分。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。

另一方面，提供一种了孔板，其包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面。呈递叠氮基的共价功能化的区域可以包含孔板的部分或全部表面，或者可以分布在孔板的少于所有表面上。在一些变型中，孔板的一个或多个孔可以包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面。一个或多个孔中的每一个的呈递叠氮基的共价功能化的区域可以包含相应孔的整个表面(即内表面)，或者可以位于相应孔的底部表面上。孔板的表面或孔板的一个或多个孔的表面可以包含玻璃或聚合物，该聚合物可以是任何合适类型的聚合物。

在一些实施方案中，呈递叠氮基的共价功能化的区域的面积可以为至少0.5mm²(例如，至少1mm²，至少10mm²，至少100mm²，至少1000mm²，至少10,000mm²，至少100,000mm²，或者由上述端点中的两个所定义的任何范围)。呈递叠氮基的共价功能化的区域的叠氮基的密度可以为至少50/um²。在一些实施方案中，共价连接至表面的叠氮基官能团可以经由连接基连接，该连接基具有至少5个选自碳、硅、氮和氧的主链原子。例如，叠氮基官能团可以通过一系列5至约20个主链原子或约10至约40个主链原子或约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长的连接基或其间的任何数目的主链原子共价连接至表面。

另一方面，提供了一种孔板，其包括具有呈递生物素的共价功能化的区域的表面，并且该呈递生物素的共价功能化的区域可以包含孔板表面的一部分，和/或可以分布在孔板的少于所有表面上。在一些实施方案中，孔板的一个或多个孔可以包括具有呈递生物素的共价功能化的区域的表面。在一些实施方案中，一个或多个孔的呈递生物素的共价功能化的区域可以位于相应孔的底部表面上。孔板的表面或孔板的一个或多个孔的表面可以包含玻璃或聚合物，该聚合物可以是任何合适类型的聚合物。

在一些变型中，呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以为至少0.5mm²(例如，至少1.0mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10.0mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²或至少50mm²，或者由前述端点中的两个所定义的任何范围)。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以小于100mm²。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域的生物素官能团的密度可以为至少50/um²。在一些变型中，呈递生物素的共价功能化的区域可以包括经由连接基共价连接至表面的生物素官能团，该连接基具有至少10个选自碳、硅、氮和氧的主链原子。例如，连接基可以具有约5至约200个主链原子，或约10至约40个主链原子，或其间的任何数目的主链原子，该主链原子选自碳、硅、氮和氧。

在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以是一个或多个孔中的每一个的底部面积的约小于2％至约小于约50％。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域可以具有0.5至4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm)的尺寸。在各种实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且具有0.5至4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm)的直径。

在一些实施方案中，孔板的表面或者一个或多个孔中的每一个的表面可以还包括第二共价修饰的区域，该第二共价修饰的区域包括表面封闭配体。在一些实施方案中，每个表面封闭配体可以包括亲水性的或带负电荷的部分。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。在一些实施方案中，第二共价修饰的区域可以还包括至少一个配体，该配体提供刺激粘附的部分。

另一方面，提供了一种孔板，其包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面。呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以包括孔板表面的一部分，和/或可以分布在孔板的少于所有表面上。在一些变型中，孔板的一个或多个孔可以包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面。在一些实施方案中，一个或多个孔的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以位于相应孔的底部表面上。孔板的表面或者孔板的一个或多个孔的表面可以包含玻璃或聚合物，该聚合物可以是任何合适类型的聚合物。

在一些实施方案中，链霉亲和素官能团可以共价连接于孔板或者孔板的一个或多个孔的表面的共价功能化的区域。链霉亲和素官能团可以经由连接基共价连接至表面，该连接基具有约5至约200个主链原子，或约10至约50个主链原子，或其间的任意数目的主链原子，该主链原子选自碳、硅、氮和氧。当链霉亲和素本身共价连接至表面时，该连接可以经由与如本文所述的表面的任何呈递叠氮基的共价功能化的区域的叠氮基官能团的偶联。在一些其他实施方案中，链霉亲和素官能团可以非共价连接至生物素部分，该生物素部分本身如前所提及地共价连接至孔板或者孔板的一个或多个孔的表面的共价功能化的区域。

呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为至少0.5mm²(例如，至少1.0mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10.0mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，或至少50mm²，或由前述端点中的两个所定义的任何范围)。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以小于100mm²。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团的密度可以为至少50/um²。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为一个或多个孔中的每一个的底部表面的面积的小于约2％至小于约50％，或其间的任何面积。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以具有0.5至4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm)的尺寸。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且具有0.5至4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm)的直径。

在一些实施方案中，孔板或者一个或多个孔中的每一个的表面还可以包括第二共价修饰的区域，该第二共价修饰的区域包括表面封闭配体。在一些实施方案中，每个表面封闭配体可以包括亲水性的或带负电荷的部分。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。在一些实施方案中，第二共价修饰的区域可以还包括至少一个配体，该配体提供刺激粘附的部分。

另一方面，提供了一种孔板，其包括表面，该表面包括孔板的呈递抗原的共价功能化的区域，用于活化t细胞。呈递抗原的共价功能化的区域可以包含孔板表面的一部分，和/或可以分布在孔板的少于所有表面上。在一些实施方案中，孔板的一个或多个孔可以包括具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面。在一些实施方案中，一个或多个孔的呈递抗原的共价功能化的区域可以位于相应孔的底部表面上。

呈递抗原的共价功能化的区域可以包括多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体。共价功能化的区域上的主活化分子配体与共活化分子配体的比率可以为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1或者约1:2至约1:1。在一些变型中，多个特异性结合的主活化分子配体各自可以包括被配置为与t细胞的t细胞受体结合的主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)。在一些实施方案中，mhc分子可以包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。mhc分子的蛋白质序列可以通过蛋白质序列的c末端连接而与呈递抗原的合成表面连接。在一些实施方案中，包括mhc分子的多个主活化分子中的每一个还可以包含抗原肽，例如肿瘤相关的抗原肽、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。在一些实施方案中，抗原肽是肿瘤相关的抗原肽，其可以是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

在一些变型中，多个特异性结合的共活化分子配体各自可以包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约100:1至约1:100、约20:1至约1:20或者约3:1至约1:3。在一些实施方案中，tcr共活化分子可以包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。cd28结合蛋白可以是cd80分子或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性；抗cd28抗体或其保留与cd28的结合活性的片段。在一些实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括cd2结合蛋白或其保留与cd2的结合活性的片段。cd2结合蛋白可以是cd58分子或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性；或抗cd2抗体或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性。在一些实施方案中，多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体可以特异性结合至孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团，就像具有包括本文所述的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的任何孔板那样。

在一些实施方案中，在呈递抗原的共价功能化的区域中，多个特异性结合的主活化分子配体的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米或约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。在一些实施方案中，在呈递抗原的共价功能化的区域的呈递抗原的合成表面上，多个特异性结合的共活化分子配体的密度可以为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米或约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

另一方面，提供了一种活化t淋巴细胞(t细胞)的方法，其中该方法包括使多个t细胞与孔板表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触，从而多个t细胞中的至少一部分转化为活化的t细胞。呈递抗原的共价功能化的区域可以包括多个主活化分子配体，每个配体都包括主要组织相容性(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体(tcr)结合，并且此外，多个主活化分子配体中的每一个可以连接至表面。呈递抗原的共价功能化的区域可以还包括多个共活化分子配体，每个共活化分子配体包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子，并且每个共活化分子配体可以连接至表面。可以将多个t细胞与表面的呈递抗原的共价功能化的区域相接触地进行培养，从而将多个t细胞的至少一部分转化为活化的t细胞。t细胞可以包括cd8+t细胞。

呈递抗原的共价功能化的区域可以是孔板表面的第一区域，就像上文或本文其他地方所述的具有呈递活化部分的共价功能化的区域的任何孔板那样。

在一些变型中，多个共活化分子配体可以包括tcr共活化分子和辅助tcr活化分子。多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约100:1至约1:100，约20:1至约1:20或者约3:1至约1:3。

多个mhc分子中的每个分子可以包括i类mhc蛋白质序列、β微球蛋白蛋白质序列和抗原肽。在一些变型中，mhc分子的蛋白质序列通过c末端连接与表面的呈递抗原的共价功能化的区域连接。mhc分子可以包括生物素部分，并且可以通过与链霉亲和素的非共价相互作用而附接于表面的呈递抗原的共价功能化的区域。在一些实施方案中，链霉亲和素自身共价键合至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。在其他实施方案中，链霉亲和素可以与表面的呈递抗原的共价功能化的区域非共价缔合。当链霉亲和素与生物素部分非共价缔合时，生物素部分可以共价键合至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。

在一些变型中，抗原肽可以是肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。在一些实施方案中，抗原肽可以是肿瘤相关的抗原。在一些变型中，肿瘤相关的抗原可以是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

在一些变型中，多个共活化分子配体中的每一个可以连接至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。

在一些变型中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段；cd80分子或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性；或抗cd28抗体或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性。

在一些变型中，辅助tcr活化分子可以包括cd2结合蛋白或其保留与cd2的结合能力的片段。辅助tcr活化分子可以包括cd58分子或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性；或抗cd2抗体或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性。

在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中，多个特异性结合的主活化分子配体的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米。在一些实施方案中，在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中，多个特异性结合的主活化分子配体的密度可以为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中，多个特异性结合的共活化分子配体的密度可以为至少1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。在一些实施方案中，在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中，多个特异性结合的共活化分子配体可以具有约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的主活化分子配体与共活化分子配体的比率可以为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1或任选地约1:2至约1:1。在一些变型中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约3:1至约1:3。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约2:1至约1:2。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约1:1。

在一些变型中，该方法可以还包括使多个t细胞与多个刺激粘附的分子配体接触。多个刺激粘附的分子配体可以包括icam分子。

在一些变型中，该方法可以还包括使多个t细胞与多个生长刺激性分子配体接触。在一些实施方案中，每个生长刺激性分子配体可以包括生长因子受体配体。生长因子受体配体可以包括il-21或其片段。

在一些变型中，可以在至少一天的第一培养期之后，进行使多个t细胞与多个生长刺激性分子配体的接触。与呈递抗原的合成表面接触的培养可以进行约四天至约七天的时间。

在一些变型中，活化的t细胞可以是cd45ro+。在一些变型中，活化的t细胞是cd28阳性的。

在一些变型中，呈递抗原的功能化的区域的面积可以为孔板的孔的底部表面的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。

另一方面，提供了一种活化淋巴细胞的方法，该方法包括使多个淋巴细胞与孔板表面的呈递活化部分的共价功能化的区域接触，其中呈递活化部分的共价功能化的区域包括与表面连接的多个主活化分子配体；和与表面连接的多个共活化分子配体；以及培养该多个淋巴细胞，从而将该多个淋巴细胞的至少一部分转化为活化的淋巴细胞。淋巴细胞可以包括b细胞、t细胞或nk细胞。

呈递活化部分的共价功能化的区域可以是孔板的表面的第一区域，就像本文所述的包括呈递活化部分的共价功能化的区域的任何孔板那样。可以通过产生本文所述的具有包括淋巴细胞活化共价功能化的区域的表面的孔板的任何方法来制备包括表面的呈递活化部分的共价功能化的区域的孔板。

在一些变型中，主活化分子配体可以包括cd3结合分子或mhc分子。在一些实施方案中，多个mhc分子可以各自包含i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。mhc分子可以还包括抗原肽。在一些变型中，cd3结合蛋白可以是抗体或其保留结合亲合力的片段。

在一些变型中，多个共活化分子配体可以包括tcr共活化分子和辅助tcr活化分子。在一些变型中，多个共活化分子配体可以包括cd2结合分子和/或cd28结合分子。在一些变型中，在存在多于一种类型的共活化分子配体的情况下，不同的共活化分子配体的比率可以为约20:1至约1:20或约3:1至约1:3。

在一些变型中，在表面的呈递活化部分的共价功能化的区域中，多个特异性结合的主活化分子配体的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米或约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。在一些变型中，在表面的呈递活化部分的共价功能化的区域中，多个特异性结合的共活化分子配体的密度可以为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米或约1×10³至约l×10⁵个分子/平方微米。在呈递活化部分的共价功能化的区域中，主活化分子配体与共活化分子配体的比率为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1或者约1:2至约1:1。

在一些变型中，呈递活化部分的功能化的区域的面积可以为孔板的孔的底部表面的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。

另一方面，提供了一种用于制备孔板的试剂盒，所述孔板包括具有呈递活化部分的共价功能化的区域的表面，其中所述试剂盒包括孔板，所述孔板包括具有呈递反应性部分的共价功能化的区域的表面，其中所述反应性部分是叠氮基部分、生物素部分或链霉亲和素部分。试剂盒可以包括活化试剂。在一些变型中，试剂盒可以还包括表面功能化试剂。在一些变型中，包括具有呈递活化部分的共价功能化的区域的表面的孔板可以是如本文所述的具有呈递叠氮基的、呈递生物素的或呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的任何孔板。

在一些变型中，试剂盒可以包括表面功能化试剂，其中表面功能化试剂可以是被配置为与反应性部分反应的含生物素的试剂或含链霉亲和素的试剂。在一些实施方案中，试剂盒可以还包括含生物素的试剂和含链霉亲和素的试剂两者。

在一些变型中，活化试剂可以包括主活化试剂，该主活化试剂包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)或多个cd3结合分子，这些主要组织相容性复合体(mhc)分子被配置为与t细胞的t细胞受体结合，并被配置为与链霉亲和素的结合位点结合。

在一些变型中，试剂盒可以还包括共活化试剂，该共活化试剂包括多个共活化分子，每个共活化分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，并且其中每个共活化分子包括cd2结合分子或cd28结合分子。

附图简要说明

图1a至1c是根据本公开的一些实施方案用于将链霉亲和素结合部分引入到叠氮基功能化的孔板中的孔表面的示意图。

图1d是根据本公开的一些实施方案用于引入具有呈递链霉亲和素的共价连接的配体的表面的受限区域，并随后引入用于活化淋巴细胞的活化配体的示意图。

图2是根据本公开的一些实施方案的用于t细胞活化的活化途径的示意图。

图3a-3d是根据本公开的一些实施方案活化的t细胞的细胞群特征的图示。

图4a是表示用于多变量t细胞活化实验的实验条件的表。

图4b至图4c是从如图4a中设计的多变量t细胞活化实验得到的观察到的细胞表面标记物的示意图。

图5a-5d是根据本公开的一些实施方案活化的t细胞的细胞群特征的图示。

图6a是根据本公开的一些实施方案的孔板的表面的不同尺寸的呈递链霉亲和素的区域的图示。荧光标记的区域193、195、197示出了对尺寸和边界的精确控制。

图6b是根据本公开的一些实施方案引入的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的测量和计算的面积的图示。

图7a至图7d是根据本公开的一些实施方案活化的t细胞的细胞群特征的图示。

图8a-8d是根据本公开的一些实施方案活化的t细胞的细胞群特征的图示。

具体实施方式

本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于本文中示例性实施方案和应用的操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化的视图或局部视图，并且附图中的元件的尺寸可以被放大或者以其他方式不成比率。另外，由于在本文中使用术语“在……上”、“附接到”、“连接到”、“偶联到”或类似的词，所以一个元件(例如，材料、层、基板等)可以“在”另一个元件“上”、“附接到”、“连接到”或“偶联到”另一个元件，而不管该一个元件是否直接在另一个元件上、附接到、连接到或偶联到另一个元件，或者在该一个元件和另一个元件之间是否存在一个或多个介于其间的元件。另外，除非上下文另外指出，否则方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、下面、上面、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)，如果有的话，是相对的，并且仅以示例的方式提供，以便于说明和讨论，而不是以限制的方式提供。另外，在提及元件列表(例如，元件a、b、c)的情况下，这种提及意图包括任一个列出的元件本身、少于所有列出的元件的任何组合和/或所有列出的元件的组合。除非上下文另有指示，否则术语“或”以包括性含义使用，即等同于“和/或”。注意，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a、an)”和“该”以及任何单词的任何单数使用包括复数个指示物，除非明确地且肯定地限于一个指示物。如本文所用的，术语“包含”、“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得对列表中项目的叙述并不排除可以被替换或添加到列出的项目中的其他类似项目。说明书中的章节划分仅是为了便于阅读，并且不限制所讨论元件的任何组合。在通过引用并入的材料与本文提供的明确描述的内容之间存在任何矛盾或冲突的情况下，以明确描述的内容为准。

在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述尺寸，所述x轴和y轴尺寸均位于平行于微流体装置的基板和/或盖的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于与微流体装置的基板和/或盖平行的平面。在一些情况下，诸如通道或通路的微流体特征的横截面面积可以与x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积相关。

为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则应当在所有情况下将在说明书和权利要求书中使用的表示数量、百分比或比率的所有数字以及其他数值理解为被术语“约”修饰，如果尚未如此对其进行修饰的话。“约”表示基本上不影响所描述主题的性质的变化程度，例如，在10％、5％、2％或1％之内。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中提出的数字参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。最低限度地，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个数字参数应当至少被解释为考虑所报告的有效数字的数目并应用通常的四舍五入技术。

如本文所用的，“基本上”是指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许相对于绝对或完美的状态、尺寸、测量、结果等的微小的、不显著的变化，例如本领域普通技术人员所期望的但不会明显地影响总体性能的变化。当针对数值或参数或可表示为数值的特性使用时，“基本上”是指百分之十以内。

术语“一个”是指多于一个。如本文所用的，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。

如本文所用的，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。

无论是表示为平方微米、mm²还是mm2，所有这些标记均表示尺寸为微米×微米的面积的相同度量。

如本文所用的，术语“布置”在其含义中包括“定位”。

如本文所用的，术语“细胞”与术语“生物细胞”可互换使用。生物细胞的非限制性实例包括真核细胞、植物细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、鸟类细胞、鱼细胞等)、原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等、从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝、肺、神经组织等)解离的细胞、免疫细胞(例如t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等)、胚胎(例如，受精卵)、卵母细胞、卵、精子细胞、杂交瘤、培养的细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染的细胞、转染和/或转化的细胞、报道细胞等。哺乳动物细胞可以例如来自人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。

如果集落中所有能够繁殖的活细胞都是衍生自单个母细胞的子细胞，则该生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均通过不超过10次分裂衍生自单个母细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均通过不超过14次分裂衍生自单个母细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均通过不超过17次分裂衍生自单个母细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均通过不超过20次分裂衍生自单个母细胞。术语“克隆细胞”是指相同克隆集落的细胞。

如本文所用的，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如，约2至约20个、约4至约40个、约6至约60个、约8至约80个、约10至约100个、约20至约200个、约40至约400个、约60至约600个、约80至约800个、约100至约1000个或者大于1000个细胞。

如本文所用的，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供一种包含流体和气体组分两者以及任选的表面的环境，该环境提供使细胞保持存活和/或扩增所需的条件。

如本文所用的，术语“扩增”在指代细胞时是指细胞数目的增加。

如本文所用的，“合成表面”是指支撑结构与气态/液体介质之间的界面，其中合成表面是通过非生物方法制备的。合成表面可以具有与其连接的生物学来源的材料，例如本文所述的主活化分子和共活化分子，以提供呈递抗原的合成表面，前提是该合成表面不被生物有机体表达。通常，支撑结构是固体，例如珠、晶片或微流体装置的基板、盖或电路材料的非表面暴露部分，并且不包围生物核或细胞器。

如本文所用的，“孔板”是用于培养生物细胞的装置。孔板可以包括多个孔(例如，2、6、12、24、96、384或在其间的任何数目的孔)。或者，孔板可以包括单个孔，因此术语“孔板”可以涵盖传统的培养板(例如，圆形培养板)和培养瓶。孔板可以包括适于覆盖或盖住孔板的一个或多个孔的盖或帽。

如本文所用的，“链霉亲和素”通常是指以高亲和力与生物素结合并且与最初从细菌亲和素链霉菌分离的链霉亲和素蛋白具有结构和/或蛋白质序列同源性的任何蛋白质。这样，术语“链霉亲和素”涵盖保持与生物素结合的亲和素链霉菌链霉亲和素的突变形式和/或片段，以及保持与生物素结合的与亲和素链霉菌链霉亲和素同源的蛋白质(例如，亲和素)的生物素结合的突变形式和/或片段。链霉亲和素通常在结构上是四聚体，但是术语“链霉亲和素”也涵盖非四聚体形式。

如本文所用的，“共活化”是指生物大分子、其片段或其合成或修饰的形式与t细胞之间的结合相互作用(除了初级t细胞受体/抗原:mhc结合相互作用之外)，其增强生产性免疫应答，以产生t细胞的活化。共活化相互作用是例如能够参与细胞内信号传导的t细胞表面蛋白(如cd28、cd2、icos等)与其激动剂之间的抗原-非特异性相互作用。如本文所用的，“共活化(co-activation)”和“共活化(co-activating)”分别等同于术语共刺激(co-stimulation)和共刺激(co-stimulating)。

如本文所用的，“tcr共活化分子”是与t细胞上的一种或多种共受体结合的生物大分子、其片段或其合成或修饰的形式，所述共受体活化远端信号分子，所述远端传导分子扩增和/或完成由tcr的抗原特异性结合引起的应答。在一个实例中，诸如转录因子核因子κb(nfkb)和活化t细胞核因子(nfat)的信号传到分子被tcr共活化分子活化。tcr共活化分子可以是例如cd28受体的激动剂，其通过磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)/akt途径发出信号。参见图2。

如本文所用的，“cd28high”或“cd28(high)”是指t细胞中高cd28表面表达的表型。本领域技术人员熟悉cd28high表型和鉴别cd28hight细胞的合适方法。除非另有说明，否则cd28hight细胞包括满足以下任何标准的t细胞。在一些权利要求中，cd28hight细胞是比静止的cd8+t细胞表达更高水平的cd28的t细胞。cd28hight细胞还可以比无关的非抗原特异性t细胞表达更高水平的cd28。在一些权利要求中，cd28hight细胞是这样的群体：其中可以通过facs测量的表面cd28的水平等于或大于可以通过facs测量的存在于循环的记忆t细胞上的表面cd28的水平。在一些权利要求中，cd28hight细胞的表面cd28的水平等于或大于来自相同样品或个体的循环的记忆t细胞上存在的表面cd28的水平。表面cd28的表达可以通过facs测定，并且循环的记忆t细胞上存在的表面cd28的平均值(例如几何平均值)或中值水平可以用于确定给定的t细胞是否为cd28high。在一些权利要求中，cd28hight细胞是表达cd28的t细胞，其表达水平显著高于来自相同样品或个体的初始cd8t细胞的典型表达水平，例如高于初始t细胞的75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％或95％。可以通过已知方法例如流式细胞术将初始cd8t细胞鉴别和表征为表达可检测的cd28而很少或不表达cd45ro的cd8+细胞。

如本文所用的，“tcr辅助活化分子”刺激放大抗原特异性tcr相互作用并且不同于tcr共活化分子的信号分子的种类。例如，通过tcr近端信号传导复合物的磷酸化的tcr近端信号传导是tcr辅助活化分子可以起作用的一种途径。tcr辅助活化分子可以是例如cd2受体的激动剂。参见图2。

如本文所用的，“活化的t细胞”是已经经历了抗原(或其后代)并且能够对该抗原进行抗原特异性应答的t细胞。活化的t细胞通常对cd28、cd45ro、cd127和cd197中的至少一种是阳性的。

如本文所用的，“抗体”是指免疫球蛋白(ig)，并且包括多克隆和单克隆抗体；灵长类化的(例如，人化的)；鼠类；小鼠-人；小鼠-灵长类；和嵌合的；并且可以是完整分子、其片段(例如scfv、fv、fd、fab、fab'和f(ab)'2片段)，或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；并且可以天然存在或通过例如免疫、合成或基因工程产生。如本文所用的，“抗体片段”是指源自抗体或与抗体有关的片段，其与抗原结合并且在一些实施方案中可以被衍生化以表现出有助于清除和摄取的结构特征，例如，通过掺入半乳糖残基。这包括例如f(ab)、f(ab)’2、scfv、轻链可变区(vf)、重链可变区(vh)及其组合。

癌症的免疫疗法是一个有前途的发展，但在一些实施方案中，需要与治疗对象相容的特异性活化的t淋巴细胞。然而，目前使用呈递抗原的树突状细胞来活化t淋巴细胞存在一些不利方面。树突状细胞必须从供体来源获得，这限制了生产量。对于每个次序的t淋巴细胞活化，树突状细胞必须被熟化，这需要大约7天的前置时间。还需要辐照树突状细胞，这限制了可以进行这种处理的位置。

用孔板的一个或多个孔内的呈递抗原的合成表面代替呈递自体抗原的树突状细胞用于活化t淋巴细胞可以提供更大的再现性，以刺激和扩增用于治疗相关人群的t淋巴细胞。可以对孔板的呈递抗原的合成表面进行工程化，以实现t淋巴细胞的抗原特异性活化，从而提供具有用于治疗癌症的期望表型的活化t淋巴细胞的群体的可控的和/或可表征的和/或可再现的和/或更快速的发展。孔板的一个或多个孔的呈递抗原的合成表面还可以允许对t细胞活化进行更多的控制和选择性，包括在活化后更精确地靶向所需的t细胞表型，例如富集特定形式的记忆t细胞。此外，与使用呈递自体抗原的树突状细胞相比，孔板的一个或多个孔的呈递抗原的合成表面还可以利用规模经济和/或提供更大程度的可再现性。这样，该技术可以使细胞疗法可以更大的量和/或更少的时间用于需要该疗法的患者。对于患有晚期疾病的患者，更快地提供可用于细胞疗法的t细胞可能尤其重要。本文描述了孔板的一个或多个孔的这种呈递抗原的合成表面的结构及其制备和使用方法。在一些实施方案中，孔板的一个或多个孔的呈递抗原的合成表面包含与tcr共活化分子和/或辅助tcr活化分子组合的主活化配体，它们一起用于活化t细胞。本文还公开了可以进一步改善功效的这些组分的表面密度范围以及一种与另一种的比率。在一些实施方案中，孔板的一个或多个孔的呈递抗原的合成表面及其制备和使用方法提供了一个或多个前述优点。

此外，可以通过与如本文所述的孔板内的适当制备的活化淋巴细胞的共价功能化的表面接触来活化除t淋巴细胞以外的淋巴细胞。出于任何目的，包括免疫疗法和一般的细胞产生，可以使用本文所述的孔板的活化表面来活化和/或扩增b淋巴细胞和nk细胞。

为了在孔板的孔内提供活化淋巴细胞的合成表面，申请人已经发现并描述了具有限定的用于这种活化的区域的可控制地共价功能化的孔板。

因此，提供了一种孔板，其包括具有第一区域的表面，该第一区域是呈递反应性部分的共价功能化的区域或呈递活化部分的共价功能化的区域，其中所述反应性部分为叠氮基部分、生物素部分或链霉亲和素部分，活化部分是淋巴细胞活化部分。第一区域的面积可以为至少0.5mm²(例如，至少0.6mm²，至少0.7mm²，至少0.8mm²，至少0.9mm²，至少1.0mm²，至少1.1mm²，至少1.2mm²，至少1.3mm²，至少1.4mm²，至少1.5mm²，至少1.6mm²，至少1.7mm²，至少1.8mm²，至少1.9mm²，至少2.0mm²，至少2.5mm²，至少3.0mm²，至少3.5mm²，至少4.0mm²，至少4.5mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，至少75mm²，至少100mm²，至少150mm²，至少200mm²，至少250mm²，至少300mm²，至少400mm²，至少500mm²，至少600mm²，至少700mm²，至少800mm²，至少900mm²，至少1000mm²，或更高)。在一些实施方案中，例如其中呈递的反应性部分是生物素部分或链霉亲和素部分或者第一区域是呈递活化部分的共价功能化的区域的那些实施方案中，第一区域的面积通常小于100mm²，小于75mm²或小于50mm²。在其他实施方案中，例如其中反应性部分是叠氮基部分的那些实施方案中，第一区域的面积可以超过1000mm²，例如，第一区域的面积可以为至少2,000mm²，至少3,000mm²，至少4,000mm²，至少5,000mm²，至少6,000mm²，至少7,000mm²，至少8,000mm²，至少9,000mm²，至少10,000mm²，20,000mm²，至少30,000mm²，至少40,000mm²，至少50,000mm²，至少60,000mm²，至少70,000mm²，至少80,000mm²，至少90,000mm²，至少100,000mm²，或更高(例如，孔板的孔的基本上所有内表面，或者两个或更多个孔中的每一个)。在一些变型中，第一区域的尺寸可以为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。第一区域可以是基本上圆形的，并且其直径为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

孔板的表面可以还包括第二区域，该第二区域是包括表面封闭配体的共价修饰的区域。任选地，第二区域可以围绕第一区域。在一些实施方案中，每个表面封闭配体可以包括亲水性的或带负电荷的部分(例如，羧酸根基团)。在一些实施方案中，每个表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。

孔板的表面可以包括玻璃或聚苯乙烯。在一些变型中，孔板的表面可以包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

第一区域的各自反应性部分或活化部分的密度可以为至少50/um²，例如，约50个反应性部分或活化部分/um²至约8×10⁵/um²，约1×10²/um²至约8×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或者反应性部分或活化部分数目/um²为其间的任何值。包括各自的反应性部分或活化部分的第一区域可以经由连接基共价连接至表面，该连接基具有5至约20个主链原子，约10至约40个主链原子，约15至约50个主链原子或多于50个主链原子，其中主链原子选自碳、硅、氮和氧。因此，例如，反应性部分或活化部分可以通过一系列键长为约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200或其间的任何键长数的连接基共价连接至表面。

在一些变型中，反应性部分可以是链霉亲和素，并且链霉亲和素官能团共价附于孔板表面的第一区域。在其他变体中，反应性部分可以是链霉亲和素，并且链霉亲和素官能团非共价附接到生物素部分，该生物素部分自身共价附接到孔板表面的第一区域。

在一些变型中，第一区域可以是包括多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体的呈递活化部分的共价功能化的区域。表面的第一区域上的主活化分子配体与共活化分子配体的比率为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1，或者约1:2至约1:1。

在一些实施方案中，多个特异性结合的主活化分子配体中的每个配体可以包括被配置为与t细胞的t细胞受体(tcr)结合的主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)。mhc分子可以包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。在一些变型中，mhc分子可以通过c末端连接而与呈递活化部分的共价功能化的区域连接。

mhc分子可以还包括抗原肽。抗原肽可以是肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。在一些变型中，抗原肽可以是肿瘤相关的抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关的抗原可以是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

在一些变型中，多个特异性结合的共活化分子配体中的每个配体可以包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约100:1至约1:100。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或者1:90至1:100，其中上述每个值均用“约”修饰。在其他实施方案中，多个特异性结合的共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约20:1至约1:20或约3:1至约1:3。

在一些变型中，tcr共活化分子可以包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。在一些实施方案中，cd28结合蛋白或其片段可以还包括位点特异性的c末端生物素部分。在一些实施方案中，tcr共活化分子可以包括cd80分子或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性。在一些其他实施方案中，tcr共活化分子可以包括抗cd28抗体或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性。

在一些变型中，辅助tcr活化分子可以包括cd2结合蛋白或其保留与cd2的结合活性的片段。在一些实施方案中，cd2结合蛋白或其片段还包括位点特异性的c末端生物素部分。在一些实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括cd58分子或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性。在一些其他实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括抗cd2抗体或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性。

在一些变型中，多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体可以特异性结合至孔板的呈递链霉亲和素的第一区域的链霉亲和素官能团。

多个特异性结合的主活化分子配体在第一区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，并且任选地，在第一区域中的密度为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。多个特异性结合的共活化分子配体在第一区域中的密度为至少1×10²个分子/平方微米或约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

在一些变型中，提供了孔板，其中孔板的一个或多个孔中的每一个包括其表面和其第一区域，其中所述第一区域是呈递反应性部分的共价功能化的区域或呈递活化部分的共价功能化的区域，就像本文所述的具有表面和第一区域的任何孔板那样。一个或多个孔中的每一个的第一区域可以位于一个或多个相应的孔的底部表面上。每个第一区域的面积可以为一个或多个相应的孔的底部表面的面积的小于约50％，小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。在一些实施方案中，当第一区域的面积小于一个或多个孔的底部表面的整个面积时，则反应性部分不是叠氮基部分。在一些实施方案中，每个表面封闭配体可以包括亲水性的或带负电荷的部分。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。

如上文所述，具有表面(该表面包括呈递反应性部分的共价功能化的区域，例如呈递叠氮基或呈递炔基的部分)的孔板可以用作中心可接近的功能化形式，可以用各种各样的共价配体伙伴分子以许多不同的方式对其进行修饰，用于各种类别的微物体(包括但不限于生物细胞及其片段)的多种生物和化学转化，并将其用于包括但不限于本文所述方法的方法中，用于活化淋巴细胞以获得具有可控的、选定的表型的所需群体。如本文所用的，呈递叠氮基是指表面上具有共价附接于其上的配体的共价功能化的区域，其中所述配体在与配体的表面结合的第二末端相对的配体的第一末端处或附近具有叠氮基官能团。与表面结合末端相对的末端处或附近的叠氮基基本上可用于与反应对部分(该反应对部分可以与叠氮基反应，例如但不限于炔烃、环状紧张(strained)炔烃、α-酮基氯等)反应。如下文所详细描述的，本文所指的共价功能化的表面包括已经偶联由共价连接的分子(例如，配体)的任何类型的玻璃或聚合物表面。如下文更全面地描述的，表面的共价功能化的区域可以是整个表面、表面的一部分或表面的选定部分。

申请人也已经发现并在本文中描述了其他有用的可控制地共价功能化的孔板。可以将生物素或链霉亲和素引入到孔板的呈递叠氮基的共价功能化的表面，特别是在孔板的一个或多个孔内，从而产生孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域或者孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。在一种布置中，链霉亲和素本身经由包括反应性基团的连接基共价连接至孔板的表面，所述反应性基团被配置为与孔板的呈递叠氮基的共价功能化的表面的叠氮基官能团反应。在另一种布置中，链霉亲和素部分非共价地附接至生物素部分，其中生物素部分本身经由包括反应性基团的连接基共价连接至表面，所述反应性基团被配置为与孔板的呈递叠氮基的功能化的表面的叠氮基官能团反应。在任一种情况下，将呈递链霉亲和素的共价功能化的区域引入至表面，其中与叠氮基部分相似地，链霉亲和素部分共价连接至表面，使得链霉亲和素的至少一个结合位点可用于与生物分子配体结合，以用于如本文所述的活化淋巴细胞的方法中。

孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以用于多种应用，但一种重要但非限制性的用途是用于活化淋巴细胞，包括但不限于t细胞的抗原特异性活化。申请人已经发现，限制存在于孔板的孔中的链霉亲和素配体的密度的能力和/或限制呈递链霉亲和素配体的区域的大小和/或选择呈递链霉亲和素配体的区域的位置的能力对于有效和高效地活化t细胞可能很重要。不希望被理论所束缚，在孔板的孔的功能化的表面上存在的高密度链霉亲和素部分可以允许高浓度的mhc复合物来呈递抗原，以及共刺激性配体以与每个链霉亲和素上可用的多个结合位点结合，提供高度刺激性的呈递抗原的合成表面。这种高度刺激性的呈递抗原的合成表面实际上可能过度刺激t细胞，将过度活化的细胞推向衰竭或病态的表型，并提供较少数目的在生理上能够扩展为有效细胞产物的抗原特异性细胞。或者或另外，具有大范围的主和次(或共活化)活化配体的孔也可能过度刺激淋巴细胞，并导致具有不期望的表型的活化的淋巴细胞，例如衰竭的t细胞等。将淋巴细胞活化配体的区域限制在孔板的孔的较小区域可以有利地提供淋巴细胞可以迁移到的区域，从而防止病态表型的产生。另外，在本文所述的孔板中使用受限的活化区域的情况下，在一些实施方案中，使用圆底孔，利用重力将细胞带到孔内的活化区域可能是有用的。

类似地，具有较大区域或不受控制的表面积的孔(例如孔的整个底部或含细胞区域，其被修饰以呈递一种或多种活化物质，例如细胞表面标记物，例如cd2、cd4、cd8、cd28等，呈递抗原的物质，例如负载有肽的mhc分子、细胞因子、细胞粘附配体和生长刺激性分子)可能会诱导与待活化和，在某些实施方案中，扩增的细胞的过度活化接触，这可能导致期望的细胞表面标记物和其他内部信号传导途径的下调，这同样导致不期望的细胞群，例如但不限于衰竭或未扩增的活化的t细胞。

因此，申请人描述了在功能化的孔板内的孔的特定区域内具有可控的、限定的和有限的接触区域以及链霉亲和素部分的接触密度的功能化的孔板。然后，这些有限的区域/霉亲和素部分的浓度可以用来引入活化物质，以有效和高效地活化淋巴细胞，该淋巴细胞可以包括但不限于具有用于个体的免疫治疗的细胞产品的抗原特异性和所需表型的t细胞。提出了通过限制具有存在的活化配体的区域的面积，细胞可以在接收刺激信号后从活化区域移开，维持刺激，而没有过度活化。另外，本身不允许活化分子物质附接的表面封闭配体可以用于限制链霉亲和素官能团(以及因此引入的活化配体)的密度或物理位置，并提供有利于细胞维持、扩增和可移动性的支持性表面修饰，而不增加刺激性信号。下文更全面地描述了用于活化孔板表面的受限制区域的特定且可控的引入。

可以通过考察图1a至1c以及随附的描述来理解孔板内表面的共价功能化的区域的可控和灵活的引入。如图1a所示，提供了孔板110。孔板可以是玻璃或聚合物，例如塑料聚合物，或者可以包括玻璃或聚合物表面。孔板110孔板可以包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺e聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃共聚物、三聚氰胺等，由其组成，或者基本上由其组成。孔板110可以在孔板内具有16、48、96、384或更多个孔。可以在功能化之前对孔板110进行处理或清洁，以去除杂质并在表面上引入多个反应性官能团。处理/清洁可以包括等离子体清洁，其可以如本文所述地或以本领域已知的等离子体清洁的任何合适变型进行。或者或另外，可以用食人鱼溶液处理孔板110的表面，以在孔板的表面上实现类似的反应性官能团(例如氧化物)的引入。

可以被处理或清洗的孔板110可以与试剂103反应，该试剂103在孔板的表面提供包括反应性部分在内的可合成接近的把手(handle)，以用于进一步的加工。可以容易地引入的通常有用的反应性部分包括但不限于叠氮化物或炔烃，它们中的每一种都可以与归类为点击(click)化学试剂组中的试剂进一步反应，从而为孔板表面提供多种表面修饰。然而，也可以使用本领域已知的其他化学偶联，例如铃木硼烷型偶联反应、迈克尔反应等，以将表面功能化试剂或表面封闭试剂偶联至合适的反应性表面，并且可以使用其他反应性部分，例如羰基、共轭羰基和其他活化的部分。本公开不限于使用点击化学和相应的试剂对来引入修饰的表面和其上负载的活化物质，而是为简化起见在本文中详细描述了叠氮基部分的引入。

在2017年5月26日提交的pct/us2017/034832(lowe等人)和2018年7月20日提交的pct/us2018/043146(beemiller等人)(其每一个的公开内容均通过引用整体并入本文)中描述了在微流体装置的内表面上或在诸如玻璃或聚合物珠之类的珠的表面上进行的化学反应的其他示例，这些化学方法可以用于修饰孔板的孔。

用于表面的初始功能化的一类非常有用的试剂103包括叠氮基取代的三烷氧基硅氧烷，其中三烷氧基硅氧烷与孔板110的经清洁的表面的表面暴露的部分(例如，氧化物)反应。硅氧烷可以具有将叠氮基反应性部分连接至硅氧烷的连接基，其包括烃、取代的烃或亚烷基氧化物链。反应可以在溶液中或在气体条件下进行，并且在一些变型中，叠氮基取代的三烷氧基硅氧烷的反应是在真空下用挥发的叠氮基取代的三烷氧基硅氧烷进行的。具体的叠氮基三烷氧基硅氧烷的选择取决于孔板的材料，因为不同的聚合物孔板能抵抗不同的高温。连接基的长度决定了必须使用什么温度来使叠氮基三烷氧基硅氧烷挥发，并影响引入的改性的反应性表面的性质。通过分子的三烷氧基硅氧烷部分与孔板表面上的表面暴露的部分(例如氧化物部分)的反应，将叠氮基取代的配体引入至表面。反应可以在溶液中进行，或者可以在叠氮基取代的三烷氧基硅氧烷挥发的条件下进行，以与表面暴露的部分反应。与叠氮基取代的三烷氧基硅氧烷反应的孔板的区域可以是整个孔板，可以被掩蔽以将反应限制在一部分孔板中(例如，被掩蔽使得只有孔板的一个或多个孔可以反应)或其任何变型。在一些其他实施方案中，只有孔板的一个孔(或多个孔)的底部的区域可以是孔板的呈递叠氮基的共价功能化的区域。如本文所指的，底部表面位于形成孔的外壳的壁上，其中底部表面与孔板中的孔顶部处的开口相对地设置。在一些实施方案中，呈递叠氮基的共价功能化的区域不位于形成孔的外壳的侧壁上，其中该侧壁与孔板中的孔的开口相邻。在其他一些实施方案中，呈递叠氮基的共价功能化的区域不位于形成孔的外壳的侧壁上，其中该侧壁基本上垂直于孔顶部的开口。

在一些变型中，呈递叠氮基的共价功能化的区域的面积可以为至少0.5mm²(例如，至少1.0mm²，至少1.5mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，至少75mm²，至少100mm²，至少150mm²，至少200mm²，至少250mm²，至少300mm²，至少400mm²，至少500mm²，至少600mm²，至少700mm²，至少800mm²，至少900mm²，至少1,000mm²，至少2,000mm²，至少3,000mm²，至少4,000mm²，至少5,000mm²，至少6,000mm²，至少7,000mm²，至少8,000mm²，至少9,000mm²，至少10,000mm²，至少20,000mm²，至少30,000mm²，至少40,000mm²，至少50,000mm²，至少60,000mm²，至少70,000mm²，至少80,000mm²，至少90,000mm²，至少100,000mm²，或更高)。

呈递叠氮基的共价功能化的区域的叠氮基密度可以为至50/um²(例如，约50个叠氮基/um²至约2×10⁷/um²，约1×10²/um²至约1×10⁷/um²；约50/um²至约5×10⁶/um²；约1×10²/um²至约1×10⁶/um²；约1×10²/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约1×10²/um²至约5×10⁴/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；或其间的叠氮基数目/um²的任何值)。

连接基的长度可以为以下键长度，该键长度可以是5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长，或其间的任何数目的键长度。在一些实施方案中，呈递叠氮基的共价功能化的区域包含通过一系列约5个键长至约20个键长或约10个键长至约40个键长共价连接至表面的叠氮基官能团。在一些实施方案中，将叠氮基官能团连接至表面的连接基的原子可以选自碳、硅、氮、硫和氧。在一些实施方案中，连接基的原子可以选自碳、硅和氧。在一些变型中，连接基具有约七至约十七个主链原子，该主链原子可以选自碳、硅和氧。在一些实施方案中，连接基是直链连接基，并且连接基仅具有一个附接至叠氮基部分的第一末端和一个与表面结合的第二末端。在其他实施方案中，连接基是支链连接基，并且该支链连接基可以具有一个附接至表面的第二末端和各自连接至叠氮基部分的多个第一末端，例如叠氮基功能化的梳状聚合物。在各种实施方案中，表面的呈递叠氮基的表面结合的配体在孔板的表面上形成单层。在一些实施方案中，呈递叠氮基的表面结合的配体形成自组装单层，其从孔板的表面的厚度可以为约10埃，约20埃，约30埃，约40埃，约50埃，约70埃至约100埃，或其间的任何值。

在一些变型中，将叠氮基部分连接至三烷氧基硅氧烷的连接基的主链长度为约20，约18，约16，约14，约12，约10，约9，约8，约7，约6，约5，或约4个原子长。在一些实施方案中，主链的长度为约7个原子，并且为烃链。尽管玻璃孔板通常可以忍受显著升高的反应条件，但其他聚合物孔板在暴露于大大升高的温度后可能变形或以其他方式无法使用。已经发现有效地改性聚合物孔板(例如聚苯乙烯或聚碳酸酯)的是使用具有七个碳原子的长度的叠氮基取代的三烷氧基硅氧烷。如图1a所示，表面功能化试剂103因此可以是7-叠氮基庚基-三甲氧基硅烷，特别是与聚合物孔板一起使用，以产生功能化的孔板115，其在表面上呈递功能化配体105。在使用7-叠氮基庚基-三甲氧基硅烷的特定情况下，配体105是叠氮基庚基配体，其经由硅氧烷部分共价附接至表面。

提供孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的途径。共价功能化的孔板表面115(在一个具体实例中，呈递叠氮基的共价功能化的孔板表面)可以被修饰以呈递链霉亲和素部分。这可以通过几种方式之一来获得。

孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域。产生孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的一种方法是通过将生物素基团共价结合至孔板的表面。可以使叠氮基功能化的孔板115与含有生物素连接的炔烃的试剂(例如，含二环辛炔基的点击试剂)反应。在图1a中，作为一个实例，可以使用包括生物素的二苯并环辛炔基(dbco)点击试剂，dbco试剂107，其中生物素部分通过连接基与dbco部分连接，该连接基包括烷基、亚烷基氧化物或可裂解的烷基或亚烷基氧化物骨架，等等。连接基的主链长度可以为至少4个原子，至少8个原子，至少12个原子，至少16个原子，至少20个原子，至少50个原子或至少100个原子或更长，其可以是碳、氧、氮或硫。试剂107的dbco部分与叠氮基配体105的反应产生共价结合的含生物素的配体109，以产生孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域120。

在孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域的一些变型中，可以首先使孔板115的叠氮基功能化的表面与表面封闭试剂117反应，以产生孔板表面的呈递叠氮基的共价功能化的区域130。表面封闭试剂117可以具有反应性部分，该反应性部分被配置为与经清洁/制备的表面的在叠氮基功能化步骤中没有与试剂103结合的剩余的表面暴露的部分反应。表面封闭试剂117包括一种反应性官能团，例如三烷氧基硅氧烷，其被配置为与通过清洁引入的表面暴露的部分反应。然而，表面封闭试剂117不包括被配置为与含生物素的试剂、链霉亲和素、含链霉亲和素的试剂或淋巴细胞活化试剂中任一种反应的官能团。表面封闭试剂117可以类似于以下更充分描述的任何合适的封闭试剂。

可以采用dbco连接的生物素部分107如上文对表面115的反应所述地进行共价结合的生物素到表面130的引入，其仅与叠氮化物配体105的叠氮化物官能团反应，以产生孔板表面的呈递生物素的共价修饰的区域135，其具有共价连接的生物素配体109和表面封闭配体119。

在图1b中所示的又一个替代方案中，可以使孔板的呈递叠氮基的共价功能化的表面115与含生物素的dbco试剂107和表面封闭dbco试剂121的混合物反应，该混合物具有被配置为与表面115的叠氮基部分反应的表面封闭部分和dbco部分。表面封闭部分可以是下文更充分描述的任何合适的表面封闭dbco试剂。该反应的产物是孔板表面的呈递生物素的共价修饰的区域145，其具有含生物素的配体109和表面封闭配体123两者。可以以任何合适的比例来调节混合表面上的配体的比例，以将每单位面积的生物素部分的密度“调整”至所需的量。生物素配体与表面封闭配体的比例可以为约3:1；约2:1；约1:1；约1:2；约1:3；约1:4；约1:5；约1:6，约1:8；约1:10，或更高。表面封闭配体123的表面封闭部分的化学性质也可以改变，以提供用于选择的淋巴细胞活化的优化的表面。

对于呈递生物素的共价功能化的区域135、145，表面封闭试剂117和表面封闭dbco试剂121可以包括多于一种类型的表面封闭部分。例如，可以使用具有不同的链长、带电荷部分和/或亲水特性的试剂的混合物。

呈递生物素的共价功能化的区域120、135、145的面积可以为至少0.5mm²，例如，至少0.6mm²，至少0.7mm²，至少0.8mm²，至少0.9mm²，至少1.0mm²，至少1.1mm²，至少1.2mm²，至少1.3mm²，至少1.4mm²，至少1.5mm²，至少1.6mm²，至少1.7mm²，至少1.8mm²，至少1.9mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，或由上述端点中的两个定义的任何范围。因此，例如，呈递生物素的共价功能化的区域120、135、145的面积可以为约0.5mm²至约50mm²，约1mm²至约40mm²，2mm²至约35mm²，约3mm²至约30mm²，或者约4mm²至约25mm²。通常，呈递生物素的共价功能化的区域120、135、145的面积等于或小于100mm²(例如，等于或小于75mm²，或等于或小于50mm²)。

呈递生物素的共价功能化的区域120、135、145的生物素官能团的密度可以为至少50/um²(例如，约50个生物素基团/um²至约5×10⁶/um²，约1×10²/um²至约1×10⁶/um²，约1×10²/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约1×10²/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或其间的生物素基团数目/um²的任何值)。

呈递生物素的共价功能化的区域包括经由连接基共价连接至表面的生物素官能团，该连接基通过一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长或其间的任意数目的键长的连接基共价连接至表面。在一些实施方案中，将生物素官能团连接至表面的连接基的原子可以选自碳、硅、氮、硫和氧。在一些实施方案中，连接基的原子选自碳、硅和氧。在一些实施方案中，将生物素连接至dbco部分的连接基可以具有约10至40个选自碳、硅、氮和氧的主链原子。在一些实施方案中，连接基是直链连接基，并且该连接基仅具有一个附接至生物素部分的第一末端和一个与表面结合的第二末端。在一些实施方案中，连接基是基本上直链的连接基，其中该基本上直链的连接基可以包括环状部分例如三唑基或取代的三唑基部分，或被其中断。诸如三唑基或取代的三唑基的环状部分可以是基本直链的连接基的一部分，其通过点击偶联引入，以引入共价结合的生物素。在其他实施方案中，连接基是支链连接基，并且该支链连接基可以具有一个与表面结合的第二末端和各自具有与其附接的生物素部分的多个第一末端，例如，呈递生物素的功能化的梳状聚合物，其可以包括环状基团，例如三唑基和/或取代的三唑基。在一些其他实施方案中，将生物素部分连接至表面的连接基可以还包括二硫化物部分或可光裂解的部分。在各种实施方案中，呈递生物素的共价功能化的表面的配体在区域120、135、145的表面上形成单层。在一些实施方案中，与呈递生物素的表面结合的配体形成自组装的单层，其从孔板表面起的厚度可以为约10埃至约100埃，或其间的任何值。

孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域120、135、145可以立即被进一步修饰或者可以被储存以备后用。虽然图1a、1b示出了表面的呈递生物素的共价功能化的区域120、135、145被进一步转化为孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域，但本发明不限于此。与生物素的任何合适的结合对可以与孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域120结合。

孔板表面的呈递链霉亲和素的功能化的区域。呈递生物素的共价功能化的区域120、135、140中的任一个都可以将链霉亲和素偶联至其上的生物素部分，如图1a和1b所示。然后可以使链霉亲和素(其是天然链霉亲和素或与生物素具有结合亲合力的经修饰的链霉亲和素，其具有四个结合位点，并示意性地显示为结构111)与区域120、135、145的含生物素的配体109反应，在链霉亲和素的四个可用位点之一处结合，产生具有链霉亲和素配体113的各自的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域125、140、150。链霉亲和素可以被认为是自身非共价结合的，但是经由生物素结合至表面，生物素本身与表面共价结合，从而形成孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。生物素/链霉亲和素结合对的强度(解离常数kd为约10^-14mol/l)可以被认为与共价键的强度相等，因此允许与表面的牢固缔合。

如上文所述，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域140、150分别包括表面封闭配体119和123，从而允许选择性地设计活化表面。

将链霉亲和素直接偶联至表面的呈递叠氮基的共价功能化的区域。在如图1c所示的又一替代方案中，可以直接从具有叠氮基官能团配体105的呈递叠氮化物的共价功能化的表面115产生孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。可以在一个步骤中通过与点击化学试剂反应而将链霉亲和素共价结合至表面115，该点击化学试剂具有与炔基部分共价连接的链霉亲和素分子，例如试剂127，其中dbco部分经由连接基共价连接至链霉亲和素四聚体分子(具有四个结合位点)。将dbco连接至链霉亲和素的连接基可以是亚烷基氧化物、烷基或可裂解的亚烷基氧化物或烷基直链部分。连接基可以具有选自碳、硅、氮和氧的10至50个主链原子。例如，链霉亲和素官能团可以通过一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长或其间的任意数目的键长的连接基共价连接至表面。在一些实施方案中，将链霉亲和素官能团连接至表面的连接基的原子可以选自碳、硅、氮、硫和氧。在一些实施方案中，连接基的原子选自碳、硅和氧。在一些实施方案中，连接基是直链连接基，并且该直链基仅具有一个共价附接至链霉亲和素的第一末端和一个直接或间接与表面结合的第二末端。在一些实施方案中，连接基是基本上直链的连接基，并且该连接基仅具有一个附接至链霉亲和素部分的第一末端和一个直接或间接与表面结合的第二末端，其中该基本上直链的连接基可以包括环状部分如三唑基或取代的三唑基部分或者被其中断。诸如三唑基或取代的三唑基的环状部分可以是基本上直链的连接基的一部分，其通过点击偶联引入，以引入共价结合的链霉亲和素。在其他实施方案中，连接基是支链连接基，并且该支链连接基可以具有一个直接或间接与表面结合的第二末端和各自与链霉亲和素部分结合的多个第一末端，例如，链霉亲和素功能化的梳状聚合物，其可以包括环状基团，例如三唑基和/或取代的三唑基。在其他变型中，链霉亲和素可以在链霉亲和素分子的多于一个点处共价附接至表面。在一些其他实施方案中，将链霉亲和素部分连接至表面的连接基可以还包括二硫化物部分或可光裂解的部分。在一些实施方案中，与呈递链霉亲和素的表面结合的配体形成的层从孔板表面起的厚度为约10埃至约100埃，或者其间的任何值。

如图1c所示的该一步路线也可以使用链霉亲和素连接的dbco点击试剂127和表面封闭试剂(例如表面封闭试剂121)的混合物，其中表面封闭试剂可以具有如上文所述的任何组成。链霉亲和素dbco试剂127和表面封闭试剂121的混合物可以以任何期望的比率使用，以在经改性的表面155上提供链霉亲和素部分的选定密度/分布(混合物未示出)。链霉亲和素配体与表面封闭配体的比率可以为约3:1；约2:1；约1:1；约1:2；约1:3；约1:4；约1:5；约1:6，约1:8；约1:10，或更高。

在又一替代方案中，尽管已经使用dbco点击试剂讨论了先前的示例，但是可以在与图1a-1c所示等效的相应路线中使用非环状炔烃连接的生物素、表面封闭试剂和链霉亲和素连接的试剂引入所有相同的表面。在一些变型中，如下文进一步详细讨论的，在铜催化下，使用炔烃连接的点击试剂与叠氮基配体105反应，可能有助于使点击反应充分减慢，以获得更精确界定的修饰区域。

如本文任何所述的那样，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团的密度可以为至少50/um²(例如，约50个链霉亲和素基团/um²至约8×10⁵/um²，约1×10²/um²至约8×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或其间的链霉亲和素基团的数目/um²的任何值)。

如本文任何所述的那样，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为至少0.5mm²，例如，至少0.6mm²，至少0.7mm²，至少0.8mm²，至少0.9mm²，至少1.0mm²，至少1.1mm²，至少1.2mm²，至少1.3mm²，至少1.4mm²，至少1.5mm²，至少1.6mm²，至少1.7mm²，至少1.8mm²，至少1.9mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，或由前述端点中的两个限定的任何范围。因此，例如，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为约0.5mm²至约50mm²，约1mm²至约40mm²，2mm²至约35mm²，约3mm²至约30mm²，或者约4mm²至约25mm²。通常，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积等于或小于100mm²(例如，等于或小于75mm²，或者等于或小于50mm²)。

可能期望使用上述制备途径提供的对照，以选择链霉亲和素部分的密度，以提供足够数目的结合位点(具有最多四个可用的结合位点的链霉亲和素)与表面的活化区域内的一个或多个不同的活化分子结合，同时提供活化分子可以存在的密度的上限。不希望受到理论的束缚，有可能以超过此处所述的最高密度的刺激性配体的密度来过度刺激淋巴细胞，这可能驱使淋巴细胞到不那么期望的生理状态，例如，衰竭的表型或非特异性活化的表型。

选择性引入共价功能化的区域。如所提到的，申请人已经发现，在淋巴细胞可接近的体积内产生有限的活化区域，提供了大大改善的活化表型。因此，可以在孔板表面的指定区域内进行能够与淋巴细胞活化配体结合的共价功能化的表面的引入。在一些实施方案中，孔板的一个或多个表面可以具有引入的呈递叠氮基的共价功能化的区域。该一个或多个表面可以是孔板的一个或多个孔，并且进一步地，可以是孔板的一个或多个孔的底部表面，其中该底部表面。如本文所指的，底部表面位于形成孔的外壳的壁上，其中该底部表面与孔板中的孔顶部处的开口相对地设置。在一些实施例中，呈递叠氮基的共价功能化的区域不位于形成孔的外壳的侧壁上，其中该侧壁与孔板中的孔的开口相邻。

然而，在各种实施方案中，孔板的所有表面都可以具有引入的呈递叠氮基的共价功能化的表面，特别是当叠氮基连接的三烷氧基硅氧烷作为与接触孔板表面的挥发性试剂反应以与表面暴露的部分反应时。如所提及的，当采用任何合适类型的掩膜时，少于所有的表面可以反应，以形成呈递叠氮基的共价功能化的表面。例如，可以掩盖孔板的上侧和下侧，使得仅一个或多个孔内的表面反应以形成呈递叠氮基的共价功能化的区域。或者，仅孔板的选定的孔可以反应，以具有呈递叠氮基共价功能化的区域，该区域在孔内的所有表面(包括底部和侧壁)上延伸。在又一变型中，仅孔板的一个或多个孔的底部表面可以反应，以在孔板的一个或多个孔的底部内具有呈递叠氮基的共价功能化的区域。

这些表面中的任何一个的呈递叠氮基的共价功能化的面积区域可以为至少0.5mm²(例如，至少1.0mm²，至少1.5mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，至少75mm²，至少100mm²，至少150mm²，至少200mm²，至少250mm²，至少300mm²，至少400mm²，至少500mm²，至少600mm²，至少700mm²，至少800mm²，至少900mm²，至少1,000mm²，至少2,000mm²，至少3,000mm²，至少4,000mm²，至少5,000mm²，至少6,000mm²，至少7,000mm²，至少8,000mm²，至少9,000mm²，至少10,000mm²，至少20,000mm²，至少30,000mm²，至少40,000mm²，至少50,000mm²，至少60,000mm²，至少70,000mm²，至少80,000mm²，至少90,000mm²，至少100,000mm²，或更多(例如，孔板的孔或者两个或更多个孔中的每一个的基本上所有内表面))。另外，呈递叠氮基的共价功能化的区域具有的叠氮基的密度为至少50/um²，例如，约50个叠氮基/um²至约2×10⁷/um²，约1×10²/um²至约1×10⁷/um²；约50/um²至约5×10⁶/um²；约1×10²/um²至约1×10⁶/um²；约1×10²/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约1×10²/um²至约5×10⁴/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；或其间的叠氮基数目/um²的任何值。

类似地，可以在孔板的所有表面上或在孔板的表面的选定和/或限定的区域处引入孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域。在一些实施方案中，在孔板的至少一个或多个孔的表面上具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的孔板在一个或多个孔的至少一个表面内具有呈递生物素的共价功能化的区域。特别地，通过将生物素连接的点击试剂107仅添加到孔底部的期望部分内的区域，可以在孔板的一个或多个孔的底部的一部分上形成与区域120相似的呈递生物素的共价功能化的区域，其中该底部表面与孔板中的孔顶部处的开口相对地设置。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域不位于形成孔的外壳的侧壁上，其中该侧壁与孔板中的孔的开口相邻。在一些实施方案中，这可以是炔点击试剂而不是dbco点击试剂，并且进行铜催化的点击反应以获得该区域的选定边界。

孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以为至少0.5mm²，例如，至少0.6mm²，至少0.7mm²，至少0.8mm²，至少0.9mm²，至少1.0mm²，至少1.1mm²，至少1.2mm²，至少1.3mm²，至少1.4mm²，至少1.5mm²，至少1.6mm²，至少1.7mm²，至少1.8mm²，至少1.9mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，或更大。因此，呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以为约0.5mm²至约50mm²，约1mm²至约40mm²，2mm²至约35mm²，约3mm²至约30mm²，或者约4mm²至约25mm²。通常，呈递生物素的共价功能化的区域的面积等于或小于100mm²(例如，等于或小于75mm²，或者等于或小于50mm²)。呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以为孔板的一个或多个孔中的每一个的底部的面积的小于约50％，小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。或者，这种关系可以说成是呈递生物素的共价功能化的区域的面积小于约35mm²，小于约20mm²，小于约12mm²，小于约5mm²，小于约2mm²，小于约1mm²，或小于约0.5mm²。呈递生物素的共价功能化的区域的尺寸可以为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或者约1.5mm至约3.0mm)。呈递生物素的共价功能化的区域可以具有任何期望的形状：圆形、椭圆形、不规则形、矩形、正方形或多边形。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或者约1.5mm至约3.0mm)的直径。

另外，孔板的表面可以包括多个呈递生物素的共价功能化的区域。此外，含生物素的试剂可以与孔板的一个或多个孔的表面的反应性部分偶联，其中多个呈递生物素的共价功能化的区域可以聚集在孔板的孔的底部。多个呈递生物素的共价功能化的区域中的每一个的面积可以小于一个或多个孔的底部的面积的约5％。多个呈递生物素的共价功能化的区域的总面积可以小于至少一个孔的底部的面积的约50％或约25％。

呈递生物素的共价功能化的区域的生物素官能团的密度可以为至少50/um²(例如，约50个生物素基团/um²至约5×10⁶/um²，约1×10²/um²至约1×10⁶/um²；约1×10²/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约1×10²/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或其间的生物素基团数目/um²的任何值)。

孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可类似地在选定区域处形成，无论是如图1c的区域155所示经由点击或铜介导的点击反应直接偶联至叠氮基部分，还是如图1a和1b中的区域125、140、150所示经由结合而偶联到呈递生物素的共价功能化的区域的生物素部分。在任何情况下，都可以在孔板的一个或多个孔内的表面上形成呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。此外，可以仅在孔的底部的期望部分的表面上形成呈递链霉亲和素的共价功能化的区域，其中该底部表面与孔板中的孔顶部的开口相对地设置。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域不位于形成孔的外壳的侧壁上，其中该侧壁与孔板中的孔的开口相邻。

呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为至少0.5mm²，例如，至少0.6mm²，至少0.7mm²，至少0.8mm²，至少0.9mm²，至少1.0mm²，至少1.1mm²，至少1.2mm²，至少1.3mm²，至少1.4mm²，至少1.5mm²，至少1.6mm²，至少1.7mm²，至少1.8mm²，至少1.9mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，或更大。因此，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为约0.5mm²至约50mm²，约1mm²至约40mm²，2mm²至约35mm²，约3mm²至约30mm²，或者约4mm²至约25mm²。通常，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积等于或小于100mm²(例如，等于或小于75mm²，或者等于或小于50mm²)。呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团的密度可以为至少50/um²(约50个链霉亲和素基团/um²至约8×10⁵/um²，约1×10²/um²至约8×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或其间的链霉亲和素基团数目/um²的任何值)。

呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以小于一个或多个孔中的每一个的底部表面的面积的约50％。呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为一个或多个孔中的每一个的底部面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。或者，这种关系可以说成是呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以小于约35mm²，小于约20mm²，小于约12mm²，小于约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的尺寸。

呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以具有任何期望的形状：圆形、椭圆形、不规则形、矩形、正方形或多边形。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且可以具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

另外，孔板的表面可以包括多个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。此外，含链霉亲和素的试剂可以与孔板的一个或多个孔的表面的反应性部分偶联，或者链霉亲和素可以与表面的呈递生物素的共价功能化的区域的生物素部分结合，其中多个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以聚集在孔板的孔的底部。多个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域中的每一个的面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约5％。多个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的总面积可以小于至少一个孔的底部面积的约50％或约25％。

表面封闭修饰的区域。在一些实施方案中，孔板或者一个或多个孔中的每一个的表面还包括另一个(例如，第二)共价修饰的区域，其包含表面封闭配体。如图1d所示，表面160具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域165，其带有链霉亲和素配体113，类似于区域125，通过生物素基配体109’的初始共价功能化，然后链霉亲和素与生物素部分结合。通过使反应性部分(在这种情况下为呈递叠氮基的配体105的叠氮基部分)与表面封闭dbco试剂121反应，可以用表面封闭配体进一步修饰围绕呈递链霉亲和素的共价功能化的区域165的第二区域167。表面封闭配体可以具有本文所述的任何表面封闭部分(例如，包含亲水性的或带负电的部分和/或聚乙二醇(peg)部分)。所得表面170具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域165，其被第二区域177围绕，该第二区域177具有包含表面封闭配体123的改性表面177。表面封闭配体可以是单一类型的表面封闭配体或可以是表面封闭配体的混合物。表面封闭配体123的类型/混合物的选择可以为淋巴细胞培养提供优化的支持。虽然在图1d中示出了具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域165的表面160，具有共价功能化的区域120、125、135、140、145、150、155的类似表面可以具有相似的周围第二区域，该第二区域包含呈递反应性部分的配体，例如呈递叠氮基的配体105，并且可以被类似地修饰以在各自的周围第二区域中引入表面封闭配体123。在一些实施方案中，表面修饰的区域例如区域177不与呈递生物素的共价功能化的区域120、135、145或者呈递链霉亲和素的共价功能化的区域125、135、145、155重叠。

在一些变型中，第二共价修饰的区域可以还包括至少一个提供刺激粘附的部分的配体。例如，可以将附接至dbco点击偶联剂的肽序列引入到区域177中。肽序列可以包括rgd(arg-gly-asp)基序，其可以通过提供机械粘附而在培养过程中刺激淋巴细胞。任何其他刺激粘附的部分可以被改变并类似地引入。可以在引入呈递链霉亲和素的区域165之后，并且在引入形成表面封闭区域177的表面封闭配体123之前、同时或之后，引入刺激粘附的部分。

具有包括淋巴细胞活化共价功能化的区域的表面的孔板。如上文所提及的，申请人已经发现，使用孔板的活化表面，其中活化限于表面的区域，提供了更可控和有效的淋巴细胞活化。淋巴细胞可以是任何合适的淋巴细胞，包括但不限于t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞或b细胞。如图1d所示，可以将活化部分引入并结合到表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域上。对表面170示出了活化部分的引入，但是本发明不限于此。结合有共价功能化的区域(如区域125、140、150、155)的任何表面均可以具有引入的活化部分，以形成表面180的淋巴细胞活化共价功能化的区域(如表面185)。在一些实施方案中，封闭配体修饰的区域177和淋巴细胞活化共价功能化的区域185覆盖孔板的整个表面。在一些实施方案中，封闭配体修饰的区域177和淋巴细胞活化共价功能化的区域185是表面的非重叠区域。可以将淋巴细胞活化共价功能化的区域185引入到孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面上。在一些变型中，可以将淋巴细胞活化共价功能化的区域185引入到一个或多个孔中的每一个的底部表面上。在一些实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域仅设置在相应孔的底部表面上。淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约50％。淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积为一个或多个孔的底部面积的小于约50％，小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％，或小于约1％。淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²。在一些实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域的尺寸为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。淋巴细胞活化共价功能化的区域可以具有任何期望的形状：圆形、椭圆形、不规则形、矩形、正方形或多边形。在一些实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域可以是基本上是圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。在一些实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且可以具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

在一些变型中，活化分子131，其各自包含活化部分(例如分子131的“p”)以及结合部分(例如生物素)，其可以与链霉亲和素的结合位点结合，并形成淋巴细胞活化共价功能化的区域185。结合的第一活化分子复合物137可以被称为特异性结合的活化分子配体。在一些变型中，可能仅存在一种活化分子。在其他变型中，可以存在第一活化分子131(其可以是主活化分子)，以及其他类型的活化分子133。活化分子133可以是另外的活化分子、共活化分子、辅助活化分子或次级活化分子。第一活化分子与第二活化分子的比率可以是用于活化淋巴细胞的任何合适的比率，例如10:1；8:1；6:1；5:1；3:1；2:1；1:1；1:2；1:3；1:5；1:6；1:8；1:10或更高。

在一些变型中，第一活化分子131可以是但不限于分化结合分子、免疫球蛋白结合分子、t细胞受体分子活化分子、tnf受体超家族结合分子、趋化因子受体结合分子、生长因子分子或粘附促进分子的细胞表面簇。在一些变型中，第一活化分子可以包括mhc分子(例如，i类或ii类)、保留分化结合活性的细胞表面簇的蛋白质或其片段、保留t细胞受体结合活性的蛋白质或其片段、保留tnf受体超家族结合活性的蛋白质或其片段、保留趋化因子受体结合活性的蛋白质或其片段、保留生长刺激活性的蛋白质或其片段或者保留粘附促进活性的蛋白质或其片段。蛋白质可以是抗体或可以保留与指定靶标的结合活性的片段。

特异性结合的第一活化分子配体在淋巴细胞活化共价功能化的区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或者1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

在一些变型中，可以将第二活化分子133引入到淋巴细胞活化区域185中，该第二活化分子133各自包含活化部分(例如“s”)和结合部分，其中结合部分与链霉亲和素的结合位点结合，从而在淋巴细胞活化共价功能化的区域185中提供特异性结合的第二活化分子配体139。多个第二活化分子可以包括但不限于t细胞受体(tcr)共活化分子、细胞表面免疫球蛋白结合分子、生长因子分子、粘附促进分子等。第二活化分子133可以是一类第二活化分子，或者第二活化分子133可以是多于一种不同分子的混合物，其可以以被认为适合于淋巴细胞活化的任何比率使用。

在一些变型中，特异性结合的第二活化分子配体137在淋巴细胞活化共价功能化的区域中的密度可以为约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

在一些变型中，具有包括淋巴细胞活化区域的表面的孔板可以在一个或多个孔的每一个中具有多个淋巴细胞活化共价功能化的区域。多个淋巴细胞活化共价功能化的区域中的每一个的面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约5％。在一些实施方案中，多个淋巴细胞活化共价功能化的区域的总面积小于一个或多个孔的底部面积的约50％、约25％或约10％。

分子配体。任何合适的淋巴细胞活化配体均可以包括在本文所述的孔板的表面的淋巴细胞活化区域中。活化配体可以是分化结合分子、t细胞受体分子活化分子、tnf受体超家族结合分子、趋化因子受体结合分子、生长因子分子或粘附促进分子的细胞表面簇。这些分子的一些非限制性实例包括：cd2、cd3、cd19、cd20、cd27、cd28、cd30、cd40、cd48、cd58、cd70、cd83、cd137、cd122、cd155、cd226结合分子等。这些结合分子可以包括其重组配体。特别地，cd2、cd28结合分子可用于活化抗原特异性t细胞。cd3、cd137或cd40配体可用于活化t细胞的扩增。cd19和cd20结合分子可用于活化嵌合抗原受体(car)t细胞。活化分子可以是这些分子的激动剂抗体，例如抗cd2、抗cd3、抗cd27、抗cd28、抗cd30、抗cd40、抗cd58、抗cd48、抗cd122、抗cdl37等。

趋化因子受体配体可以用于活化淋巴细胞，例如属于ccl家族的那些，例如ccl21或ccl19。诱导型t细胞共刺激剂是免疫检查点蛋白，并且cd278或icos(诱导型t细胞共刺激剂)结合分子或激动剂抗体可以用于本文所述的活化呈递区域。甲型肝炎病毒细胞受体1(havcr-1)也被称为t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1(tim-1)，是人类中由havcr1基因编码的蛋白质。抗tim1或tim4配体可以用于活化t细胞。

dr3，也被称为tnfrsf25、淋巴细胞相关的死亡受体(lard)，属于tnf受体超家族(tnfrsf)。其结合分子或其激动剂抗体可以用于活化t细胞和nkt细胞。

信号淋巴细胞活化分子(slam)家族成员1(也被称为cd150)是在t细胞、b细胞、巨噬细胞和树突状细胞上表达的自体配体细胞表面糖蛋白。cd150在t细胞和呈递抗原的细胞(apc)之间的粘附和信号传导中起重要作用。cd150是造血干细胞上被称为slam家族的正在增长的糖蛋白受体家族的原型成员，该家族包括cd229、cd84、cd244、sf2000/ly108、sf2001和19a(cracc)。激动剂抗体可以用于活化淋巴细胞，特别是t细胞和b细胞。

gitr(糖皮质激素诱导的tnfr家族相关的基因)是tnfr超家族(tnfrsf)的成员。抗gitr或gitr配体可以用于活化t细胞。ox40(cd134)及其结合伴侣ox40l(cd252)是tnfr/tnf超家族的成员，并且在活化的cd4和cd8t细胞以及许多其他淋巴和非淋巴细胞上表达。ox40和ox40l还调节由t细胞、呈递抗原的细胞、nk细胞和nkt细胞产生细胞因子，并调节细胞因子受体信号传导，并且其抗体或配体可以用于活化t细胞或nk细胞。

cd137是肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员。它的替代名称是肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)、4-1bb，并由淋巴细胞活化(ila)诱导。抗-41bb或41bb-l可以用于活化区域中以活化淋巴细胞。疱疹病毒进入中介体(hvem)，也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(tnfrsf14)，是tnf受体超家族的人细胞表面受体。

诸如il7和/或il15之类的细胞因子可以被引入到淋巴细胞活化区域内或者可以被引入到围绕淋巴细胞活化区域的经修饰的表面内。

为了扩增nk细胞或nkcar细胞，可以将天然杀伤受体结合分子例如nkg2d配体引入到淋巴细胞活化区域内。

如上文所述，可以使用免疫球蛋白结合分子，例如mhc分子。mhc可以是i类mhc。在一些其他实施方案中，mhc可以是ii类mhc，以活化t细胞的不同亚型。

同样如上文所述，可以使用生长因子配体或粘附促进配体。

具有呈递抗原的共价功能化的区域的孔板。在一些变型中，具有淋巴细胞活化共价功能化的区域的孔板可以是用于活化t细胞(t细胞)的孔板的呈递抗原的共价功能化的区域，并且可以具有如上文所述的具有一个或多个淋巴细胞活化共价功能化的区域的孔板的任何特征。即，孔板的一个或多个孔中的每一个可以具有表面，该表面具有呈递抗原的共价功能化的区域。一个或多个孔中的每一个的呈递抗原的共价功能化的区域可以位于相应的孔的底部表面上。此外，一个或多个孔中的每一个的呈递抗原的共价功能化的区域可以仅设置在一个或多个孔的底部表面上。在一些实施方案中，呈递抗原的共价功能化的区域可以不设置在一个或多个孔的侧壁上。在一些实施方案中，孔板的一个或多个孔中的每一个可以具有多个呈递抗原的共价功能化的区域，这些区域仅设置在一个或多个孔的底部表面上。

呈递抗原的共价功能化的区域可以包括特异性结合的主活化分子配体137(“第一活化分子配体”)和特异性结合的共活化分子配体139(“第二活化分子配体”)，其中每个主活化分子131具有主活化部分(“p”)和可以与呈递链霉亲和素的功能化的区域125、140、150、155、170等的链霉亲和素的结合位点结合的结合部分(例如，生物素)。主活化分子配体137和共活化分子配体139可以以本文所述的任何比率，例如约1:1至约2:1；约1:1；或约3:1至约1:3设置在呈递抗原的共价功能化的区域内。

在一些变型中，特异性结合的主活化分子配体137各自包含主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合。mhc分子可以包括i类mhc蛋白质序列、β微球蛋白蛋白质序列和抗原肽。在一些变型中，mhc分子的蛋白质序列可以经由蛋白质序列的c末端连接(例如，通过用于位点特异性生物素化的c末端bira标签)连接至呈递抗原的合成表面。

特异性结合的主活化分子配体137在呈递抗原的共价功能化的区域(如185)中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

包括mhc分子的主活化分子可以还包括肿瘤相关的抗原肽，其可以是本领域技术人员可以确定的任何合适的肿瘤相关的抗原肽。肿瘤相关的抗原肽可以与主活化分子配体(例如，mhc分子)非共价结合。肿瘤相关的抗原肽可以由主活化分子配体(例如，mhc分子)以可以引发t淋巴细胞活化的方向呈递。肿瘤相关的抗原可以是肽。

肿瘤相关的抗原的一些非限制性实例包括针对黑素瘤的mart1(肽序列elagigiltv)、黑素瘤和某些癌中涉及的nyeso1(肽序列sllwitqv)、slc45a2、tcl1和vcx3a，但是本公开内容不限于此。肿瘤抗原的其他实例包括包含来自在肿瘤细胞表面上表达的蛋白质的氨基酸序列的片段的肽，例如cd19、cd20、cll-1、trp-2、lage-1、her2、epha2、folr1、mage-a1、间皮素、sox2、psm、ca125、t抗原等。肽可以来自肿瘤相关的抗原的细胞外结构域。如果抗原在肿瘤细胞上的表达水平高于在肿瘤细胞来源的类型的健康细胞上的表达水平，则认为该抗原是肿瘤相关的。识别该肿瘤相关的抗原的t细胞是抗原特异性t细胞。任何肿瘤相关的抗原均可以用于本文所述的呈递抗原的表面。在一些实施方案中，肿瘤相关的抗原是新抗原肽，例如，在肿瘤细胞中由突变体基因编码。对于新抗原肽的详细讨论，参见，例如，us2011/0293637。在一些实施方案中，肿瘤相关的抗原可以是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

在其他变型中，抗原肽可以是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。

特异性结合的共活化分子配体133(例如，第二活化分子配体)可以各自包括t细胞受体(tcr)共活化部分(“s”)；或辅助tcr活化部分(“s”)。多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约100:1至约1:100。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或1:90至1:100，其中每个前述值均用“约”修饰。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约20:1至约1:20或约3:1至约1:3。

在一些实施方案中，tcr共活化分子可以包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。cd28结合蛋白或其片段可以还包括位点特异性的c末端生物素部分。在一些实施方案中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括cd80分子或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性。在一些其他实施方案中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括抗cd28抗体或其片段。

在一些变型中，辅助tcr活化分子可以包括cd2结合蛋白或其保留与cd2的结合活性的片段。cd2结合蛋白或其片段可以还包括位点特异性的c末端生物素部分。在其他变型中，辅助tcr活化分子可以包括cd58分子或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性。在一些实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括抗cd2抗体或其片段。特异性结合的共活化分子配体在呈递抗原的共价功能化的区域中的呈递抗原的合成表面上的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

可裂解的连接基。在一些实施方案中，可裂解的连接基可以包含在连接活化配体、共价连接的链霉亲和素、生物素或叠氮基部分的连接基中。可裂解的连接基可以包括二硫化物部分或可以包括可光裂解的部分，例如取代的硝基苄基连接基，其可以在约365nm的uv光照射下裂解。这些可以用于在所需的使用期间后去除表面结合的配体，或者可以用于需要掩蔽或光掩蔽的方法中，以仅在不是如此掩蔽或光掩蔽的区域内进行位点选择性地引入所需的分子配体。在位点选择性地引入分子配体之后，掩蔽配体可以在碱性条件下在硫醇(二硫化物)存在下或通过光裂解从表面上释放出来。

表面封闭试剂和由此形成的配体。用于本文描述的表面的表面封闭试剂可以是两种类型。第一类包括表面封闭试剂，例如图1a的表面封闭试剂117，其可以具有反应性部分，该反应性部分被配置为与经清洁/制备的表面110的剩余反应性部分(例如初始存在的或通过清洁或其他氧化步骤引入的氧化物官能团)反应。表面封闭试剂117包括一种反应性官能团，例如三烷氧基硅氧烷，其被配置为与表面暴露的部分(例如氧化物)反应，并且不包含会与任何含生物素的试剂、链霉亲和素或含链霉亲和素的试剂反应(例如干扰)的其他官能团。

第二类表面封闭试剂可以类似于表面封闭dbco试剂121，其被配置为与初始功能化的表面115的反应性官能团(例如叠氮化物或炔烃)反应。因此，第二类表面封闭试剂具有一个反应性部分，例如炔烃(包括环状紧张炔烃，例如dbco)，其被配置成与如图1a和1b所示的配体105反应。

无论哪种类型的表面封闭试剂，表面封闭试剂的反应性部分都具有连接部分，该连接部分可以是亚烷基氧化物、烷基或取代的氧化烯基或连接到反应性部分上的烷基直链部分。任选地，连接部分具有直链结构。

表面封闭试剂的末端部分(其在与表面反应后将保持未结合)可以是亲水性部分、两亲性部分、两性离子部分或带负电荷的部分。在一些实施方案中，末端封闭基团包含末端羟基。在一些实施方案中，末端封闭基团包含末端羧基。在一些实施方案中，末端封闭基团包含末端两性离子基团。多个表面封闭配体可以具有全部相同的末端表面封闭基团或者可以具有末端表面封闭基团的混合物。不受理论的束缚，末端表面封闭基团以及表面封闭配体的亲水性连接基可以与经修饰的表面周围的水性介质中的水分子相互作用，从而整体上产生更亲水的表面。这种增强的亲水性质可以使经修饰的表面与生物微物体之间的接触更相容并且更类似于天然的细胞间相互作用和/或体内的细胞-细胞外流体环境。

表面封闭试剂/配体的连接部分可以包含例如聚合物。该聚合物可以包括包含亚烷基醚部分的聚合物。多种含亚烷基醚的聚合物可适用于本文所述的表面。一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(pegmw<100000da)，其在本领域中已知是生物相容性的。在一些实施方案中，peg的mw可以为约88da，100da，132da，176da，200da，220da，264da，308da，3520a，396da，440da，500da，600da，700da，800da，900da，10000a，1500da，2000da，5000da，10,000da或20,000da，或者mw可以落在上述任意两个值所定义的范围内。在一些实施方案中，peg聚合物的聚乙烯部分的重复数约为3、4、5、10、15、25个单元，或其者之间的任何值。在一些实施方案中，peg可以是羧基取代的peg部分。在一些实施方案中，peg是羟基取代的peg部分。在一些实施方案中，多个表面封闭配体中的每一个可以具有长度与多个其他配体的连接部分相同的连接部分。在其他实施方案中，多个表面封闭配体的连接部分可以具有变化的长度。在一些实施方案中，对于多个表面封闭配体中的每一个，表面封闭基团和连接部分的长度可以相同。

或者，表面封闭基团和连接部分的长度可以在多个表面封闭配体内变化，并且可以包括以任何组合选择的2、3或4个不同的表面封闭基团和/或2、3、4或更多个不同的长度。通常，表面封闭配体具有足够短的长度和/或结构，从而不会在空间上阻碍活化配体的结合和/或功能。例如，在一些实施方案中，表面封闭配体的长度等于或小于与表面结合的其他连接基(例如，连接偶联基团或活化配体的连接基)的长度。在一些实施方案中，表面封闭配体的长度比与表面结合的其他连接基(例如，连接活化配体/分子的连接基)的长度小约1或更多埃(例如，约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多埃)。在一些实施方案中，表面封闭配体的长度比与表面结合的其他连接部分的长度小约1至约100埃(例如，约2至约75埃，约3至约50埃，约4至约40埃或约5至约30埃)。当表面封闭配体的连接部分长度等于或稍小于与表面结合的其他连接部分的长度时，所得表面可以在孔板的孔内提供更具生物相容性的表面，或者可以防止生物微物体不期望的附着，从而防止不期望的附着或生物污染，同时提供活化分子与表面结合的完全通道。

在一些变型中，表面封闭试剂117或121可以具有附接至三烷氧基硅氧烷的亚烷基氧化物、烷基或者取代的亚烷基氧化物或烷基部分。亚烷基氧化物、烷基或者取代的亚烷基氧化物或烷基部分可以是直链部分，并且可以具有至少4个原子，至少8个原子，至少12个原子，至少16个原子，至少20个原子，至少50个原子或至少100个原子或更多的直链主链长度，其可以是碳、氧、氮或硫。

制备方法

孔板表面的长度反应性部分的区域。制备包括具有反应性部分(例如呈递叠氮基或呈递炔基)共价功能化的区域的表面的孔板包括使孔板的一部分表面的表面暴露部分(例如，氧化物部分)与含叠氮基的偶联剂接触；并形成孔板的呈递反应性部分的共价功能化的区域。孔板的表面包含玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺，由其组成或者基本由其组成。在使表面的该部分的表面暴露部分与含叠氮基的偶联剂接触之前，可以对孔板的表面进行等离子体清洁。在偶联反应期间，含反应性部分的偶联剂可以在气相或液相中与表面暴露部分接触。含有反应性部分的偶联剂可以包括具有5至9个碳的碳主链的连接基。在一些实施方案中，连接基可以具有7个碳的碳主链。

呈递反应性部分(例如，呈递叠氮基)的共价功能化的区域的叠氮基密度可以为至少50/um²(例如，约50个叠氮基/um²至约2×10⁷/um²，约1×10²/um²至约1×10⁷/um²；约50/um²至约5×10⁶/um²；约1×10²/um²至约1×10⁶/um²；约1×10²/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约1×10²/um²至约5×10⁴/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；或其之间的任何叠氮基数目/um²的值)。

与表面接触可以包括使孔板的一个或多个孔中的每一个的表面与含反应性部分(例如，含叠氮基)的偶联剂接触，形成在一个或多个孔中的每一个中具有呈递反应性部分的共价功能化的区域的表面。接触可以包括使相应孔的底部表面与含反应性部分的偶联剂接触，从而在一个或多个孔中的每一个的底部表面上形成呈递反应性部分的共价功能化的区域。在其他实施方案中，可以接触孔板的所有表面，并且呈递反应性部分的区域可以延伸到孔板的所有表面。

在一些实施方案中，与一个或多个孔中的每一个的底部表面接触可以包括仅与底部表面接触，从而仅在一个或多个孔中的每一个的底部表面上形成呈递反应性部分(例如叠氮基)的共价功能化的区域。

制备孔板表面的呈递生物素的共价功能化的区域。制备包含具有呈递生物素的共价功能化的区域的表面的孔板包括使孔板的表面的一部分与包含与反应性基团相连的生物素部分的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性(例如，叠氮基或炔基)部分反应，从而形成孔板的呈递生物素的功能化的区域。该方法可以还包括使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性(例如，叠氮基或炔基)部分反应，从而提供表面的封闭配体修饰的区域。封闭配体修饰的区域和呈递生物素的区域可以覆盖整个表面。在一些变型中，封闭配体修饰的区域和呈递生物素的区域可以是表面的非重叠区域。

使孔板的表面的一部分与具有与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触可以包括与孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面接触。与一个或多个孔中的每一个接触可以还包括使一个或多个孔中的每一个在对应孔的底部表面处与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，从而在相应孔的底部表面上产生呈递生物素的共价功能化的区域。在一些实施方案中，反应性部分(例如，叠氮基部分)被设置在孔板的一个或多个孔内，并且任选地，可以仅设置在一个或多个孔内。

在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域可以仅形成在相应孔的底部表面上。呈递生物素的共价功能化的区域的生物素官能团的密度可以为至少50/um²(例如，约50个生物素基团/um²至约5×10⁶/um²，约1×10²/um²至约1×10⁶/um²；约1×10²/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约1×10²/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或其间的任何生物素基团数目/um²的值)。

呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以小于至少一个孔的底部面积的约50％。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域的面积可以为至少一个孔的底部面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％或小于约1％。呈递生物素的共价功能化的区域的面积小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²或小于约1mm²。在一些实施方案中，呈递生物素的共价功能化的区域的尺寸可以为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。呈递生物素的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且可以具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

该方法可以还包括使一个或多个孔中的每一个的底部的多个区域与含生物素的试剂接触，以在一个或多个孔中的每一个中产生多个呈递生物素的区域。

在一些实施方案中，包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂可以是铜依赖性点击偶联剂。在含生物素的铜依赖性点击偶联剂与反应性部分(例如，叠氮基部分)反应后，可以使孔板的表面与含硫醇的试剂或铜螯合剂接触，以终止铜依赖性试剂的任何进一步反应。在使铜依赖性点击偶联剂失能后，可以用包含表面封闭配体的试剂处理表面，以允许明显不同的区域(如图6a所示，其中被荧光标记的结合对所标记的共价功能化的区域193、共价功能化的区域195和共价功能化的区域197显示出根据意愿精确控制的试剂沉积)具有约1.0mm至约3-4mm的直径(参见图6b)。

每个表面封闭配体可以是本文所述的任何表面封闭配体，并且可以使用表面封闭配体的任何合适的混合物。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括亲水性的或带负电荷的部分。在一些变型中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。

在一些实施方案中，该方法可以还包括使一个或多个孔的每一个的一个或多个表面与包含配体的试剂接触，该配体被配置为提供粘附刺激。这通常可以在引入呈递生物素的区域之后进行。在各种实施方案中，将提供粘附刺激的配体引入到呈递生物素的区域外部的表面部分。

制备孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。一种制备包含具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的孔板的方法，包括使孔板的表面的一部分与包括与反应性基团连接的链霉亲和素官能团的试剂或包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分(例如，叠氮基或炔基部分)反应，并且当试剂包括与反应性基团连接的生物素部分时，随后与表面的带有链霉亲和素的部分接触，从而形成孔板的呈递链霉亲和素的功能化的区域。该方法可以还包括使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分(例如，叠氮基或炔基)反应，以形成表面的封闭配体修饰的区域。当使用包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂时，在引入呈递生物素的表面之后引入链霉亲和素，其中链霉亲和素与生物素部分结合。

在一些实施方案中，封闭配体修饰的区域和呈递链霉亲和素的区域可以覆盖整个表面。在各种实施方案中，封闭配体修饰的区域和呈递链霉亲和素的区域可以是表面的非重叠区域。使孔板的表面的一部分与试剂接触可以还包括使孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面接触。

在一些其他实施方案中，接触可以包括使一个或多个孔中的每一个在相应孔的底部表面处与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以仅形成在相应孔的底部表面上。

呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团的密度可以为至少50/um²，例如，约50个链霉亲和素基团/um²至约8×10⁵/um²，约1×10²/um²至约8×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或其间的链霉亲和素基团数目/um²的任何值。

在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以小于至少一个孔的底部的面积的约50％。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积可以为至少一个孔的底部的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％或小于约1％。呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²或小于约1mm²。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的尺寸。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

在一些实施方案中，接触可以包括使一个或多个孔中的每一个的底部的多个区域与包含与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或与包含与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触(然后与链霉亲和素反应，以与刚刚引入的生物素部分结合)，以在一个或多个孔中的每一个中产生多个呈递链霉亲和素的区域。

在一些实施方案中，包含与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或包含与反应性基团连接的生物素部分的试剂可以是铜依赖性点击偶联剂，并且在反应之后可以使孔的表面与含硫醇的试剂或铜螯合剂接触，以使任何铜依赖性点击偶联剂失活。这可以包括处理已经进行了铜依赖性点击偶联反应的一个或多个孔中的每一个。随后，可以进行引入表面封闭配体的反应，其包括使表面与包含表面封闭配体的试剂接触。

每个表面封闭配体可以是本文所述的任何表面封闭配体，并且可以使用表面封闭配体的任何合适的混合物。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括亲水性的或带负电荷的部分。在一些变型中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。

在一些实施方案中，该方法可以还包括使一个或多个孔中的每一个的一个或多个表面与包含配体的试剂接触，该配体被配置为提供粘附刺激。这通常在引入呈递链霉亲和素的区域之后进行。在各种实施方案中，将提供粘附刺激的配体引入到呈递链霉亲和素的区域外部的表面部分。

制备孔板表面的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。制备包含具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的孔板的另一种方法包括在表面上形成呈递反应性部分(例如，叠氮基或炔基)的共价功能化的表面，其中表面的呈递反应性部分的共价修饰的配体还包括紫外线不稳定的连接部分，但是其他如上文所述地进行。然后使表面与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或包含与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，其中反应性基团被配置为与呈递反应性部分的表面的反应性部分反应，从而形成呈递链霉亲和素的功能化的区域或呈递生物素的功能化的表面，并且进一步地，其中当试剂包含与反应性基团连接的生物素部分时，随后使孔板的部分与链霉亲和素接触。然后通过被配置为暴露表面的一部分之外的所有表面的掩模，使该表面暴露于uv照射下。在链霉亲和素或生物素修饰的表面配体的uv不稳定连接基暴露于uv照射的任何地方，这裂解链霉亲和素或生物素修饰的表面配体的uv不稳定连接基，从而形成孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。

在一些实施方案中，形成呈递反应性部分的共价修饰的表面包括使含反应性部分(例如，叠氮基或炔基)的偶联剂与孔板表面的表面暴露的部分(例如氧化物)反应，其中含反应性部分的偶联剂还包括uv不稳定的连接部分。在使表面的氧化物部分与含反应性部分的偶联剂接触之前，可以对孔板的表面进行等离子体清洁。

使孔板的表面与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或包括生物素部分的试剂接触，可以包括使孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面接触。

一个或多个孔中的每一个可以在相应孔的底部表面处与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，从而在相应孔的底部表面上产生呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。在一些实施方案中，呈递链霉亲和素的共价功能化的区域可以仅形成在相应孔的底部表面上。呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团的密度为至少50/um²，例如，约50个链霉亲和素基团/um²至约8×10⁵/um²，约1×10²/um²至约8×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁵/um²；约1×10²/um²至约1×10⁵/um²；约50/um²至约5×10⁴/um²；约1×10²/um²至约1×10⁴/um²；约1×10²/um²至约5×10³/um²；约1×10²/um²至约1×10³/um²；约50/um²至约5×10²/um²；约50/um²至约1×10²/um²；或其间的链霉亲和素基团数目/um²的任何值。

制备包含具有淋巴细胞活化共价功能化的区域的表面的孔板。制备孔板表面的淋巴细胞活化共价功能化的区域的方法包括使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个主活化分子接触，每个主活化分子均包括结合部分，其中主活化分子的结合部分被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，从而提供淋巴细胞活化共价功能化的区域。该方法可以还包括使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，从而产生表面的封闭配体修饰的区域。封闭配体修饰的区域和淋巴细胞活化共价功能化的区域可以覆盖整个表面。在一些实施方案中，封闭配体修饰的区域和淋巴细胞活化共价功能化的区域可以是表面的非重叠区域。

孔板的一个或多个孔中的每一个内的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域表面可以与多个主活化分子接触。在一些实施方案中，使一个或多个孔中的每一个接触可以还包括使一个或多个孔中的每一个在对应孔的底部表面处与多个主活化分子接触，从而在相应孔的底部表面上产生淋巴细胞活化共价功能化的区域。

在一些实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域可以仅形成在相应孔的底部表面上。任选地，淋巴细胞活化共价功能化的区域可以不形成在一个或多个孔的侧壁上。

如此引入的淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约50％。在一些实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积可以为一个或多个孔的底部面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％或小于约1％。

在一些实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²。淋巴细胞活化共价功能化的区域的尺寸可以为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。在各种实施方案中，淋巴细胞活化共价功能化的区域可以是基本上是圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

在一些实施方案中，一个或多个孔中的每一个中的多个淋巴细胞活化共价功能化的区域可以通过使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域在每个孔内的多于一个位置处与主活化分子接触而引入。多个淋巴细胞活化共价功能化的区域中的每一个的面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约5％。在一些实施方案中，多个淋巴细胞活化共价功能化的区域的总面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约50％，约25％或约10％。

在一些实施方案中，待活化的淋巴细胞可以是t细胞、天然杀伤t(nkt)细胞或b细胞。在各种实施方案中，第一活化分子可以是本文所述的任何合适的活化分子。在一些实施方案中，第一活化分子可以是分化结合分子、细胞表面免疫球蛋白结合分子、t细胞受体分子活化分子、tnf受体超家族结合分子、趋化因子受体结合分子、生长因子分子或粘附促进分子的细胞表面簇。在一些实施方案中，多个第一活化分子包含mhc分子、保留分化结合活性的细胞表面簇的蛋白质或其片段、保留t细胞受体结合活性的蛋白质或其片段、保留tnf受体超家族结合活性的蛋白质或其片段、保留趋化因子受体结合活性的蛋白质或其片段、保留生长刺激活性的蛋白质或其片段或者保留粘附促进活性的蛋白质或其片段。在各种实施方案中，多个第一活化分子包含保留分化结合活性的细胞表面簇的蛋白质或其片段、保留生长刺激活性的蛋白质或其片段或者保留粘附促进活性的蛋白质或其片段。

多个特异性结合的第一活化分子配体在淋巴细胞活化共价功能化的区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

该方法可以还包括使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个第二活化分子接触，每个第二活化分子均包含结合部分，其中第二活化分子的结合部分被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，从而在淋巴细胞活化共价功能化的区域中提供多个特异性结合的第二活化分子配体。

第二活化分子可以是t细胞受体(tcr)共活化分子、细胞表面免疫球蛋白结合分子、tnf受体超家族结合分子、趋化因子受体结合分子、生长因子分子或粘附促进分子。多个特异性结合的共活化分子配体在淋巴细胞活化共价功能化的区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

该方法可以还包括使孔板的表面与包含与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，从而提供表面的封闭配体修饰的区域。在一些实施方案中，封闭配体修饰的区域和呈递抗原的共价功能化的区域可以覆盖整个表面。在一些实施方案中，封闭配体修饰的区域和淋巴细胞活化共价功能化的区域可以是表面的非重叠区域。

每个表面封闭配体可以是本文所述的任何合适的表面封闭配体。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包含亲水性的或带负电荷的部分。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。

制备包含具有淋巴细胞活化共价功能化的区域的表面的孔板。一种制备包含具有用于活化t细胞的孔板的呈递抗原的共价功能化的区域的表面的孔板的方法包括使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个主活化分子接触，每个主活化分子包括被配置为与t细胞的t细胞受体结合的主要组织相容性复合体(mhc)分子，和结合部分，其中多个主活化分子的结合部分被配置为与链霉亲和素的结合位点结合；使多个共活化分子(每个共活化分子包括：t细胞受体(tcr)共活化分子；或辅助tcr活化分子，其中共活化分子各自还包括被配置为与链霉亲和素的结合位点结合的结合部分)与孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的第二多个结合部分接触，从而提供孔板的呈递抗原的共价功能化的区域的多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体。

该方法可以还包括使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，从而提供表面的封闭配体修饰的区域。封闭配体修饰的区域和呈递抗原的共价功能化的区域可以覆盖整个表面。在一些实施方案中，封闭配体修饰的区域和呈递抗原的共价功能化的区域可以是表面的非重叠区域。

使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个主活化分子和多个共活化分子接触可以包括使孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面接触。在一些实施方案中，使一个或多个孔中的每一个接触可以还包括使一个或多个孔中的每一个在对应孔的底部表面处与多个主活化分子和多个共活化分子接触，从而在相应孔的底部表面上产生呈递抗原的共价功能化的区域。在一些实施方案中，呈递抗原的共价功能化的区域可以仅形成在相应孔的底部表面上。

在一些实施方案中，呈递抗原的共价功能化的区域的面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约50％。在一些实施方案中，呈递抗原的共价功能化的区域的面积为一个或多个孔的底部面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％或小于约1％。

在一些实施方案中，呈递抗原的共价功能化的区域的面积可以小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²。在一些实施方案中，呈递抗原的共价功能化的区域的尺寸可以为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。在一些实施方案中，呈递抗原的共价功能化的区域可以是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个主活化分子和多个共活化分子接触可以还包括使孔板的一个或多个孔中的每一个内的多个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域接触，从而在一个或多个孔中的每一个中产生多个呈递抗原的共价功能化的区域。在一些实施方案中，多个呈递抗原的共价功能化的区域中的每一个的面积可以小于一个或多个孔的底部面积的约5％，并且进一步地，其中多个呈递抗原的共价功能化的区域的总面积为一个或多个孔的底部面积的小于约50％，约25％或约10％。

在一些实施方案中，mhc分子包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。在一些实施方案中，包括mhc分子的多个主活化分子中的每一个可以还包括抗原肽。抗原肽可以是肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原等。在一些实施方案中，肿瘤相关的抗原可以是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

在一些实施方案中，mhc分子的蛋白质序列可以经由蛋白质序列的c末端连接而连接至表面。例如，mhc蛋白质序列可以包括c末端bira标签。bira标签允许位点特异性的生物素化。在一些实施方案中，mhc分子可以包括生物素部分，并通过与链霉亲和素的非共价相互作用而附接于表面。在各种实施方案中，链霉亲和素自身共价键合至表面。在一些实施方案中，链霉亲和素可以通过一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长，或其间的任意数目的键长键合至表面。

在各种实施方案中，链霉亲和素可以与表面非共价缔合。链霉亲和素可以与生物素部分非共价缔合，并且生物素部分可以与表面共价键合。在各种实施方案中，生物素部分可以通过连接基通过约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长，或其间的任意数目的键长连接至表面。

主活化分子与共活化分子的比率可以为约1:1至约2:1；约1:1；或约3:1至约1:3。

在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约100:1至约1:100。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或1:90至1:100，其中每个前述值均用“约”修饰。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约20:1至约1:20或约3:1至约1:3。

多个特异性结合的主活化分子配体在呈递抗原的共价功能化的区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

多个特异性结合的共活化分子配体在呈递抗原的共价功能化的区域中的呈递抗原的合成表面上的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

在一些实施方案中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。cd28结合蛋白或其片段可以还包括位点特异性的c末端生物素部分。在一些实施方案中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括cd80分子或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性。在一些实施方案中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括抗cd28抗体或其片段。

在一些实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括cd2结合蛋白。cd2结合蛋白或其片段可以还包括位点特异性的c末端生物素部分。在一些实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括cd58分子或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性。在一些实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括抗cd2抗体或其片段。

每个表面封闭配体可以是本文所述的任何合适的表面封闭配体。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包含亲水性的或带负电荷的部分。在一些实施方案中，表面封闭配体可以包括聚乙二醇(peg)部分。

具有上述共价功能化的区域的培养板/培养瓶的制备方法。作为孔板的另一个实施方案，培养板(例如，圆形培养板)和/或培养瓶也可以具有引入其中的任何共价功能化的表面，例如呈递反应性部分(例如，呈递叠氮基或呈递炔基)的、呈递生物素的、呈递链霉亲和素的、呈递抗原的和/或淋巴细胞活化共价功能化的区域。呈递叠氮基的共价功能化的区域可以如上所述地被类似地引入到整个培养板/瓶中。可以对培养板/瓶进行或不进行等离子体清洁。可以将培养板/瓶的全部或部分暴露于反应性部分功能化试剂并进行功能化。可以使用任何种类的合适的点样工具在第一区域的阵列中的培养板中引入随后的呈递生物素和/或链霉亲和素的区域。可以将微操纵器插入到培养瓶中，以在阵列中引入随后的呈递生物素和/或链霉亲和素的共价功能化的区域。培养板和培养瓶都可以具有共价功能化的区域的阵列，每个区域具有如本文所述的适合于活化淋巴细胞的大小(例如面积)，并且可以通过如本文所述地引入表面封闭配体来使周围区域和其他表面(例如培养瓶的剩余侧面或培养板的侧壁)钝化。可以与上述孔板类似地引入活化和共活化分子配体，并且如本文的方法中所述，可以使用呈递抗原的或淋巴细胞活化培养板/培养瓶来活化淋巴细胞。

点击化学和试剂。共价键可通过使炔烃如无环炔烃与叠氮化物反应而形成。例如，可以进行“点击”环化反应，其由铜(i)盐催化。当使用铜(i)盐催化反应时，反应混合物可以任选地包括其他可以提高反应速率或程度的试剂。当例如表面修饰试剂或功能化的表面的炔烃是环辛炔时，与相应的功能化的表面或表面修饰试剂的叠氮化物的“点击”环化反应可以是无铜的。由此可以使用“点击”环化反应将表面修饰配体偶联至功能化的表面以形成共价修饰的表面。

铜催化剂。可以使用任何合适的铜(i)催化剂。在一些实施方案中，使用碘化铜(i)、氯化铜(i)、溴化铜(i)或另一种铜(i)盐作为铜(i)催化剂。在其他实施方案中，可以使用与还原剂例如抗坏血酸盐组合的铜(ii)盐，以原位产生铜(i)物质。硫酸铜或乙酸铜是合适的铜(ii)盐的非限制性实例。在其他实施方案中，还原剂例如抗坏血酸盐可以与铜(i)盐组合存在，以确保在反应过程中足够的铜(i)物质。可以使用铜金属在氧化还原反应中提供cu(i)物质，也产生cu(ii)物质。可以使用铜的配位络合物，例如[cubr(pph3)3]、铜的硅钨酸盐络合物、[cu(ch3cn)4]pf6或(eto)3pcui。在其他实施方案中，可以采用二氧化硅负载的铜催化剂、铜纳米簇或铜/氧化亚铜纳米颗粒作为催化剂。

其他反应促进剂。如上文所述，即使没有严格地从反应中排除氧，也可以使用还原剂例如抗坏血酸钠来维持整个反应中的铜(i)物质。可以在反应中包括其他辅助配体，以稳定铜(i)物质。可以使用含三唑基的配体，包括但不限于三(苄基-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲胺(tbta)或3[三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(thpta)。可以用来促进反应的另一类辅助配体是磺化的红菲绕啉，其也是水溶性的，可以在排除氧气的情况下使用。

使用方法

使用孔板表面的呈递抗原的共价功能化的区域来活化t淋巴细胞。一种活化t淋巴细胞(t细胞)的方法包括使多个t细胞与孔板的一个或多个孔的表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触。呈递抗原的共价功能化的区域可以包括：多个主活化分子配体，每个主活化分子配体包括主要组织相容性(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，其中多个主活化分子配体中的每一个均连接至一个或多个孔的表面；以及多个共活化分子配体，每个共活化分子配体均包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子，其中每个共活化分子配体均连接至一个或多个孔的表面。活化方法可以还包括培养与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的多个t细胞，从而将多个t细胞的至少一部分转化为活化的t细胞。在一些实施方案中，与呈递抗原的共价功能化的表面接触放置的t细胞包括cd8+t细胞。

在一些实施方案中，孔板的一个或多个孔的表面的呈递抗原的共价功能化的区域是具有特征的任何组合的本文所述的任何呈递抗原的共价功能化的区域。

在一些实施方案中，多个共活化分子配体可以包括tcr共活化分子和辅助tcr活化分子。多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约100:1至约1:100。多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或1:90至1:100，其中每个前述值均用“约”修饰。在各种实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约20:1至约1:20或约3:1至约1:3。

在一些实施方案中，多个mhc分子各自可以包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。在一些实施方案中，mhc分子的蛋白质序列可以经由蛋白质序列的c末端连接而连接至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。在一些实施方案中，mhc分子可以还包括抗原肽。在一些实施方案中，抗原肽是肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原等。在一些实施方案中，肿瘤相关的抗原是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。在各种实施方案中，mhc分子可以包括生物素部分，并经由与链霉亲和素的非共价相互作用而附接于表面的呈递抗原的共价功能化的区域。

在一些实施方案中，链霉亲和素自身可以共价键合至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。链霉亲和素可以通过一系列约5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长或其间的任意数目的键长键合到表面。在其他实施方案中，链霉亲和素可以与表面的呈递抗原的共价功能化的区域非共价缔合。在一些实施方案中，链霉亲和素可以与生物素部分非共价缔合，并且生物素与表面的呈递抗原的共价功能化的区域共价键合。生物素部分可以通过连接基通过一系列2、约5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长或其间的任何数目的键长连接至表面。

在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的每一个可以连接至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。

在一些实施方案中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。cd28结合蛋白或其片段可以还包括位点特异性的c末端生物素部分。在一些其他实施方案中，t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括cd80分子或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性。t细胞受体(tcr)共活化分子可以包括抗cd28抗体或其片段。

在各种实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括cd2结合蛋白。cd2结合蛋白或其片段可以还包括位点特异性的c末端生物素部分。在各种实施方案中，辅助tcr活化分子可以包括cd58分子或其片段，其中该片段保留与cd2的结合活性。辅助tcr活化分子可以包括抗cd2抗体或其片段。

特异性结合的主活化分子配体在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。特异性结合的共活化分子配体在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的密度可以为至少约1×10²个分子/平方微米，约5×10²个分子/平方微米，约1×10³个分子/平方微米，约5×10³个分子/平方微米，约1×10⁴个分子/平方微米，约5×10⁴个分子/平方微米，约1×10⁵个分子/平方微米，或约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。在一些实施方案中，共价修饰的表面上的主活化分子配体与共活化分子配体的比率可以为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1，或约1:2至约1:1。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约3:1至约1:3。在一些实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约2:1至约1:2。在其他实施方案中，多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率可以为约1:1。

该方法可以还包括使多个t细胞与包括icam分子的多个刺激粘附的分子配体接触，其中多个刺激粘附的分子配体中的每一个均附接于孔板表面的呈递抗原的共价功能化的区域之外的区域。在一些实施方案中，多个刺激粘附的分子配体可以共价附接到孔板表面的呈递抗原的共价功能化的区域之外的区域。

在一些实施方案中，该方法可以还包括使多个t细胞与多个生长刺激性分子配体接触。每个生长刺激性分子配体可以包括生长因子受体配体。在一些实施方案中，生长因子受体配体可以包括il-21或其片段。

在一些实施方案中，可以在至少一天的第一培养时间之后，使多个t细胞与多个生长刺激性分子配体接触。培养与呈递抗原的合成表面接触的t细胞可以进行约4天至约7天的时间。

在一些实施方案中，该方法还包括完成与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的第一活化时间段；并且，将与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的多个经活化的t细胞培养第二培养时间段，从而提供扩增的多个活化的t细胞。在第二培养时间段期间可以添加第二多个生长刺激性分子配体。可以添加多个il-2分子和多个il-7分子以在第二培养时间段的剩余时间内与活化的t细胞接触。在一些实施方案中，与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触培养以进行第二培养可以进行约四天至约七天的时间。

该方法可以还包括完成与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的第二活化时间段；以及将与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的扩增的多个活化的t细胞培养第三培养时间段，从而提供多个高度活化的t细胞。在第三培养时间段期间可以添加第三多个生长刺激性分子配体。在一些实施方案中，可以添加多个il-2分子和多个il-7分子以在第三培养时间段的剩余时间内与活化的t细胞接触。与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触培养可以进行约四天至约七天的第三时间段。

表型和产品。在一些实施方案中，被活化的t淋巴细胞包括cd8+t淋巴细胞，例如初始cd8+t淋巴细胞。在一些实施方案中，被活化的t淋巴细胞可以富含cd8+t淋巴细胞，例如初始cd8+t淋巴细胞。或者，在一些实施方案中，被活化的t淋巴细胞可以包括cd4+t淋巴细胞，例如初始cd4+t淋巴细胞。在一些实施方案中，被活化的t淋巴细胞富含cd4+t淋巴细胞，例如初始cd4+t淋巴细胞。可以使用cd4+t淋巴细胞，例如，如果需要对ii类限制性抗原具有特异性的t细胞。

在一些实施方案中，该方法产生为cd45ro+的活化的t淋巴细胞。在一些实施方案中，该方法产生为cd28阳性的活化的t淋巴细胞。在一些实施方案中，该方法产生为cd28+cd45ro+的活化的t淋巴细胞。在一些实施方案中，该方法产生为cd197+的活化的t淋巴细胞。在一些实施方案中，该方法产生为cd127+的活化的t淋巴细胞。在一些实施方案中，该方法产生对cd28、cd45ro、cd127和cd197，或前述标记物中三种的至少任何组合，或前述标记物中两种的至少任何组合为阳性的活化的t淋巴细胞。具有任何前述表型的活化的t淋巴细胞可以进一步是cd8+。在一些实施方案中，为cd28+的任何前述表型包含cd28高表型。

在一些实施方案中，该方法产生包含抗原特异性t细胞的t细胞群，其中至少65％，70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％或98％的抗原特异性t细胞是cd45ro+/cd28高细胞，其中前述每个值均可以被“约”修饰。

替代地或另外，在一些实施方案中，该方法产生t细胞群，其中至少1％，1.5％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％的t细胞是抗原特异性t细胞；或者其中1％-2％，2％-3％，3％-4％，4％-5％，5％-6％，6％-7％，7％-8％，8％-9％，9％-10％，10％-11％或11％-12％的t细胞是抗原特异性t细胞，其中每个前述值均可以被“约”修饰。t细胞群的含量可以在与呈递抗原的表面接触以及任选的进一步扩展步骤之后，即在富集或分离具有特定表型的产物t细胞之前/不进行富集或分离的情况下，在该方法的“粗”产物上确定。抗原特异性和/或t细胞标记物表型的确定可以排除死细胞。在一些实施方案中，该方法提供了t细胞群，其中相对于起始群而言，抗原特异性的t细胞的比率增加。

使用采用本文所述方法活化的细胞治疗受试者。一种治疗需要治疗癌症的受试者的方法，包括从受试者获得多个t淋巴细胞(t细胞)；使该多个t细胞与包括呈递抗原的共价功能化的区域的孔板的表面接触，其中该呈递抗原的共价功能化的区域包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与多个t细胞中的每一个的t细胞受体结合，其中该mhc分子包括对受试者的癌症具有特异性的抗原；产生多个活化的t细胞，其中活化被配置为对受试者的癌症具有特异性；将多个特异性活化的t细胞与未活化的细胞分离；以及将多个抗原特异性活化的t细胞引入到受试者中。

具有包括呈递抗原的共价功能化的区域的表面的孔板可以是包括本文所述的任何呈递抗原的共价功能化的区域的孔板，并且可以具有特征的任何组合。可以通过本文所述的任何方法并以任何步骤组合来生产具有包括呈递抗原的共价功能化的区域的表面的孔板。

一种治疗需要治疗癌症的受试者的方法包括从受试者获得多个t淋巴细胞(t细胞)；通过类似于本文所述的任何方法的方法产生多个活化的t细胞，其中活化被配置为对受试者的癌症具有特异性；将多个特异性活化的t细胞与未活化的细胞分离；以及将多个抗原特异性活化的t细胞引入到受试者中。

还提供了多个特异性活化的t淋巴细胞在制备用于治疗需要治疗癌症的受试者的药物中的用途，其中所述多个特异性活化的t淋巴细胞是通过本文所述的方法产生的。还提供了多个特异性活化的淋巴细胞在制备用于治疗需要治疗癌症的受试者的药物中的用途，其中所述多个特异性活化的淋巴细胞是通过本文所述的方法产生的。还提供了多个特异性活化的淋巴细胞在制备用于治疗需要治疗蛋白质缺乏症或免疫学病症的受试者的药物中的用途，其中所述多个特异性活化的淋巴细胞是通过本文所述的方法产生的。

在一些实施方案中，分离多个特异性活化的淋巴细胞可以还包括检测特异性活化的淋巴细胞的表面生物标记物。

在一些实施方案中，特异性活化的淋巴细胞是自体的(即，源自要对其施用的受试者)，并且可以使用本文所述的表面和活化方法快速扩增。

在各种实施方案中，制备多种特异性活化的t淋巴细胞或者特异性活化的t淋巴细胞的群体的方法可以还包括快速扩增活化的t淋巴细胞以提供扩增的活化的t淋巴细胞的群体。在一些实施方案中，可以在将特异性活化的t淋巴细胞与未活化的t淋巴细胞分离之后进行快速扩增。可以使用本文所述或本领域已知的快速扩增方法来实现足够水平的t淋巴细胞的产生。参见例如下面的实例；riddell，us5,827,642；riddell等，us专利号6,040,177，以及yee和li，pct专利申请公开号wo2009/045308a2。

t细胞在治疗人类受试者中的用途(例如用于过继细胞疗法)是本领域已知的。根据本文所述的方法制备的t细胞可以用于此类方法。例如，已经在临床中测试了使用包括mart-1抗原特异性t细胞的肿瘤浸润淋巴细胞的过继细胞疗法(powell等人,blood105:241-250,2005)。而且，在chang等人,j.clinicaloncology21:884-890,2003中描述了与抗cd3单克隆抗体和il-2共活化的t细胞的施用。在dudley等人science298:850-854,2002；roszkowski等人,cancerres65(4):1570-76,2005；cooper等人blood101:1637-44,2003；yee,us专利申请公开号2006/0269973；yee和li,pci专利申请公开号wo2009/045308a2；gruenberg等人,us专利申请公开号2003/0170238；rosenberg,us专利号4,690,915；和alajez等人,blood105:4583-89,2005中提供了用于治疗癌症的t细胞施用的其他实例和/或讨论。

对nk细胞或nkcar细胞的治疗用途的兴趣已经增加，并且如ebiomedicine39:1-2,2019中所述，正在针对广泛的血液学和实体瘤研究这些细胞类型。

最近已经报道了b淋巴细胞用作工程化的b细胞，用于递送治疗性蛋白质以用于广泛的应用，包括诸如血友病的蛋白质缺乏症，以及其他免疫疗法。

在一些实施方案中，通过首先如本文所述的活化方法中所使用的那样从其培养基中收获细胞，然后在适合于以治疗有效量施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体(earner))中洗涤并浓缩细胞来配制细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、normosoir(abbott)或plasma-lytea(baxter)，但也可以使用5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸盐。输注介质中可以补充有人血清白蛋白。

在一些实施方案中，组合物中的细胞数目为至少10⁹或至少10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，单个剂量可以包含至少1000万、1亿、10亿或100亿个细胞。施用的细胞数目是适应症特异性的、患者特异性的(例如，患者的大小)，并且也会随着所施用细胞的纯度和表型而变化。细胞数目将取决于组合物意图的最终用途，以及其中所包括的细胞的类型。例如，如果需要对特定抗原具有特异性的细胞，则该群体将包含大于70％、通常大于80％、85％和90-95％的此类细胞。对于本文提供的用途，细胞通常为一升或更少的体积，可以为500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所需细胞的密度可以大于10⁶个细胞/ml，大于10⁷个细胞/ml，或10⁸个细胞/ml或更大。可以将临床上相关的免疫细胞数目分配为多个输注，这些输注累计等于或超过10⁹、10¹⁰或10¹¹个细胞。

在一些实施方案中，本文所述的或根据本文所述的方法制备的t淋巴细胞可以用于赋予个体抵抗肿瘤或癌细胞的免疫力。“免疫”是指减轻与癌细胞或肿瘤相关的针对淋巴细胞已被活化的抗原的一种或多种身体症状。可以通过输注来施用细胞，每次输注的范围至少为10⁶至10¹⁰个细胞/m²，例如，范围为至少10⁷至10⁹个细胞/m²。可以通过单次输注或在一段时间内多次输注来施用细胞。但是，由于期望不同的个体具有不同的响应度，因此所输注的细胞的类型和量以及输注次数和多次输注的时间范围由主治医生确定，并且可以通过检查来确定。

在将细胞转移回患者之后，可以采用方法通过用可以包括il-21和il-2的细胞因子治疗患者来维持其生存力(bear等人,cancerimmunol.lmmunother.50\2.69-74,2001；和schultze等人,br.j.haematol.113:455-60,2001)。在另一个实施方案中，在向患者施用之前，在il-21存在下培养细胞。参见例如yee的us专利申请公开号2006/0269973，il-21可以将包含活化的t细胞的群体中的t细胞频率增加到足够高以进行扩增和过继转移的水平，而无需进一步的抗原特异性t细胞富集。因此，这样的步骤可以进一步减少治疗时间和/或消除进一步选择和/或克隆的需要。

试剂盒

用于制备具有包含呈递抗原的共价功能化的区域的表面的孔板的试剂盒。一种用于制备孔板(包含具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面)的试剂盒包括：具有包括呈递生物素的共价功能化的区域的表面的孔板；以及包含链霉亲和素的表面功能化试剂。在一些实施方案中，具有包括呈递生物素的共价功能化的区域的表面的孔板可以是本文所述的任何具有包括呈递生物素的共价功能化的区域的表面的孔板，并且具有特征的任何组合。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括第一活化试剂，其包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，并且进一步地，其中mhc分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合。在一些实施方案中，多个mhc分子中的每一个可以还包括至少一个生物素官能团。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含共活化分子的试剂，每个共活化分子与链霉亲和素的结合位点结合，并且其中每个共活化分子可以是t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。在一些实施方案中，多个共活化分子可以包括t细胞受体(tcr)共活化分子和辅助tcr活化分子。在一些实施方案中，容纳包含共活化分子的试剂的容器可以包含tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20。在一些实施方案中，tcr共活化分子可以是cd28受体的激动剂。在一些实施方案中，辅助tcr活化分子是cd2受体的激动剂。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括表面封闭试剂，该表面封闭试剂包含连接至被配置为与叠氮基部分反应的反应性基团的表面封闭部分。

在一些实施方案中，表面封闭部分可以包括亲水性的或带负电荷的部分。

在一些实施方案中，表面封闭试剂可以包括聚乙二醇(peg)部分。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。在一些实施方案中，生长因子受体配体可以包括il-21或其片段。在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含il-7或il-2的第二生长刺激性分子。

用于制备孔板的试剂盒。在其他变型中，用于制备孔板(包括具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面)的试剂盒包括：包含具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面的孔板；和第一表面功能化试剂。在一些实施方案中，包含具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面的孔板可以是类似于任何本文所述的任何包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面的孔板。

在一些实施方案中，第一表面功能化试剂可以包括包含与反应性基团连接的生物素部分的试剂，其中反应性基团被配置为与表面的叠氮基部分反应。在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含链霉亲和素的第二表面功能化试剂，其被配置为与生物素部分结合。

在一些实施方案中，第一功能化试剂包含与反应性基团连接的链霉亲和素部分，其中所述反应性基团被配置为与叠氮基部分反应。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括表面封闭试剂，该表面封闭试剂包含连接至被配置为与叠氮基部分反应的反应性基团的表面封闭部分。

在一些实施方案中，表面封闭部分可以包括亲水性的或带负电荷的部分。

在一些实施方案中，表面封闭试剂可以包括聚乙二醇(peg)部分。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括第一活化试剂，该第一活化试剂包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，并且其中mhc分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合。在一些实施方案中，多个mhc分子中的每一个可以还包括至少一个生物素官能团。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含共活化分子的试剂，每个共活化分子与链霉亲和素的结合位点结合，并且其中每个共活化分子可以是t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。在一些实施方案中，多个共活化分子可以包括t细胞受体(tcr)共活化分子和辅助tcr活化分子。在一些实施方案中，容纳包含共活化分子的试剂的容器可以含有tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20。在一些实施方案中，tcr共活化分子可以是cd28受体的激动剂。在一些实施方案中，辅助tcr活化分子是cd2受体的激动剂。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。在一些实施方案中，生长因子受体配体可以包括il-21或其片段。在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含il-7或il-2的第二生长刺激性分子。

用于制备孔板的试剂盒。一种用于制备孔板(包含具有用于t淋巴细胞(t细胞)的抗原特异性活化的呈递抗原的共价功能化的区域的表面)的试剂盒，包括：包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的孔板；以及第一活化试剂，其包含多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，并且进一步地，其中mhc分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合。在一些实施方案中，包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的孔板可以类似于本文所述的任何包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的孔板，并且可以具有特征的任何组合。

在一些实施方案中，多个mhc分子中的每一个可以还包括至少一个生物素官能团。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含多个共活化分子的试剂，每个共活化分子具有被配置为与链霉亲和素的结合位点结合的结合部分，并且其中每个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含共活化分子的试剂，每个共活化分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，并且其中每个共活化分子可以是t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。在一些实施方案中，多个共活化分子可以包括t细胞受体(tcr)共活化分子和辅助tcr活化分子。在一些实施方案中，容纳包含共活化分子的试剂的容器可以包含tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20。在一些实施方案中，tcr共活化分子可以是cd28受体的激动剂。

在一些实施方案中，辅助tcr活化分子是cd2受体的激动剂。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括表面封闭试剂，该表面封闭试剂包含连接至被配置为与叠氮基部分反应的反应性基团的表面封闭部分。

在一些实施方案中，表面封闭部分可以包括亲水性的或带负电荷的部分。

在一些实施方案中，表面封闭试剂可以包括聚乙二醇(peg)部分。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。在一些实施方案中，生长因子受体配体可以包括il-21或其片段。在一些实施方案中，试剂盒可以还包括包含il-7或il-2的第二生长刺激性分子。

实施例

实验1。孔板的制备。将聚苯乙烯孔板(falcon96孔圆形底部，falcon96孔平坦底部，falcon6孔平坦底部，costar96孔v底部)放入氧气等离子清洁器(nordsonmarchap-300)中，将其抽空至50mtorr并用氧气在440sccm吹扫至190mtorr的压力。将板用100w等离子体处理60秒。

实验2。板的化学气相沉积(cvd)。内部合成了7-叠氮基庚基-三甲氧基硅烷。在三个20ml铝盘中装入300mg硅烷，在三个中装入333mgmgso4(h2o)7。将一盘的每种试剂放在真空烘箱中的三个架子中的每一个上。将孔板和核查用试样放置在每个架子上。将烘箱密封并抽空至250mtorr。将温度升至75℃，并且cvd进行过夜(～18小时)。在cvd过程之后，将烘箱吹扫，并移除孔板和核查用试样。

实验3。用二苄基环辛炔基(dbco)-聚乙二醇13(peg13)-链霉亲和素(sav)处理叠氮基修饰的孔板提供了具有受限的功能化区域的功能化的孔板。如2018年7月20日提交的pct/us2018/043146中所述地合成了dbco-peg13-sav的5μm溶液，其公开内容通过引用整体并入本文。dbco-peg13-sav是一种无铜的点击试剂，其具有二苯并环辛炔基偶联部分，该二苯并环辛炔基偶联部分通过与链霉亲和素共价附接的聚乙二醇连接基(13个peg单元)而连接，并且其在pbs/0.02％叠氮化钠中制备，以提供如图1b所示意性地示出的与孔板共价结合的sav。以250nl至50ul的体积将dbco-peg13-sav溶液添加到孔中，并使其仅接触孔的底部，而不接触每个孔的侧壁。孵育30分钟后，将孔用200ulpbs/叠氮化物洗涤两次，然后吸出。随后，将1.5mmdbco-peg5k(creativepegworks，目录号pls-9979)在pbs/叠氮化物中的溶液添加到孔中以完全填充它们。dbco-peg-5k表面封闭试剂是一种无铜的点击试剂，它含有分子量为5000da的聚乙二醇表面封闭配体，它与孔底部处的链霉亲和素修饰的区域之外(和周围)存在的剩余叠氮化物官能团反应。

实验4。使用淋巴细胞活化共价功能化的孔板制备活化的t细胞。

孔板的制备：制备了用于活化t细胞的共价功能化的孔板，其中孔板的孔具有不同比率的主活化配体和共活化配体。如实验5中所述类似地制备了链霉亲和素功能化的孔板，不同之处在于，将生物素-链霉亲和素功能化应用于每个孔的底部，而没有广泛地限制该区域(例如，功能化的区域扩展至孔的底部表面的基本上所有的面积)。

活化配体功能化：以100ug/ml制备了生物素缀合的抗cd3(主刺激)、抗cd28和抗cd2(共刺激)抗体的储备溶液，并以各种比率混合在pbs中(图3a)。最终总抗体浓度为50ug/ml。将50ul的每种活化配体溶液添加至各个孔中，并使其在室温下结合30分钟。接下来将微孔板孔用pbs洗涤一次，然后保持在4℃直到用于刺激t细胞。

制备用于刺激的t细胞：使用市售的人t细胞富集试剂盒(easysep^tm，stemcelltechnologies，目录号19051)从pbmc中富集cd3+t细胞。向活化板的每个孔中，涂布在200ult细胞培养基(添加有10％人ab血清(corning^tm，fisher目录号mt35060ci)、2mmglutamax^tm(thermofisher，目录号35050061)，50um2-巯基乙醇(thermofisher，目录号31350010)，25ng/mlil-7以及10ng/mlil-15(r&dsystems，目录号207-il/cf；247-ilb-005)的高级rpmi1640(gibco^tm，thermofisher，目录号12-633-012))中的200,000个cd3+t细胞。包括对照条件(条件12)，其中用1:1比率的抗cd3和抗cd28包被的珠(thermofisher，目录号11161d)来活化t细胞。将细胞培养4天，此时将来自每个孔的50ul细胞转移到新的、未处理的圆底96孔微孔板(corning，目录号3879)中，并添加150ul新鲜的t细胞培养基。在第4天，还从每个孔收集50ul样品以确定每个孔中的t细胞数目。在第7天，从每个孔中移出100ul的细胞，并用100ul的t细胞培养基代替。在第10天，从每个孔中移出100ul培养基，保持细胞完整，并用100ult细胞培养基代替。在第11天，从每个孔中收集200ul样品以确定每个孔中的t细胞数目，并评估cd28和cd27在t细胞上的表面表达。如图3b、3c和3d所示(提供了平均值和范围)，可以改变主刺激性配体(cd3)与共刺激性配体的比率，以在第4天(图3b)和第11天(图3c)提供有效的t细胞扩增，并提供cd27和cd28的共表达(图3d)。该实验表明，取决于附接至功能化的孔板的孔的活化配体，通常可以实现淋巴细胞活化，并且与使用cd3/cd28标记的珠(图3a的条件12)所观察到的活化和扩增相比，可以实现相似的活化和扩增水平。

实验5。制备孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的孔。如图1b所示，用dbco-peg4-生物素/dbco-peg5-酸处理叠氮基修饰的孔板(如实验1和2中所制备)。将10％dbco-peg4-生物素(broadpharm，目录号bp-22295)溶液(通过共价附接至生物素的聚乙二醇连接基(四个peg单元)连接的无铜的点击二苯并环辛炔基偶联部分)制备为0.2mm含生物素的点击试剂溶液，其还包括1.8mmdbco-peg5-酸(broadpharm，目录号bp-24056)，其是在pbs/0.02％叠氮化钠中制备的通过共价附接至羧酸部分的聚乙二醇连接基(五个peg单元)连接的无铜的点击二苯并环辛炔基偶联部分。peg5-酸点击试剂起表面封闭配体的作用。可以使用其他比率来改变引入到孔底部的生物素部分的密度。将该溶液以250nl至50μl的体积添加到孔中，其在孔底部的各自较大区域中提供共价连接的生物素部分。孵育30分钟后，将孔用200ulpbs/叠氮化物洗涤两次，然后吸出。制备链霉亲和素的2微摩尔溶液，并将其添加到孔中。将链霉亲和素非共价结合至生物素，生物素自身共价附接至孔的表面，如图1a所示。使用变化体积的含生物素的点击试剂，获得了含链霉亲和素的不同大小的区域。孵育15分钟后，将1.5mmdbco-peg5k(broadpharm目录号bp-22461)在pbs/叠氮化物中的溶液添加到孔中，充满孔并与仍存在于每个孔中(即，在被链霉亲和素和peg5-羧酸部分的组合所修饰的区域之外)的剩余叠氮基反应性部分反应。

实验6。区域限制性呈递抗原的t淋巴细胞活化孔板的制备。如实验1和2中所述，对标准的聚苯乙烯组织培养微孔板(corning)进行等离子体处理和功能化，以使用化学气相沉积来提供叠氮化物。使用自动液体处理机器人(opentrons)将pbs中的2微摩尔的dbco缀合的链霉亲和素(共价附接至表面的sav，如图1b所示)的1ul液滴置于功能化的96孔圆底微孔板的中心，以在孔的底部上提供大约1mm直径的链霉亲和素功能化的区域。没有将链霉亲和素引入到孔壁上。在生物安全柜中将点滴的液滴干燥到微孔板表面上。为了钝化剩余的叠氮化物基团，在孔中填充dbco-peg3000的1.5mm溶液，从而在孔内的剩余表面(即，孔底部上的链霉亲和素修饰的区域外部)引入peg3000表面封闭配体。将该溶液在室温下施加到孔中15分钟。然后将孔用pbs淋洗一次以除去未反应的dbco-peg3,000。

为了将t细胞活化配体与表面结合，将生物素缀合的肽-hla(主刺激)、抗cd28抗体和抗cd2抗体的混合物(共刺激)的混合物在缓冲液(具有2mmedta和0.5％牛血清白蛋白的pbs)中以各种浓度混合。对于肽-hla，当添加到微孔板中时，制备了四个三倍系列稀释液。对于抗cd28和抗cd2抗体，制备了四个九倍系列稀释液。(参见图4a)对于该实验，抗cd28:抗cd2的比率为1:1，但是其他比率可以成功地用于刺激t细胞。将肽-hla和抗体的系列稀释液进一步稀释到16管缓冲液中，以使肽-hla的终浓度为7.5ug/ml至0.28ug/ml，且共刺激抗体的终浓度为15ug/ml至0.02ug/ml(总抗体浓度)，如图4a所示。将40ul的每种活化配体溶液添加到6个孔中，并使其在室温下结合30分钟。然后将微孔板孔用pbs洗涤一次，然后保持在4℃下直至用于刺激t细胞。

为了用微孔板活化t细胞，使用市售的cd8+t细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)从pbmc中富集cd8⁺t细胞。向活化板的每个孔中，涂布在200ul的t细胞培养基(添加有10％人ab血清(corning)、2mmglutamax(thermofisher)、50um2-巯基乙醇(thermofisher)和30ng/mlil-21(r&dsystems)的高级rpmi(thermofisher))中的200,000个富含cd8⁺t细胞的细胞。将细胞在培养箱中培养48小时，然后向每个孔中添加具有150ng/mlil-21的50ult细胞培养基，并继续培养。5天后，从每个孔中除去50ul培养基，并将细胞转移至如上文所述制备的新的活化孔板中。向每个孔中添加具有150ng/mlil-21的50ult细胞培养基，并继续培养。下一天，从每个孔中除去50ul培养基，并向每个孔中添加50ul具有10ng/mlil-7和50iu/mlil-2的t细胞培养基。下一天，再次从每个孔中除去50ul培养基，并向每个孔中添加50ul具有150ng/mlil-21的t细胞培养基。继续培养5天，这时，从每个孔中收集样品以确定每个孔中抗原特异性t细胞的数目，并评估cd28和cd127在抗原特异性t细胞上的表面表达。如图4a、4b和4c所示，可以改变主刺激配体(mhc)与共刺激配体的比率，以提供有效的抗原特异性活化(图4a)、cd127表达(图4b)和cd28表达(图4c)。

实验7。孔内t淋巴细胞的抗原特异性活化，在孔的底部表面上具有呈递抗原的共价功能化的表面。如实验1和2中所述对96孔圆底组织培养物处理过的微孔板(corning)进行功能化，以在每个孔的底部表面上引入呈递叠氮基的共价功能化的表面。通过向孔的底部添加0.05ml的0.5mm硫酸铜、0.1mm抗坏血酸钠和5mm炔烃-peg4-生物素(其对每个孔的整个底部表面进行功能化)，在每个孔的底部中引入呈递生物素的共价功能化的表面。

为了钝化剩余的叠氮化物并将孔的生物素功能化的区域限制在沉积的功能化混合物的最初点样的受限区域，向每个孔中添加0.2ml钝化溶液(pbs中的5mmdbco-peg4-羧酸)。该钝化反应在室温下进行30分钟。除去钝化溶液，并在继续进行之前用0.2mlpbs洗涤孔一次。然后通过向具有呈递生物素的共价功能化的区域的每个孔中添加0.05mlpbs中的0.25mg/ml链霉亲和素，引入呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。在室温下30分钟后，通过抽吸除去链霉亲和素溶液，并用0.2mlpbs淋洗孔两次。

在孔的底部表面上引入呈递抗原的共价功能化的活化区域：向具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的每个孔中添加0.05ml的pbs-bsa中的0.83微克/mlmart1phla(负载有抗原肽的位点特异性生物素化单体mhc分子，其具有c末端bira标签用于位点特异性生物素化，其中mhc分子包括预先加载到mhc中的mart1抗原肽)溶液。30分钟后，通过抽吸除去phla混合物，并向每个孔中添加0.05ml的共刺激功能化混合物。共刺激功能化混合物由2.5微克/ml的生物素化抗cd28和2.5微克/ml的生物素化抗cd2组成。在室温下30分钟后，通过抽吸除去共刺激功能化混合物，并将具有呈递抗原的共价功能化的区域的孔用0.2ml的pbs-bsa淋洗两次。这在每个经处理的孔的底部提供了t细胞活化区域，其中呈递了呈递抗原的配体和共刺激配体(抗cd28、抗cd2)用于t细胞活化。

然后将抗原特异性t细胞在含有具有用于活化的呈递抗原的区域的表面的孔中的扩增与用合成的呈递抗原的珠进行的扩增(如在2018年7月20日提交的pct/us2018/043146中所述地制备，整个公开内容通过引用整体并入本文)进行了比较。根据制造商推荐的程序，使用easysep^tm人cd8+t细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)从外周血单核细胞中分离cd8+t细胞。将富集的cd8+t细胞以le6/ml重新悬浮在具有30纳克/ml的il-21的生长培养基中(r&dsystems)。生长培养基由补充有10％人ab血清(corningcellgro)加上glutamax(thermofisher)和50微摩尔的β-巯基乙醇(thermofisher)的高级rpmi1640培养基(thermofisher)组成。

然后将cd8+t细胞分成两个样品，以在具有呈递抗原的区域的孔中或合成的呈递抗原的珠中刺激。对于珠刺激，将mart1特异性的合成的呈递抗原的珠以1:1的比率添加到细胞中。向标准96孔圆底组织培养微孔板的每个孔中涂布200,000个细胞。对于呈递抗原的共价功能化的区域刺激，向如上文所述制备的微孔板的mart1特异性的呈递抗原的共价功能化的孔的每个孔中涂布200,000个细胞。然后将板在标准的5％co2、37℃培养箱中培养两天。培养两天后，将il-21在生长培养基中稀释至150纳克/ml。将50微升在培养基中稀释的il-21添加到每个孔中，并将板放回到培养箱中进行进一步培养。

在总共培养7天后，用mart1特异性的合成的呈递抗原的活化珠或孔的呈递抗原的共价功能化的区域再次刺激细胞。对于基于珠的再次刺激，从板的每个孔中除去0.05的培养基。在新鲜的生长培养基中将il-21稀释至150ng/ml，并将合成的呈递抗原的活化珠以4e6个珠/ml的最终密度添加到il-21/培养基混合物中。将50微升的这种il-21/珠/培养基混合物添加到每个孔中，导致将另外的2e5个珠添加到每个孔中。

为了在具有含有呈递抗原的共价功能化的区域的表面的孔中再次刺激，从板的每个孔中除去50微升培养基。通过重复移液将孔中的细胞重新悬浮，并将剩余体积转移至新鲜的孔板中，该孔板具有如上文所述制备的其内包括呈递抗原的共价功能化的区域的孔。在新鲜的生长培养基中将il-21稀释至150ng/ml，并将50微升的这种il-21/生长培养基混合物添加至新鲜孔板的每个孔中，该孔板具有含有呈递抗原的共价功能化的区域的表面。

下一天，将两组孔板都从培养箱中移出，并再次从每个孔中移出50微升培养基。将il-2(r&dsystems)稀释到新鲜培养基中至50单位/ml。向该含有il-2的培养基中以12.5ng/ml的终浓度添加il-7(r&dsystems)。将50微升的这种il-2/il-7/培养基混合物添加到每个孔中，并将两组孔板都返回到培养箱中。

下一天，将两组孔板都从培养箱中移出，并再次从每个孔中移出50微升培养基。将il-21稀释到新鲜培养基中至150纳克/ml。将50微升的这种il-21/培养基混合物添加到每个孔中，并将孔返回到培养箱中。

将细胞培养另外5天后，分析细胞的抗原特异性t细胞扩增和记忆前体表面标记物(cd28和cd127)的表达。

结果：如对于基于珠的活化510与呈递抗原的区域活化520相比的fac结果所示，与装载有合成的呈递抗原的珠的孔一样，具有包括呈递抗原的共价功能化的活化区域的表面的孔通常能够扩增mart1特异性t细胞(图5a)。几乎所有包括呈递抗原的共价功能化的区域的孔都产生大量的抗原特异性t细胞，与由合成的呈递抗原的珠提供的细胞产物530相比，对于由呈递抗原的区域产生的细胞540，抗原特异性t细胞的总数要低约两倍(图5b)。然而，当检查记忆前体表型标记物cd28和cd127的表达时，观察到与对于通过使用合成的呈递抗原的珠产生的抗原特异性t细胞所看到的表达水平(分别为图5c的550(cd28表达)和图5d的570(cd127表达))相比，这些标记物在使用具有呈递抗原的活化区域的孔所产生的抗原特异性t细胞上的表达降低(分别为图5c的560(cd28表达)和图5d的580(cd127的表达))。这表明，尽管具有呈递抗原的活化区域的孔可以支持抗原特异性t细胞的扩增，但与使用合成的呈递抗原的珠扩增的细胞相比，细胞的分化程度更高。这些结果进一步表明，限制具有合成的呈递抗原的活化区域的孔中的刺激面积对于某些细胞活化(例如抗原特异性t细胞刺激)可能是有利的。

实验8。共价功能化的区域大小控制。为了制备具有带有淋巴细胞活化区域(在这种情况下，是用于活化t细胞抗原的呈递抗原的共价功能化的区域，特别是标准组织培养微孔板底面上的不同区域)的孔的孔板，可以如实验1和实验2所述首先用7-叠氮基庚基三甲基硅烷对标准96孔圆底组织培养微孔板(corning)进行功能化。然后在水中制备由0.5mm硫酸铜、0.1mm抗坏血酸钠和5mm炔烃-peg4-生物素组成的微孔板功能化混合物。使用自动液体处理机器人(opentrons)，将0.25、0.5、1、2、4和8微升的功能化混合物滴输送到经涂覆的微孔板的孔的中心。将微孔板在室温下保持45分钟，以使炔烃生物素与微孔板反应。为了钝化剩余的叠氮化物并将孔的生物素功能化的区域限制为沉积的功能化混合物的最初点样的受限区域，向每个孔中添加0.2ml钝化溶液(pbs中的5mmdbco-peg4-羧酸)。该钝化反应在室温下进行30分钟。除去钝化溶液，并在继续进行之前将孔用0.2mlpbs洗涤一次。

为了测量在孔底部形成的呈递生物素的共价功能化的区域的每个区域，然后将这些孔用0.05mlpbs中的0.01mg/ml与alexafluor488轭合的链霉亲和素(thermofisher目录号s11223)在室温下染色30分钟。洗去链霉亲和素染色溶液，并用已用校准玻片校准的倒置荧光显微镜(evos，thermofisher)对斑点成像。然后，通过在imagej中沿着多个方向跨贴片图像创建线并计算长度的平均值，来测量所得圆形斑点的面积。然后，使用将圆的半径与其面积相关联的公式来计算斑点的面积。

结果。增加功能化混合物的体积导致所得到的功能化的区域的尺寸普遍增加(图6a)。为了量化功能化液滴体积与功能化的面积之间的关系，测量了0.25、0.5、1或2微升液滴的荧光斑点面积。然后计算斑点面积与液滴体积的线性拟合(图6b)。然后使用该拟合来估计使用4微升和8微升液滴制备的功能化的区域的面积。在以下实验中使用每个共价功能化的区域的这些直接测量的面积和间接测量的面积。

实验9。制备链霉亲和素功能化的孔板，该孔板具有用于活化的受限区域，该区域被限制在孔的底部表面的中心区域。如上文在实验1和2中所述，首先通过cvd用7-叠氮基庚基三甲基硅烷涂覆标准的96孔圆底组织培养微孔板(corning)。然后在水中制备由0.5mm硫酸铜、0.1mm抗坏血酸钠和5mm炔烃-peg4-生物素(clickchemistrytools，目录号tat105-100)组成的微孔板功能化混合物。使用自动液体处理机器人(opentrons)，将1.00微升的微孔板功能化混合物液滴输送到经涂覆的微孔板的孔的中心。基于实验8、图6b的结果，这在每个孔的底部导致大约2mm直径的斑点。将微孔板在室温下保持45分钟，以使炔烃-peg4-生物素试剂的炔烃官能团与微孔板反应。为了钝化剩余的叠氮化物并将孔的生物素功能化的区域限制在初始约2mm直径的斑点，向每个孔添加0.2ml钝化溶液(pbs中的5mmdbco-peg4-羧酸(sigmaaldrich，目录号759902-5mg))。该钝化反应在室温下进行30分钟。除去钝化溶液，并在继续进行之前将孔用0.2mlpbs洗涤两次。

为了制备用于结合生物素缀合的肽-hla(phla，主刺激)和共刺激抗体的孔，向每个孔中添加0.05ml的0.25mg/ml链霉亲和素，并在室温下孵育30分钟。通过用0.2mlpbs洗涤每个孔两次来除去过量的链霉亲和素。

实验10。具有t细胞活化物质的区域限制性呈递链霉亲和素的孔板的功能化。为了将phla(抗原肽负载的位点特异性生物素化单体mhc分子，其具有用于位点特异性生物素化的c端bira标签，具有预加载到mhc中的mart1抗原肽)加载到每个孔中的呈递链霉亲和素的功能化的斑点上，向每个链霉亲和素功能化的孔中添加0.05ml的生物素化的phla在含0.1％bsa的pbs中的0.83微克/ml溶液。在室温下30分钟后，除去phla溶液，并向每个孔中添加生物素化的抗cd28抗体(biolegend，目录号302904，2.5微克/ml)和生物素化的抗cd2抗体(biolegend，目录号23002040，2.5微克/ml)在含0.1％bsa的pbs中的5微克/ml(总抗体)溶液。30分钟后，通过将每个孔用0.2mlpbs-bsa洗涤两次来除去功能化试剂。每个经处理的孔均包括呈递抗原的共价功能化的活化区域，该区域限于最初点样的区域。在刺激t细胞的同一天制备功能化的微孔板，并经其在4℃下保存直至用细胞涂布。

实验11。具有受限的活化区域的功能化的孔板的孔中的t细胞抗原特异性刺激和扩增与在标准孔板内在合成的呈递抗原的活化珠的存在下的刺激和扩增的比较。根据制造商推荐的程序，使用easysep^tm人cd8+t细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)从外周血单核细胞中分离cd8+t细胞。将富集的cd8+t细胞以1e6/ml重新悬浮在具有30纳克/ml的il-21的生长培养基中(r&dsystems)。生长培养基由补充有10％的人ab血清(comingcellgro)加上glutamax(thermofisher)和50微摩尔的β-巯基乙醇(thermofisher)的高级rpmi1640培养基(thermolisher)组成。

然后将cd8+t细胞分成两个样品，用标准孔板内的呈递抗原的活化珠或在实验10的区域限制性的呈递抗原的活化孔板内进行刺激。对于呈递抗原的活化珠刺激，将呈递mart1-抗原的活化珠(如在2018年7月20日提交的pct/us2018/043146中所述制备，其整个公开内容通过引用整体并入本文)以1:1的比率添加到细胞中。向标准96孔圆底组织培养微孔板的每一个中涂布200,000个细胞。对于区域限制性的呈递抗原的活化孔板刺激，在如实验10中所述制备的区域限制性呈递抗原的活化孔板的每个孔中涂布200,000个细胞。然后将板在标准的5％co2，37℃培养箱中孵育两天。培养两天后，将il-21在生长培养基中稀释至150纳克/ml。将五十微升在培养基中稀释的il-21添加到每个孔中，并将板返回到培养箱中继续进行培养。

总共培养7天后，重新刺激细胞。对于呈递抗原的活化珠再刺激，从板的每个孔中除去50微升培养基。将il-21在新鲜培养基中稀释至150ng/ml，并且将呈递抗原的活化珠以4e6个珠/ml的最终密度添加到il-21/培养基混合物中。将50微升的该il-21/珠/培养基混合物添加到每个孔中，导致将另外的2e5个呈递抗原的活化珠添加到每个孔中。

对于区域限制性的呈递抗原的活化孔板再刺激，从板的每个孔中除去50微升培养基。通过重复移液将孔中的细胞重新悬浮，并将剩余体积(每个孔～0.2ml)转移至如实验9所述制备的新制备的区域限制性的呈递抗原的活化孔板。将il-21在新鲜的生长培养基中稀释至150ng/ml，并将50微升的该il-21/生长培养基混合物添加到新制备的区域限制性的呈递抗原的活化孔板的每个孔中。

下一天，将板从培养箱中移出，并再次从每个孔中移除50微升培养基。将il-2(r&dsystems)稀释到新鲜培养基中至50单位/ml。向含有il-2的该培养基中，以12.5ng/ml的最终浓度添加il-7(r&dsystems)。将50微升的该il-2/il-7/培养基混合物添加至两组孔板的每个孔中，并将孔板返回到培养箱中。

下一天，将板从培养箱中移出，并再次从每个孔中移除50微升培养基。将il-21稀释到新鲜培养基中至150纳克/ml。将50微升的该il-21/培养基混合物添加至两个孔板的每个孔中，并将孔板返回到培养箱中。

将细胞再培养5天后，分析了来自每组区域限制性的呈递抗原的活化孔板和呈递抗原的活化珠孔板的细胞的抗原特异性t细胞扩增和记忆前体表面标记物(cd28和cd127)的表达。

表征。在两轮刺激之后，从呈递抗原的活化珠和区域限制性的呈递抗原的活化孔板的每个孔中收集50微升样品。将细胞用洗涤缓冲液(pbs+2％胎牛血清+5mmedta)洗涤一次。然后将细胞用抗cd4的抗体(brilliantviolet^tm510，biolegend目录号300545)、抗cd8的抗体(percp-cy5.5,biolegend目录号344709)、抗cd28的抗体(fitc，bioleend目录号302906)、抗cd45ro的抗体(apc，biolegend目录号304210)、抗cd127的抗体(bv420，biolegend目录号351309)的混合物以及标记抗原特异性t细胞的四聚体试剂(pmhctetramer，pe)染色。将细胞在室温下于黑暗中染色30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤一次。将细胞重新悬浮于0.15ml洗涤缓冲液中，其中每孔含0.01ml的countbright^tm珠(thermofisher目录号c36950)。然后在具有高通量样品(bdbiosciences)的facscelesta流式细胞仪(bectondickinsonandco.)上分析细胞群。根据制造商推荐的方案，从样品中收集的细胞和countbright珠的数目计算样品中的总细胞计数。在flowjo(flowjo)中分析流式细胞仪样品，以确定抗原特异性t细胞频率和记忆前体标记物(cd27、cd28、cd62l和cd127)的表达。

在flowjo(flowjo)流式细胞仪分析软件程序中分析流式细胞仪样品的抗原特异性t细胞频率。该分析表明，区域限制性的呈递抗原的活化孔板始终产生大量的抗原特异性t细胞(图6b)。流式细胞术分析表明，相对于使用呈递抗原的活化珠的活化，区域限制性的呈递抗原的活化孔板产生相等数目的抗原特异性t细胞(图7a)。图7c显示了在区域限制性的活化孔中每孔产生的抗原阳性t细胞的数目与使用呈递抗原的活化珠每孔产生的抗原阳性t细胞的数目比较的图形。此外，当分析抗原特异性t细胞的cd127的表达和cd28的高水平时，我们观察到区域限制性的呈递抗原的活化孔板产生相等或更高比率的表达记忆前体t细胞的这些标记物的抗原特异性t细胞(图7d)。因此，在区域限制性的呈递抗原的活化孔板中的刺激是高产的，并且产生具有良好的中央记忆表型(例如，指示记忆前体t细胞)的活化的t细胞，并且等同于使用合成的呈递抗原的活化珠的活化。

实验12。呈递抗原的功能化的区域与细胞产率和表型的比较。产生了孔板，该孔板具有含有用于t细胞活化的呈递抗原的共价功能化的区域的孔，其面积为约1mm²至约23mm²。如图8a所示，产生了六个不同大小的区域：1mm²；1.7mm²；3.3mm²；5.5mm²；11.5mm²；and23mm²(图8a的每个图形上方的标签标识区域的大小)。共价功能化的区域的大小是通过以与实验8中所述方法类似的方式，将不同体积的0.5mm硫酸铜、0.1mm抗坏血酸钠和5mm炔烃-peg4-生物素沉积到如实验1和2中制备的具有呈递叠氮基的共价功能化的表面的圆底96孔微孔板的孔中来控制的。如上文所述(实验8和9)将剩余的叠氮基部分钝化后，如上文实验8和9所述，将链霉亲和素与呈递生物素的共价功能化的区域结合。主活化分子phla(抗原肽负载的位点特异性生物素化单体mhc分子，具有用于位点特异性生物素化的c端bira标签，具有预先加载到mhc中的mart1抗原肽)和共活化分子(共刺激抗体，生物素化的抗cd28和生物素化的抗-cd2)与每个孔的底面上的所得呈递链霉亲和素的共价功能化的区域结合，以在每个孔的底面上产生呈递抗原的共价功能化的区域，如实验10中所述。

具有不同大小的呈递抗原的共价功能化的活化区域的孔内的t细胞活化和扩增。如上文实验11中所述地活化并扩增抗原特异性t细胞。当在第二轮刺激中需要孔板表面的第二个新的呈递抗原的共价功能化的区域时，将相同大小的活化区域与孔板的每个孔相匹配。在两轮刺激均完成后，从每个孔中收集0.05ml细胞样品，并测定抗原特异性t细胞的频率以及cd28和cd127在抗原特异性t细胞中的表达。

结果。如图8a-8d所示，对于面积为大约或刚好超过1mm²的孔的呈递抗原的活化区域，观察到刺激和扩增。然而，随着呈递抗原的区域的面积从约1mm²(1.29％的细胞产物是抗原特异性的)增加到23mm²(34.8％的细胞产物是抗原特异性的和cd8高)，抗原特异性t细胞的产率总体上增加。注意，流式细胞仪门限(gatecutoff)以下的群体是抗原特异性的，但相对于所选的门阈值具有下调的cd8，所产生的抗原特异性t细胞的数目相对于活化区域(呈递抗原的区域)总体上呈线性关系，如图8b所示。与呈递抗原的区域的面积无关，cd28在抗原特异性t细胞中的表达始终很高(图8c)。然而，随着呈递抗原的区域的面积增加，抗原特异性t细胞对cd127的表达增加，表明具有较大面积的呈递抗原的区域至少在一定程度上更好地支持cd127+t细胞的扩增(图8d)。在图8d中，当呈递抗原的活化区域的面积超过约25mm²至约30mm²时，抗原特异性t细胞对cd127的表达的增加趋于平稳。这表明，面积为约1mm²至约50mm²或约3mm²至约30mm²的呈递抗原的共价功能化的区域提供了抗原特异性t细胞的优化的扩增，保留了记忆前体标记物cd127的高水平表达。该结果与如实验7中所述和图5a-5d所示的在不限制呈递抗原的活化/刺激的面积的情况下产生的t细胞的表型形成鲜明对比。因此，就产生保持cd127高表达水平的t细胞而言，面积小于100mm²，小于75mm²或小于50mm²的呈递抗原的活化区与可能是有利的。

当一个特征或元件在本文中被称为在另一特征或元件“上”时，它可以直接在另一特征或元件上，或者也可以存在中间的特征和/或元件。相反，当一个特征或元件被称为“直接在”另一个特征或元件“上”时，则不存在中间的特征或元件。还应当理解，当一个特征或元件被称为与另一特征或元件“连接”、“附接”或“偶联”时，其可以直接与另一特征或元件连接、附接或偶联或者可能存在中间的特征或元件。相反，当一个特征或元件被称为与另一特征或元件“直接连接”、“直接附接”或“直接偶联”时，则不存在中间特征或元件。尽管与一个实施方案相关地描述或显示，但是如此描述或显示的特征和元件可以应用于其他实施方案。本领域的技术人员还将理解，提及与另一特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与相邻的特征重叠或位于其下的部分。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明。例如，如本文所使用的，单数形式“一”和“该”意图还包括复数形式，除非上下文另外明确指出。将进一步理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”时，其指明了所述的特征、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其他特征、步骤、操作、元件、组件和/或其组的存在或添加。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合，并且可以缩写为“/”。

为了便于描述，本文中可以使用空间相对术语，例如“以下”、“低于”、“下方”、“以上”、“上方”等，以描述附图中示出的一个元件或特征与另一个元件或特征的关系。将理解的是，除了图中所描绘的取向之外，空间相对术语还意图涵盖装置在使用或操作中的不同取向。例如，如果附图中的装置被反转，则被描述为在其他元件或特征“下方”或“以下”的元件将被定向为在其他元件或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以包括上方和下方的定向。装置可以以其他方式定向(旋转90度或其他方向)，并据此解释本文中使用的空间相对描述语。类似地，除非另外具体指出，否则术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等在本文中仅用于解释的目的。

尽管本文中可以使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/元件(包括步骤)，但是除非上下文另外指出，否则这些特征/元件不应受这些术语的限制。这些术语可以用于区分一个特征/元件与另一个特征/元件。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下面讨论的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，并且类似地，下面讨论的第二特征/元件可以被称为第一特征/元件。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises和comprising)”的变体是指可以在方法和制品中共同使用各种组件(例如，包括装置和方法的组合物和设备)。例如，术语“包含”将被理解为暗示包括任何所述的元件或步骤，但是不排除任何其他元件或步骤。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，包括在实施例中所使用的，并且除非另有明确说明，否则所有数字可以被读作好像由词语“约”或“大约”开头，即使该术语没有明确地出现。当描述幅度和/或位置时，可以使用短语“约”或“大约”来指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值的值可以是所述值(或值的范围)的+/-0.1％，所述值(或值的范围)的+/-1％，所述值(或值的范围)的+/-2％，所述值(或值的范围)的+/-5％，所述值(或值的范围)的+/-10％等。本文叙述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。

尽管上面描述了各种说明性实施方案，但是在不脱离如权利要求所描述的本发明的范围的情况下，可以对各种实施方案进行多种改变中的任何一种。例如，在替代实施方案中，可以经常改变执行所描述的各种方法步骤的顺序，而在其他替代实施方案中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。在一些实施方案中可以包括各种装置和系统实施方案的可选特征，而在其他实施方案中可以不包括。因此，前面的描述主要是为了示例性目的而提供的，并且不应解释为限制本发明的范围，因为本发明的范围在权利要求中阐明。

本文所包括的实例和说明以说明而非限制的方式示出了可以实践本主题的特定实施方案。如所提及的，可以利用并从中得出其他实施方案，从而可以在不脱离本公开的范围的情况下进行结构和逻辑上的替换和改变。本发明主题的这些实施方案在本文中可以仅出于方便目的而单独地或共同地用术语“发明”来指代，并且如果事实上公开了不止一个的发明或发明构思，则无意将本申请的范围主动地限制于任何单个发明或发明构思。因此，尽管本文已经说明和描述了特定的实施方案，但是被计算为实现相同目的的任何布置都可以代替所示的特定实施方案。本公开意图覆盖各种实施方案的任何和所有改编或变型。通过阅读以上描述，以上实施方案的组合以及本文中未具体描述的其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。

本公开的一些实施方案的列举。

1.一种包括具有第一区域的表面的孔板，该第一区域是呈递反应性部分的共价功能化的区域或呈递活化部分的共价功能化的区域，其中所述反应性部分是叠氮基部分、生物素部分或链霉亲和素部分，且所述活化部分是淋巴细胞活化部分。

2.实施方案1的孔板，其中第一区域的面积为至少0.5mm²。在某些具体实施方案中，第一区域的面积为至少0.6mm²，至少0.7mm²，至少0.8mm²，至少0.9mm²，至少1.0mm²，至少1.1mm²，至少1.2mm²，至少1.3mm²，至少1.4mm²，至少1.5mm²，至少1.6mm²，至少1.7mm²，至少1.8mm²，至少1.9mm²，至少2.0mm²，至少2.5mm²，至少3.0mm²，至少3.5mm²，至少4.0mm²，至少4.5mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，或由上述端点中的两个所形成的任何范围。在其他具体实施方案中，第一区域的面积为约0.5mm²至约50mm²，约1.0mm²至约40mm²，约2mm²至约35mm²，约3mm²至约30mm²，或者约4mm²至约25mm²。

3.实施方案1或2的孔板，其中第一区域的尺寸为约0.5至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

4.实施方案1至3中任一项的孔板，其中第一区域是基本上圆形的并且具有约0.5mm至4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

5.实施方案1至4中任一项的孔板，其中孔板的表面还包括第二区域，所述第二区域是包括表面封闭配体的共价修饰的区域，并且任选地，其中第二区域围绕第一区域。

6.实施方案1至5中任一项的孔板，其中孔板的表面包括玻璃或聚苯乙烯。

7.实施方案1至5中任一项的孔板，其中孔板的表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

8.实施方案1至7中任一项的孔板，其中第一区域离子具有的各反应性部分或活化部分的密度为至少50/um²。

9.实施方案1至8中任一项的孔板，其中所述第一区域包括经由连接基共价连接至表面的各反应性部分或活化部分，所述连接基具有5至约20个主链原子，约10至约40个主链原子或约15至约50个主链原子，所述主链原子选自碳、硅、氮和氧。或者，反应性部分或活化部分可以通过一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长的连接基，或其间的任意键长数目共价连接至表面。

10.实施方案1至9中任一项的孔板，其中所述反应性部分是链霉亲和素，并且所述链霉亲和素官能团共价附接至孔板的表面的第一区域。

11.实施方案1至9中任一项的孔板，其中所述反应性部分是链霉亲和素，并且所述链霉亲和素官能团非共价附接至自身共价附接至孔板的表面的第一区域的生物素部分。

12.实施方案1至11中任一项的孔板，其中所述第一区域是包括多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体的呈递活化部分的共价功能化的区域。

13.实施方案12的孔板，其中在表面的第一区域上的主活化分子配体与共活化分子配体的比率为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1，或约1:2至约1:1。

14.实施方案12或13的孔板，其中多个特异性结合的主活化分子配体中的每个配体包括被配置为与t细胞的t细胞受体(tcr)结合的主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)。

15.实施方案14的孔板，其中所述mhc分子包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。

16.实施方案14或15的孔板，其中多个特异性结合的主活化分子配体中的每个配体包括还包括抗原肽的mhc分子。

17.实施方案16的孔板，其中所述抗原肽是肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。

18.实施方案17的孔板，其中所述抗原肽是肿瘤相关的抗原，并且任选地，其中所述肿瘤相关的抗原是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

19.实施方案14至18中任一项的孔板，其中所述mhc分子经由c末端链接连接至所述呈递活化部分的共价功能化的区域。

20.实施方案12至19中任一项的孔板，其中多个特异性结合的共活化分子配体中的每个配体包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。

21.实施方案20的孔板，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约100:1至约1:100。

22.实施方案20或21的孔板，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或1:90至1:100，其中上述每个值均用“约”修饰。

23.实施方案20至22中任一项的孔板，其中多个特异性结合的共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20或约3:1至约1:3。

24.实施方案20至23中任一项的孔板，其中所述tcr共活化分子包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段，并且任选地，其中所述cd28结合蛋白或其片段还包括位点特异性c末端生物素部分。

25.实施方案20至24中任一项的孔板，其中所述tcr共活化分子包括cd80分子或其片段，其中所述片段保留与cd28的结合活性。

26.实施方案20至25中任一项的孔板，其中所述tcr共活化分子包括抗cd28抗体或其片段，其中所述片段保留与cd28的结合活性。

27.实施方案20至26中任一项的孔板，其中所述辅助tcr活化分子包括cd2结合蛋白或其保留与cd2的结合活性的片段，并且任选地，其中cd2结合蛋白或其片段还包括位点特异性c末端生物素部分。

28.实施方案20至27中任一项的孔板，其中所述辅助tcr活化分子包括cd58分子或其片段，其中所述片段保留与cd2的结合活性。

29.实施方案20至28中任一项的孔板，其中所述辅助tcr活化分子包括抗cd2抗体或其片段，其中所述片段保留与cd2的结合活性。

30.实施方案12至29中任一项的孔板，其中所述多个特异性结合的主活化分子配体和所述多个特异性结合的共活化分子配体与所述孔板的呈递链霉亲和素的第一区域的链霉亲和素官能团特异性结合。

31.实施方案12至30中任一项的孔板，其中所述多个特异性结合的主活化分子配体在所述第一区域中的密度为至少约1×10²个分子/平方微米，并且任选地，在第一区域中的密度为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

32.实施方案12至31中任一项的孔板，其中所述多个特异性结合的共活化分子配体在所述第一区域中的密度为至少1×10²个分子/平方微米或者约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

33.一种孔板，其中孔板的一个或多个孔中的每一个包括实施方案1至32中任一项的孔板的表面及其第一区域(即，该表面可以是单个孔的内表面，并且孔板可以具有一个或多个这样的表面)。

34.实施方案33的孔板，其中一个或多个孔中的每一个的第一区域位于相应孔的底部表面上。

35.实施方案32的孔板，其中每个第一区域的面积为相应孔的底部表面的面积的小于约50％，小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。

36.实施方案5至35中任一项的孔板，其中每个表面封闭配体包括亲水性的或带负电荷的部分。

37.实施方案36的孔板，其中所述表面封闭配体包括聚乙二醇(peg)部分。

38.一种活化t淋巴细胞(t细胞)的方法，其包括使多个t细胞与孔板表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域包括：多个主活化分子配体，每个主活化分子配体包括主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体(tcr)结合，其中多个主活化分子配体中的每一个与表面连接；和多个共活化分子配体，每个共活化分子配体包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子，其中每个共活化分子配体与所述表面连接；以及培养与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的多个t细胞，从而将多个t细胞的至少一部分转化为活化的t细胞。

39.实施方案38的方法，其中t细胞包括cd8+t细胞。

40.实施方案38或39的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域是实施方案12至33中任一项的孔板的表面的第一区域。

41.实施方案38至40中任一项的方法，其中多个共活化分子配体包括tcr共活化分子和辅助tcr活化分子。

42.实施方案38至41中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约100:1至约1:100。

43.实施方案38至42中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或1:90至1:100，其中上述每个值均用“约”修饰。

44.实施方案38至43中任一项的方法，其中所述多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20或者约3:1至约1:3。

45.实施方案38至44中任一项的方法，其中多个mhc分子中的每个分子包括i类mhc蛋白质序列、β巨球蛋白蛋白质序列和抗原肽。

46.实施方案45的方法，其中所述mhc分子的蛋白质序列经由所述蛋白质序列的c末端连接与所述表面的呈递抗原的共价功能化的区域连接。

47.实施方案38至46中任一项的方法，其中所述mhc分子包括生物素部分，并经由与链霉亲和素的非共价相互作用而附接至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。

48.实施方案47的方法，其中链霉亲和素自身共价键合至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。

49.实施方案48的方法，其中链霉亲和素通过一系列约5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长，或其间的任意数目的键长键合到表面。

50.实施方案47的方法，其中链霉亲和素与表面的呈递抗原的共价功能化的区域非共价缔合。

51.实施方案47或50的方法，其中链霉亲和素与生物素部分非共价缔合，并且生物素部分共价键合至表面的呈递抗原的共价功能化的区域。

52.实施方案51的方法，其中生物素通过连接基通过一系列约5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长，或其间的任意键长数目与表面连接。

53.实施方案39至52中任一项的方法，其中所述抗原肽是肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。

54.实施方案53的方法，其中所述抗原肽是肿瘤相关的抗原，并且任选地，其中所述肿瘤相关的抗原是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

55.实施方案38至54中任一项的方法，其中多个共活化分子配体的每一个与表面的呈递抗原的共价功能化的区域连接。

56.实施方案38至55中任一项的方法，其中t细胞受体(tcr)共活化分子包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。

57.实施方案56的方法，其中所述cd28结合蛋白或其片段还包括位点特异性的c末端生物素部分。

58.实施方案38至57中任一项的方法，其中t细胞受体(tcr)共活化分子包括cd80分子或其片段，其中该片段保留与cd28的结合活性。

59.实施方案38至58中任一项的方法，其中t细胞受体(tcr)共活化分子包括抗cd28抗体或其片段，其中所述片段保留与cd28的结合活性。

60.实施方案38至59中任一项的方法，其中辅助tcr活化分子包括cd2结合蛋白或其保留与cd2的结合能力的片段。

61.实施方案60的方法，其中cd2结合蛋白或其片段还包括位点特异性c末端生物素部分。

62.实施方案38至61中任一项的方法，其中辅助tcr活化分子包括cd58分子或其片段，其中所述片段保留与cd2的结合活性。

63.实施方案38至62中任一项的方法，其中辅助tcr活化分子包括抗cd2抗体或其片段，其中所述片段保留与cd2的结合活性。

64.实施方案38至63中任一项的方法，其中所述多个特异性结合的主活化分子配体在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的密度为至少约1×10²个分子/平方微米，或者任选地，在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的密度为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

65.实施方案38至64中任一项的方法，其中所述多个特异性结合的共活化分子配体在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的密度为至少1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米，或者任选地，在表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的密度为约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

66.实施方案38至65中任一项的方法，其中表面的呈递抗原的共价功能化的区域中的主活化分子配体与共活化分子配体的比率为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1，或任选地，约1:2至约1:1。

67.实施方案38至66中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约3:1至约1:3。

68.实施方案38至67中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约2:1至约1:2。

69.实施方案38至68中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约1:1。

70.实施方案39至69中任一项的方法，其还包括使多个t细胞与多个刺激粘附的分子配体接触，并且任选地，其中多个刺激粘附的分子配体包括icam分子。

71.实施方案70的方法，其中多个刺激粘附的分子配体共价附接于孔板表面的呈递抗原的共价功能化的区域之外的区域。

72.实施方案38至71中任一项的方法，其还包括使多个t细胞与多个生长刺激性分子配体接触。

73.实施方案72的方法，其中每个生长刺激性分子配体包括生长因子受体配体。

74.实施方案73的方法，其中生长因子受体配体包括il-21或其片段。

75.实施方案72至74中任一项的方法，其中在至少一天的第一培养期之后进行与多个生长刺激性分子配体的接触。

76.实施方案38至75中任一项的方法，其中与呈递抗原的合成表面接触培养进行约4天至约7天的时间。

77.实施方案38到76中任一项的方法，其还包括：完成与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的第一活化期；以及，与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触地培养多个活化的t细胞持续第二培养期，从而提供扩增的多个活化的t细胞。

78.实施方案77的方法，其还包括在第二培养期期间添加第二多个生长刺激性分子配体。

79.实施方案77或78的方法，其中在第二培养期的剩余时间内，添加多个il-2分子和多个il-7分子以与活化的t细胞接触。

80.实施方案76至79中任一项的方法，其中在与所述表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触培养进行约4天至约7天的时间。

81.实施方案77至80中任一项的方法，其还包括：完成与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触的第二活化期；以及，与表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触培养扩增的多个活化的t细胞持续第三培养期，从而提供多个高度活化的t细胞。

82.实施方案81的方法，其还包括在第三培养期期间添加第三多个生长刺激性分子配体。

83.实施方案81或82的方法，其中在第三培养期的剩余时间内，添加多个il-2分子和多个il-7分子以与活化的t细胞接触。

84.实施方案81至83中任一项的方法，其中与所述表面的呈递抗原的共价功能化的区域接触培养进行约四天至约七天的第三期间。

85.实施方案38至84中任一项的方法，其中活化的t细胞是cd45ro+。

86.实施方案38至85中任一项的方法，其中活化的t细胞是cd28阳性的。

87.实施方案38至86中任一项的方法，其中呈递抗原的功能化的区域的面积为孔板的孔的底部表面的面积的小于约50％，小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，或小于2％。

88.一种活化淋巴细胞的方法，其包括使多个淋巴细胞与孔板表面的呈递活化部分的共价功能化的区域接触，其中所述呈递活化部分的共价功能化的区域包括与表面连接的多个主活化分子配体；和与表面连接的多个共活化分子配体；以及培养多个淋巴细胞，从而将多个淋巴细胞的至少一部分转化为活化的淋巴细胞。

89.实施方案88的方法，其中淋巴细胞包括b细胞、t细胞或nk细胞。

90.实施方案88或89的方法，其中所述呈递活化部分的共价功能化的区域是根据实施方案1至13中任一项的孔板的表面的第一区域。

91.实施方案88至90中任一项的方法，其中主活化分子配体包括cd3结合分子或mhc分子(例如i类mhc或ii类mhc)。

92.实施方案91的方法，其中多个mhc分子中的每一个包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。

93.实施方案91或92的方法，其中mhc分子还包括抗原肽。

94.实施方案93的方法，其中cd3结合蛋白是抗体或其保留结合亲和力的片段。

95.实施方案88至94中任一项的方法，其中多个共活化分子配体包括tcr共活化分子和辅助tcr活化分子。

96.实施方案88至95中任一项的方法，其中多个共活化分子配体包括cd2结合分子和/或cd28结合分子。

97.实施方案95或96的方法，其中存在多于一种类型的共活化分子配体，不同的共活化分子配体的比率为约20:1至约1:20或者约3:1至约1:3。

98.实施方案88至97中任一项的方法，其中所述多个特异性结合的主活化分子配体在表面的呈递活化部分的共价功能化的区域中的密度为至少约1×10²个分子/平方微米，或者约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

99.实施方案88至98中任一项的方法，其中所述多个特异性结合的共活化分子配体在表面的呈递活化部分的共价功能化的区域中的密度为至少1×10²个分子/平方微米，或者约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米，或者约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

100.实施方案88至99中任一项的方法，其中在呈递活化部分的共价功能化的区域中，主活化分子配体与共活化分子配体的比率为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1，或者约1:2至约1:1。

101.实施方案88至100中任一项的方法，其还包括使所述多个淋巴细胞与多个生长刺激性分子配体接触。

102.实施方案1012的方法，其中每个生长刺激性分子配体包括生长因子受体配体。

103.实施方案102的方法，其中生长因子受体配体包括il-21或其片段。

104.实施方案101至103中任一项的方法，其中在至少一天的第一培养期之后进行与多个生长刺激性分子配体的接触。

105.实施方案88至104中任一项的方法，其中与呈递活化部分的共价功能化的区域接触的培养进行约4天至约7天的时间。

106.实施方案89至107中任一项的方法，其中呈递活化部分的功能化的区域的面积为孔板的孔的底部表面的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。

107.一种用于制备孔板的试剂盒，所述孔板包括具有呈递活化部分的共价功能化的区域的表面，该试剂盒包括孔板，所述孔板包括具有呈递反应性部分的共价功能化的区域的表面，其中所述反应性部分为叠氮基部分、生物素部分或链霉亲和素部分；和活化剂；以及任选地，表面功能化试剂。

108.实施方案107的试剂盒，其中该试剂盒包括表面功能化试剂，并且其中所述表面功能化试剂是被配置为与所述反应性部分反应的含生物素的试剂或含链霉亲和素的试剂。

109.实施方案108的试剂盒，其中所述试剂盒还包括含生物素的试剂和含链霉亲和素的试剂这两者。

110.实施方案107至109中任一项的试剂盒，其中包括具有呈递反应性部分的共价功能化的区域的表面的孔板是实施方案1至11中任一项的孔板、实施方案31至33中任一项的孔板或者实施方案33至37中任一项的具有呈递反应性部分的共价功能化的区域的孔板。

111.实施方案107至110中任一项的试剂盒，其中所述活化试剂包括主活化试剂，所述主活化试剂包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，并被配置为与链霉亲和素或多个cd3结合分子的结合位点结合。

112.实施方案107至111中任一项的试剂盒，其还包括包含多个共活化分子的共活化试剂，每个共活化分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，并且其中每个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。

113.实施方案112的试剂盒，其中多个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子和辅助tcr活化分子。

114.实施方案107至113中任一项的试剂盒，其还包括包含多个共活化分子的共活化试剂，每个共活化分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，并且其中每个共活化分子包括cd2结合分子或cd28结合分子。

115.实施方案107至114中任一项的试剂盒，其还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。

116.实施方案115的试剂盒，其中生长因子受体配体包括il-21或其片段。

117.实施方案115或116的试剂盒，其还包括第二生长刺激性分子，其包括il-7或il-2。

118.一种孔板，其包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面。

119.实施方案118的孔板，其中所述孔板的一个或多个孔中的每一个包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面(即内表面)。

120.实施方案119的孔板，其中一个或多个孔中的每一个的呈递叠氮基的共价功能化的区域位于相应孔的底部表面上。

121.实施方案118至120中任一项的孔板，其中所述孔板的表面或者所述孔板的一个或多个孔的表面包括玻璃或聚苯乙烯。

122.实施方案118至121中任一项的孔板，其中所述孔板或者一个或多个孔的表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

123.实施方案118至122中任一项的孔板，其中呈递叠氮基的共价功能化的区域的面积为至少0.5mm²。在某些特定的实施方案中，呈递叠氮基的共价功能化的区域的面积为至少1.0mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，至少50mm²，至少75mm²，至少100mm²，至少150mm²，至少200mm²，至少250mm²，至少300mm²，至少400mm²，至少500mm²，至少600mm²，至少700mm²，至少800mm²，至少900mm²，至少1,000mm²，至少2,000mm²，至少3,000mm²，至少4,000mm²，至少5,000mm²，至少6,000mm²，至少7,000mm²，至少8,000mm²，至少9,000mm²，至少10,000mm²，至少20,000mm²，至少30,000mm²，至少40,000mm²，至少50,000mm²，至少60,000mm²，至少70,000mm²，至少80,000mm²，至少90,000mm²，至少100,000mm²，或更大(例如，孔板的孔或者两个或多个孔中的每一个的基本上全部内表面)。

124.实施方案118至123中任一项的孔板，其中呈递叠氮基的共价功能化的区域具有至少50/um²的叠氮基密度。

125.实施方案118至124中任一项的孔板，其中呈递叠氮基的共价功能化的区域包括经由具有五个或更多个选自碳、硅、氮和氧的主链原子的连接基共价连接至表面的叠氮基官能团。在特定实施方案中，连接基可以具有5至约20个主链原子，或约10至约40个主链原子，或者一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长，或其间任意数目的键长。

126.一种孔板，其包括包含呈递生物素的共价功能化的区域的表面。在某些实施方案中，表面包括多个呈递生物素的共价功能化的区域。

127.实施方案126的孔板，其中所述孔板的一个或多个孔中的每一个包括具有一个(或多个)呈递生物素的共价功能化的区域的表面(即，内表面)。

128.实施方案127的孔板，其中一个或多个孔中的每一个的呈递生物素的共价功能化的区域位于相应孔的底部表面上。

129.实施方案126至128中任一项的孔板，其中所述孔板的表面或者一个或多个孔的表面包括玻璃或聚苯乙烯。

130.实施方案126至129中任一项的孔板，其中所述孔板的表面或者一个或多个孔的表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

131.实施方案126至130中任一项的孔板，其中每个呈递生物素的共价功能化的区域的面积为至少0.5mm²。在某些特定实施方案中，每个呈递生物素的共价功能化的区域的面积为至少1.0mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，或至少50mm²。在某些特定实施方案中，每个呈递生物素的共价功能化的区域的面积不超过100mm²。

132.实施方案126至131中任一项的孔板，其中每个呈递生物素的共价功能化的区域的生物素官能团的密度为至少50/um²。

133.实施方案126至132中任一项的孔板，其中每个呈递生物素的共价功能化的区域包括经由具有选自碳、硅、氮和氧的十个或更多个主链原子的连接基共价连接至表面的生物素官能团。在特定的实施方案中，连接基可以具有约10至约40个主链原子，或一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长，其间的任意数目的键长。

134.实施方案126至133中任一项的孔板，其中每个呈递生物素的共价功能化的区域的面积为所述一个或多个孔中的每一个的底部表面的面积的小于约50％，小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于约2％。

135.实施方案126至134中任一项的孔板，其中每个呈递生物素的共价功能化的区域的尺寸为0.5至4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

136.实施方案126至135中任一项的孔板，其中每个呈递生物素的共价功能化的区域是基本上圆形的并且具有0.5至4.0mm的直径(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

137.一种孔板，其包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面。在某些实施方案中，该表面包括多个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。

138.实施方案137的孔板，其中所述孔板的一个或多个孔中的每一个包括具有一个(或多个)呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面(即，内表面)。

139.实施方案138的孔板，其中一个或多个孔中的每一个的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域位于相应孔的底部表面上。

140.实施方案137至139中任一项的孔板，其中所述孔板或者一个或多个孔的表面包括玻璃或聚苯乙烯。

141.实施方案137至140中任一项的孔板，其中所述孔板或者一个或多个孔的表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

142.实施方案137至141中任一项的孔板，其中每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积为至少0.5mm²。在某些特定实施方案中，每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积为至少1.0mm²，至少2.0mm²，至少3.0mm²，至少4.0mm²，至少5.0mm²，至少6.0mm²，至少7.0mm²，至少8.0mm²，至少9.0mm²，至少10mm²，至少15mm²，至少20mm²，至少25mm²，至少30mm²，至少35mm²，至少40mm²，至少45mm²，或至少50mm²。在某些特定实施方案中，每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积不超过100mm²。

143.实施方案137至142中任一项的孔板，其中每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团的密度为至少50/um²。

144.实施方案137至143中任一项的孔板，其中每个链霉亲和素官能团共价附接到所述孔板或所述孔板的一个或多个孔的表面的共价功能化的区域。

145.实施方案137至144中任一项的孔板，其中每个链霉亲和素官能团非共价地附接到生物素部分，所述生物素部分本身共价附接到所述孔板或所述孔板的一个或多个孔的表面的共价功能化的区域。

146.实施方案138至145中任一项的孔板，其中每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积小于一个或多个孔中的每一个的底部表面的面积的约50％。

147.实施方案138至146中任一项的孔板，其中每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积为一个或多个孔中的每一个的底部的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％或小于2％。

148.实施方案137至147中任一项的孔板，其中每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的尺寸为0.5至4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

149.实施方案137至148中任一项的孔板，其中每个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域是基本上圆形的，并且具有0.5至-4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

150.实施方案126至149中任一项的孔板，其中所述孔板的表面包括多个呈递生物素或呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。

151.实施方案150的孔板，其中多个呈递生物素或呈递链霉亲和素的共价功能化的区域在孔板的孔的底部上成簇。

152.实施方案151的孔板，其中所述多个呈递生物素或呈递链霉亲和素的共价功能化的区域中的每一个的面积为一个或多个孔的每一个的底部的面积的小于约5％，小于约2％或小于约1％，并且进一步地，其中多个区域的总面积为一个或多个孔的每一个的底部的面积的小于约50％或小于约25％。

153.实施方案137至152中任一项的孔板，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域包括经由具有十个或更多个选自碳、硅、氮和氧的主链原子的连接基共价连接至表面的链霉亲和素官能团。在特定的实施方案中，连接基可以具有约10至约50个主链原子，或一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长，其间任意数目的键长。

154.实施方案126至153中任一项的孔板，其中孔板或者一个或多个孔中的每一个的表面还包括第二共价修饰的区域，该第二共价修饰的区域包括表面封闭配体。

155.实施方案154的孔板，其中每个表面封闭配体包含亲水性的或带负电荷的部分。

156.实施方案154或155的孔板，其中所述表面封闭配体包括聚乙二醇(peg)部分。

157.实施方案154至156中任一项的孔板，其中所述第二共价修饰的区域还包括提供刺激粘附的部分的至少一个配体。

158.实施方案137至157中任一项的孔板，其中链霉亲和素官能团共价或非共价附接至实施方案122至129中任一项的表面的共价功能化的区域。

159.一种孔板，其包括表面，该表面包括用于活化t细胞的孔板的呈递抗原的共价功能化的区域。

160.实施方案159的孔板，其中所述孔板的一个或多个孔中的每一个包括具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面。

161.实施方案159或160的孔板，其中一个或多个孔中的每一个的呈递抗原的共价功能化的区域位于相应孔的底部表面上。

162.实施方案159至161中任一项的孔板，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域包括多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体。

163.实施方案162的孔板，其中多个特异性结合的主活化分子配体各自包括被配置为与t细胞的t细胞受体结合的主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)。

164.实施方案163的孔板，其中mhc分子包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。

165.实施方案163或164的孔板，其中包括mhc分子的多个主活化分子中的每一个还包括抗原肽，以及任选的肿瘤相关的抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或原生动物抗原。

166.实施方案165的孔板，其中所述抗原肽是肿瘤相关的抗原，并且任选地，所述肿瘤相关的抗原是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

167.实施方案163至166中任一项的孔板，其中所述mhc分子的蛋白质序列经由所述蛋白质序列的c末端连接而与呈递抗原的合成表面连接。

168.实施方案162至167中任一项的孔板，其中多个特异性结合的共活化分子配体各自包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。

169.实施方案168的孔板，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约100:1至约1:100。

170.实施方案168至169中任一项的孔板，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或1:90至1:100，其中上述每个值均用“约”修饰。

171.实施方案168至170中任一项的孔板，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20或者约3:1至约1:3。

172.实施方案168至171中任一项的孔板，其中所述tcr共活化分子包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。

173.实施方案172的孔板，其中所述cd28结合蛋白或其片段还包括位点特异性c末端生物素部分。

174.实施方案168至173中任一项的孔板，其中所述t细胞受体(tcr)共活化分子包括cd80分子或其片段，其中所述片段保留与cd28的结合活性。

175.实施方案168至174中任一项的孔板，其中所述t细胞受体(tcr)共活化分子包括抗cd28抗体或其片段。

176.实施方案168至175中任一项的孔板，其中辅助tcr活化分子包括cd2结合蛋白。

177.实施方案176的孔板，其中所述cd2结合蛋白或其片段还包括位点特异性c末端生物素部分。

178.实施方案168至179中任一项的孔板，其中辅助tcr活化分子包括cd58分子或其片段，其中所述片段保留与cd2的结合活性。

179.实施方案168至178中任一项的孔板，其中辅助tcr活化分子包括抗cd2抗体或其片段。

180.实施方案166至179中任一项的孔板，其中多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体与实施方案1至11、实施方案31-33中任一项或者实施方案137至159中任一项的孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团特异性地结合。

181.实施方案166至180中任一项的孔板，其中多个特异性结合的主活化分子配体在呈递抗原的共价功能化的区域中的密度为至少约1×10²个分子/平方微米或者约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

182.实施方案166至181中任一项的孔板，其中多个特异性结合的共活化分子配体在呈递抗原的共价功能化的区域中的密度为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米或者约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

183.一种制备孔板的方法，该孔板包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面，该方法包括：

使孔板的一部分表面的氧化物部分与含叠氮基的偶联剂接触；和

形成孔板的呈递叠氮基的共价功能化的区域。

184.实施方案183的方法，其中该方法还包括在使表面的该部分的氧化物部分与含叠氮基的偶联剂接触之前，对孔板的表面进行等离子体清洁。

185.实施方案183或184的方法，其中当发生接触时，含叠氮基的偶联剂以气相存在。

186.实施方案183至185中任一项的方法，其中所述含叠氮基的偶联剂包括具有5至9个碳的碳主链的连接基。

187.实施方案186的方法，其中所述连接基具有7个碳的碳骨架。

188.实施方案183至187中任一项的方法，其中所述孔板的表面包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺(或者由其组成，或者基本上由其组成)。

189.实施方案183至188中任一项的方法，其中呈递叠氮基的共价功能化的区域的叠氮基的密度为至少50/um²。

190.实施方案183至189中任一项的方法，其中使孔板的表面的该部分的氧化物部分与含叠氮基的偶联剂接触包括使孔板的一个或多个孔中的每一个的表面与含叠氮基的偶联剂接触，从而在一个或多个孔中的每一个中形成具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面。

191.实施方案190的方法，其中使一个或多个孔的表面接触包括使相应的孔的底部表面与含叠氮基的偶联剂接触，从而在一个或多个孔中的每一个的底部表面上形成呈递叠氮基的共价功能化的区域。

192.实施方案191的方法，其中使一个或多个孔中的每一个的底部表面接触包括仅使底部表面接触，从而仅在一个或多个孔中的每一个的底部表面上形成呈递叠氮基的共价功能化的区域。

193.一种制备孔板的方法，该孔板包括具有呈递生物素的共价功能化的区域的表面，该方法包括：

使孔板的表面的一部分与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，从而形成孔板的呈递生物素的功能化的区域，和

使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，从而提供表面的封闭配体修饰的区域。

194.实施方案193的方法，其中所述封闭配体修饰的区域和呈递生物素的区域覆盖整个表面，并且任选地，其中所述封闭配体修饰的区域和呈递生物素的区域是所述表面的非重叠区域。

195.实施方案193或194的方法，其中使孔板的表面的一部分与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触包括使孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面接触。

196.实施方案195的方法，其中使一个或多个孔中的每一个接触还包括使一个或多个孔中的每一个在相应孔的底部表面处与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，从而在相应孔的底部表面上产生呈递生物素的共价功能化的区域。

197.实施方案196的方法，其中所述呈递生物素的共价功能化的区域仅形成在相应孔的底部表面上。

198.实施方案193至197中任一项的方法，其中所述呈递生物素的共价功能化的区域的生物素官能团的密度为至少50/um²。

199.实施方案193至198中任一项的方法，其中呈递生物素的共价功能化的区域的面积小于所述一个或多个孔中的每一个的底部的面积的约50％。

200.实施方案193至199中任一项的方法，其中所述呈递生物素的共价功能化的区域的面积为一个或多个孔中的每一个的底部的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％，或少于约1％。

201.实施方案193至200中任一项的方法，其中所述呈递生物素的共价功能化的区域的面积小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²。

202.实施方案193至201中任一项的方法，其中所述呈递生物素的共价功能化的区域的尺寸为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

203.实施方案193至202中任一项的方法，其中所述呈递生物素的共价功能化的区域是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至3.0mm)的直径。

204.实施方案196至203中任一项的方法，其还包括使一个或多个孔中的每一个的底部的多个区域与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，从而在一个或多个孔中的每一个中产生多个呈递生物素的区域。

205.实施方案193至204中任一项的方法，其中包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂是铜依赖性点击偶联剂。

206.实施方案205的方法，其还包括在使表面的一部分与铜依赖性点击偶联剂接触之后以及在使表面与包括表面封闭配体的试剂接触之前，使孔板的表面与含硫醇的试剂或铜螯合剂接触。

207.实施方案193至206中任一项的方法，其中每个表面封闭配体包括亲水性的或带负电荷的部分。

208.实施方案193至207中任一项的方法，其中所述表面封闭配体包括聚乙二醇(peg)部分。

209.实施方案196至208中任一项的方法，其还包括使一个或多个孔中的每一个的一个或多个表面与包括被配置为提供粘附刺激的配体的试剂接触，其中所述接触在使一个或多个孔中的每一个的表面与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触之后进行，从而在一个或多个孔的呈递生物素的区域之外设置被配置为提供粘附刺激的配体。

210.实施方案193至209中任一项的方法，其中所述反应性部分被设置在孔板的一个或多个孔内。

211.实施方案1937至2104中任一项的方法，其中所述表面的反应性部分包括叠氮基或炔基反应性部分。

212.实施方案193至211中任一项的方法，其中所述孔板包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

213.一种制备孔板的方法，该孔板包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面，该方法包括：使孔板的表面的一部分与包括与反应性基团连接的链霉亲和素官能团的试剂或者包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，并且，当试剂包括与反应性基团连接的生物素部分时，随后使表面的该部分与链霉亲和素接触，从而形成孔板的呈递链霉亲和素的功能化的区域，并且使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，从而提供表面的封闭配体修饰的区域。

214.实施方案213的方法，其中所述封闭配体修饰的区域和呈递链霉亲和素的区域覆盖整个表面，并且任选地，其中所述封闭配体修饰的区域和呈递链霉亲和素的区域是所述表面的非重叠区域。

215.实施方案213或214的方法，其中使孔板的表面的该部分与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或者包括生物素部分的试剂接触包括接触孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面。

216.实施方案215的方法，其中使一个或多个孔中的每一个接触还包括使一个或多个孔中的每一个在相应孔的底部表面处与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或者与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，从而在相应孔的底部表面上产生呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。

217.实施方案216的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域仅形成在相应孔的底部表面上。

218.实施方案213至217中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的链霉亲和素官能团的密度为至少50/um²。

219.实施方案213至218中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积小于一个或多个孔中的每一个的底部的面积的约50％。

220.实施方案213至219中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积为一个或多个孔中的每一个的底部的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％，或少于约1％。

221.实施方案213至220中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的面积小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²。

222.实施方案213至221中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的尺寸为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

223.实施方案213至222中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至3.0mm)的直径。

224.实施方案213至223中任一项的方法，其还包括使一个或多个孔中的每一个的底部的多个区域与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，从而在一个或多个孔中的每一个中产生多个呈递链霉亲和素的区域。

225.实施方案213至224中任一项的方法，其中包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或者包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂是铜依赖性点击偶联剂。

226.实施方案225的方法，其还包括在使表面的一部分与铜依赖性点击偶联剂接触之后，并且在使表面与包括表面封闭配体的试剂接触之前，使孔板的表面与含硫醇的试剂或铜螯合剂接触。

227.实施方案213至226中任一项的方法，其中每个表面封闭配体包括亲水性的或带负电荷的部分。

228.实施方案213至227中任一项的方法，其中所述表面封闭配体包括聚乙二醇(peg)部分。

229.实施方案215至228中任一项的方法，其还包括使一个或多个孔中的每一个的一个或多个表面与包括被配置为提供粘附刺激的配体的试剂接触，其中所述接触在使一个或多个孔中的每一个的表面与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或者与包括生物素部分的试剂接触之后进行，从而在一个或多个孔的呈递链霉亲和素的区域之外设置被配置为提供粘附刺激的配体。

230.实施方案213至229中任一项的方法，其中所述反应性部分被设置在孔板的一个或多个孔内。

231.实施方案213至230中任一项的方法，其中所述表面的反应性部分包括叠氮基或炔基反应性部分。

232.实施方案213至231中任一项的方法，其中所述孔板包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

233.一种制备孔板的方法，该孔板包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面，该方法包括：在表面上形成呈递反应性部分的共价功能化的表面；使表面与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或者包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，其中反应性基团被配置为与呈递反应性基团的表面的反应性部分反应，从而形成呈递链霉亲和素的功能化的区域或呈递生物素的功能化的表面，其中当试剂包括与反应性基团连接的生物素部分时，随后使孔板的一部分与链霉亲和素接触，并且进一步地，其中表面的呈递反应性部分的共价功能化的配体或者呈递生物素的功能化的表面包括uv不稳定的连接部分；通过掩模使表面暴露于uv照射，该掩模被配置为暴露表面的一部分之外的所有表面；以及裂解暴露的链霉亲和素或生物素修饰的表面配体的uv不稳定连接基，从而形成孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。

234.实施方案233的方法，其中形成呈递反应性部分的共价功能化的表面包括使含反应性部分的偶联剂与孔板表面的氧化物部分反应，其中所述含反应性部分的偶联剂还包括uv不稳定的连接部分。

235.实施方案233或234的方法，其中该方法还包括在使表面的氧化物部分与含反应性部分的偶联剂接触之前，对孔板的表面进行等离子体清洁。

236.实施方案233至235中任一项的方法，其中使孔板的表面与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或者包括生物素部分的试剂接触包括接触孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面。

237.实施方案236的方法，其中接触一个或多个孔中的每一个还包括使一个或多个孔中的每一个在相应孔的底部表面处与包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分的试剂或者与包括与反应性基团连接的生物素部分的试剂接触，从而在相应孔的底部表面上产生呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。

238.实施方案237的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域仅形成在相应孔的底部表面上。

239.实施方案233至238中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域具有至少50/um²的链霉亲和素官能团的密度。

240.实施方案233至239中任一项的方法，其中所述表面的反应性部分包括叠氮基部分或炔基部分。

241.实施方案236至240中任一项的方法，其中形成呈递链霉亲和素的共价功能化的区域包括仅在孔板的一个或多个孔的底部上形成呈递链霉亲和素的共价功能化的区域。

242.一种制备孔板的方法，该孔板包括具有用于活化t细胞的呈递抗原的共价功能化的区域的表面，该方法包括使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个主活化分子接触，每个主活化分子均包括i类主要组织相容性复合物(mhc)分子和结合部分，该i类主要组织相容性复合物(mhc)分子被配置为与t细胞的t细胞受体结合，其中多个主活化分子的结合部分被配置为与链霉亲和素的结合位点结合；使多个共活化分子(每个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子；或辅助tcr活化分子，其中所述共活化分子各自还包括被配置为与链霉亲和素的结合位点结合的结合部分)与孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的第二多个结合部分接触，从而提供孔板的呈递抗原的共价功能化的区域的多个特异性结合的主活化分子配体和多个特异性结合的共活化分子配体。

243.实施方案242的方法，其还包括使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中所述反应性基团被配置为与表面的反应性部分反应，从而提供表面的封闭配体修饰的区域。

244.实施方案243的方法，其中所述封闭配体修饰的区域和所述呈递抗原的共价功能化的区域覆盖整个表面，并且任选地，其中所述封闭配体修饰的区域和所述呈递抗原共价功能化的区域是表面的非重叠区域。

245.实施方案242至244中任一项的方法，其中使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个主活化分子和多个共活化分子接触包括使孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面接触。

246.实施方案245的方法，其中使一个或多个孔中的每一个接触还包括使一个或多个孔中的每一个在相应孔的底部表面处与多个主活化分子和多个共活化分子接触，从而在相应孔的底部表面上产生呈递抗原的共价功能化的区域。

247.实施方案246的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域仅形成在相应孔的底部表面上。

248.实施方案242至247中任一项的方法，其中所述呈递链霉亲和素的共价功能化的区域具有至少50/um²的链霉亲和素官能团的密度。

249.实施方案245至248中任一项的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域的面积小于一个或多个孔的底部的面积的约50％。

250.实施方案245至248中任一项的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域的面积为一个或多个孔的底部的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％，或小于约1％。

251.实施方案242至250中任一项的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域的面积为小于约35mm²，小于约20mm²，小于约12mm²，小于约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²。

252.实施方案242至251中任一项的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域的尺寸为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

253.实施方案242至252中任一项的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至3.0mm)的直径。

254.实施方案245至253中任一项的方法，其中使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个主活化分子和多个共活化分子接触还包括使孔板的一个或多个孔中的每一个内的多个呈递链霉亲和素的共价功能化区域接触，从而在一个或多个孔中的每一个中产生多个呈递抗原的共价功能化的区域。

255.实施方案254的孔板，其中多个呈递抗原的共价功能化的区域中的每一个的面积小于一个或多个孔的底部的面积的约5％，并且进一步地，其中多个呈递抗原的共价功能化的区域的总面积为一个或多个孔的底部的面积的小于约50％，约25％或约10％。

256.实施方案242至255中任一项的方法，其中所述表面的反应性部分为叠氮基或炔基反应性部分。

257.实施方案242至254中任一项的方法，其中所述孔板包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

258.实施方案242至257中任一项的方法，其中所述mhc分子包括i类mhc蛋白质序列和β微球蛋白蛋白质序列。

259.实施方案242至258中任一项的方法，其中包括mhc分子的多个主活化分子中的每一个还包括肿瘤相关的抗原。

260.实施方案259的方法，其中所述肿瘤相关的抗原是slc45a2、tcl1、vcx3a、mart1或nyeso1。

261.实施方案242至260中任一项的方法，其中mhc分子的蛋白质序列经由蛋白质序列的c末端连接而连接至表面。

262.实施方案242至261中任一项的方法，其中所述mhc分子包括生物素部分并且经由与链霉亲和素的非共价相互作用而附接于表面。

263.实施方案242至262中任一项的方法，其中链霉亲和素本身共价键合至表面。

264.实施方案242至263中任一项的方法，其中链霉亲和素通过一系列约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200个键长，或其间的任意数目的键长键合至表面。

265.实施方案242至264中任一项的方法，其中链霉亲和素非共价缔合至表面。

266.实施方案265的方法，其中链霉亲和素非共价缔合至生物素部分，并且生物素部分共价键合至表面。

267.实施方案262的方法，其中生物素通过连接基通过约5、7、9、10、11、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、95、100、200个键长，或其间的任意数目的键长连接到表面。

268.实施方案242至267中任一项的方法，其中所述呈递抗原的共价功能化的区域中的主活化分子配体与共活化分子配体的比率为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1，或约1:2至约1:1。

269.实施方案242至268中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约100:1至约1:100。

270.实施方案242至269中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为100:1至90:1，90:1至80:1，80:1至70:1，70:1至60:1，60:1至50:1，50:1至40:1，40:1至30:1，30:1至20:1，20:1至10:1，10:1至1:1，3:1至1:3；1:1至1:10，1:10至1:20，1:20至1:30，1:30至1:40，1:40至1:50，1:50至1:60，1:60至1:70，1:70至1:80，1:80至1:90，或1:90至1:100，其中上述每个值均用“约”修饰。

271.实施方案242至270中任一项的方法，其中多个共活化分子配体中的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20或者约3:1至约1:3。

272.实施方案242至271中任一项的方法，其中多个特异性结合的主活化分子配体在呈递抗原的共价功能化的区域的密度为至少约1×10²个分子/平方微米或者约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

273.实施方案242至272中任一项的孔板，其中所述多个特异性结合的共活化分子配体在呈递抗原的的共价功能化的区域中的呈递抗原的合成表面密度上的密度为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米或者约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

274.实施方案242至273中任一项的方法，其中所述t细胞受体(tcr)共活化分子包括cd28结合蛋白或其保留与cd28的结合能力的片段。

275.实施方案274的方法，其中cd28结合蛋白或其片段还包括位点特异性c末端生物素部分。

276.实施方案242至273中任一项的方法，其中所述t细胞受体(tcr)共活化分子包括cd80分子或其片段，其中所述片段保留与cd28的结合活性。

277.实施方案242至273中任一项的方法，其中所述t细胞受体(tcr)共活化分子包括抗cd28抗体或其片段。

278.实施方案242至277中任一项的方法，其中所述辅助tcr活化分子包括cd2结合蛋白。

279.实施方案278的方法，其中所述cd2结合蛋白或其片段还包括位点特异性c末端生物素部分。

280.实施方案242至277中任一项的方法，其中所述辅助tcr活化分子包括cd58分子或其片段，其中所述片段保留与cd2的结合活性。

281.实施方案242至277中任一项的方法，其中所述辅助tcr活化分子包括抗cd2抗体或其片段。

282.实施方案242至281中任一项的方法，其中每个表面封闭配体包括亲水性的或带负电荷的部分。

283.实施方案242至282中任一项的方法，其中所述表面封闭配体包括聚乙二醇(peg)部分。

284.一种制备孔板的方法，该孔板包括具有淋巴细胞活化共价功能化的区域的表面，该方法包括：使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个第一活化分子接触，每个第一活化分子包括结合部分，其中第一活化分子的结合部分被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，从而提供淋巴细胞活化共价功能化的区域。

285.实施方案284的方法，其还包括使孔板的表面与包括与反应性基团连接的表面封闭配体的试剂接触，其中所述反应性基团被配置为与所述表面的反应性部分反应，从而提供表面的封闭配体修饰的区域。

286.实施方案285的方法，其中所述封闭配体修饰的区域和所述淋巴细胞活化共价功能化的区域覆盖整个表面，并且任选地，其中所述封闭配体修饰的区域和所述淋巴细胞活化共价功能化的区域是所述表面的非重叠区域。

287.实施方案284至286中任一项的方法，其中使所述孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与所述多个第一活化分子接触包括接触所述孔板的一个或多个孔中的每一个内的表面。

288.实施方案287的方法，其中使一个或多个孔中的每一个接触还包括使一个或多个孔中的每一个在相应孔的底部表面处与多个第一活化分子接触，从而在相应空的底部表面上产生淋巴细胞活化共价功能化的区域。

289.实施方案288的方法，其中所述淋巴细胞活化共价功能化的区域仅形成在相应孔的底部表面上。

290.实施方案284至287中任一项的方法，其中呈递链霉亲和素的共价功能化的区域具有至少50/um²的链霉亲和素官能团的密度。

291.实施方案287至290中任一项的方法，其中所述淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积小于一个或多个孔的底部的面积的约50％。

292.实施方案287至291中任一项的方法，其中所述淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积为一个或多个孔的底部的面积的小于约25％，小于约15％，小于约10％，小于约5％，小于约2％，或小于约1％。

293.实施方案284至292中任一项的方法，其中所述淋巴细胞活化共价功能化的区域的面积具有小于约35mm²，约20mm²，约12mm²，约5mm²，小于约2mm²，或小于约1mm²的面积。

294.实施方案284至293中任一项的方法，其中所述淋巴细胞活化共价功能化的区域的尺寸为约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)。

295.实施方案284至294中任一项的方法，其中所述淋巴细胞活化共价功能化的区域是基本上圆形的，并且具有约0.5mm至约4.0mm(例如，约1.0mm至约3.5mm，或约1.5mm至约3.0mm)的直径。

296.实施方案284至295中任一项的方法，其中使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个第一活化分子接触还包括使多个呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与孔板的一个或多个孔中的每一个中的多个第一活化分子接触，从而在一个或多个孔中的每一个中产生多个淋巴细胞活化共价功能化的区域。

297.实施方案296的孔板，其中多个淋巴细胞活化共价功能化的区域中的每一个的面积小于一个或多个孔的底部的面积的约5％，并且进一步地，其中多个淋巴细胞活化共价功能化的区域的总面积为一个或多个孔的底部的面积的小于约50％，约25％或约10％。

298.实施方案284至297中任一项的方法，其中所述表面的反应性部分为叠氮基或炔基反应性部分。

299.实施方案284至298中任一项的方法，其中所述孔板包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、环烯烃共聚物或三聚氰胺。

300.实施方案284至299中任一项的方法，其中淋巴细胞是t细胞、天然杀伤性t(nkt)细胞或b细胞。

301.实施方案284至300中任一项的方法，其中所述多个第一活化分子是分化结合分子、细胞表面免疫球蛋白结合分子、t细胞受体分子活化分子、tnf受体超家族结合分子、趋化因子受体结合分子、生长因子分子或粘附促进分子的细胞表面簇。

302.实施方案301的方法，其中多个第一活化分子包括mhc分子、保留分化结合活性的细胞表面簇的蛋白质或其片段、保留细胞表面免疫球蛋白结合能力的蛋白质或其片段、保留t细胞受体结合能力的蛋白质或其片段、保留tnf受体超家族结合活性的蛋白质或其片段、保留趋化因子受体结合活性的蛋白质或其片段、保留生长刺激活性的蛋白质或其片段或者保留粘附促进活性的蛋白质或其片段。

303.实施方案301或302的方法，其中多个第一活化分子包括保留分化结合活性的细胞表面簇的蛋白质或其片段、保留生长刺激活性的蛋白质或其片段或者保留粘附促进活性的蛋白质或其片段。

304.实施方案284至303中任一项的方法，其中所述多个特异性结合的第一活化分子配体在淋巴细胞活化共价功能化的区域中的密度为至少约1×10²个分子/平方微米或者约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米。

305.实施方案284至304中任一项的方法，其还包括使孔板的呈递链霉亲和素的共价功能化的区域与多个第二活化分子接触，每个第二活化分子包括结合部分，其中所述第二活化分子的结合部分被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，从而在淋巴细胞活化共价功能化的区域中提供多个特异性结合的第二活化分子配体。

306.实施方案305的方法，其中多个第二活化分子是t细胞受体(tcr)共活化分子、细胞表面免疫球蛋白结合分子、生长因子分子、粘附促进分子。

307.实施方案304或305的孔板，其中多个特异性结合的共活化分子配体在淋巴细胞活化共价功能化的区域中的密度为约1×10²至约1×10⁵个分子/平方微米或者约1×10³至约1×10⁵个分子/平方微米。

308.实施方案284至307中任一项的方法，其中淋巴细胞活化共价功能化的区域中的主活化分子配体与共活化分子配体的比率为约1:10至约2:1，约1:5至约2:1，约1:2至约2:1，约1:10至约1:1，约1:5至约1:1，约1:1至约2:1，或约1:2至约1:1。

309.实施方案285至308中任一项的方法，其中所述封闭配体修饰的区域和所述呈递抗原的共价功能化的区域覆盖整个表面，并且任选地，其中所述封闭配体修饰的区域和所述淋巴细胞活化共价功能化的区域是表面的非重叠区域。

310.实施方案285至309中任一项的方法，其中每个表面封闭配体包括亲水性的或带负电荷的部分。

311.实施方案285至310中任一项的方法，其中所述表面封闭配体包括聚乙二醇(peg)部分。

312.一种用于制备孔板的试剂盒，该孔板包括具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面，该试剂盒包括：孔板，该孔板包括具有呈递生物素的共价功能化的区域的表面；以及包括链霉亲和素的表面功能化试剂。

313.实施方案312的试剂盒，其中包括具有呈递生物素的共价功能化的区域的表面的孔板是实施方案1至11中任一项的孔板，其中所述反应性部分是生物素；或者实施方案31至33中任一项的孔板，其中所述反应性部分是生物素；或者实施方案126至136中任一项的孔板。

314.实施方案312或313的试剂盒，其还包括第一活化试剂，该第一活化试剂包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，并且进一步地，其中所述mhc分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合。

315.实施方案312至314中任一项的试剂盒，其中多个mhc分子中的每一个还包括至少一个生物素官能团。

316.实施方案312至315中任一项的试剂盒，其还包括试剂，该试剂包括多个共活化分子，每个共活化分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合，并且其中每个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。

317.实施方案316的试剂盒，其中多个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子和辅助tcr活化分子。

318.实施方案317的试剂盒，其中容纳包含多个共活化分子的试剂的容器含有的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20。

319.实施方案312至318中任一项的试剂盒，其中所述tcr共活化分子是cd28受体的激动剂。

320.实施方案312至319中任一项的试剂盒，其中所述辅助tcr活化分子是cd2受体的激动剂。

321.实施方案312至320中任一项的试剂盒，其还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。

322.实施方案321的试剂盒，其中生长因子受体配体包括il-21或其片段。

323.实施方案321或322的试剂盒，其还包括第二生长刺激性分子，其包括il-7或il-2。

324.一种用于制备孔板的试剂盒，该孔板包括具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面，该试剂盒包括：孔板，其包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面；和第一表面功能化试剂。

325.实施方案324的试剂盒，其中包括具有呈递叠氮基的共价功能化的区域的表面的孔板是实施方案1至11中任一项的孔板，其中反应性部分是叠氮基；实施方案31至33中任一项的孔板，其中反应性部分是叠氮基；或者实施方案122至129中的任一项的孔板。

326.实施方案324或325的试剂盒，其中所述第一表面功能化试剂包括试剂，该试剂包括与反应性基团连接的生物素部分，其中所述反应性基团被配置为与表面的叠氮基部分反应。

327.实施方案326的试剂盒，其还包括第二表面功能化试剂，该第二表面功能化试剂包括链霉亲和素。

328.实施方案326或327的试剂盒，其中所述第一功能化试剂包括与反应性基团连接的链霉亲和素部分，其中所述反应性基团被配置为与叠氮基部分反应。

329.实施方案324至328中任一项的试剂盒，其还包括表面封闭试剂，所述表面封闭试剂包括与反应性基团连接的表面封闭部分，该反应性基团被配置为与叠氮基部分反应。

330.实施方案329的试剂盒，其中所述表面封闭部分包括亲水性的或带负电荷的部分。

331.实施方案329或330的试剂盒，其中所述表面封闭试剂包括聚乙二醇(peg)部分。

332.实施方案324至331中任一项的试剂盒，其还包括第一活化试剂，其包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，且进一步地，其中mhc分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合。

333.实施方案332的试剂盒，其中多个mhc分子中的每一个还包括至少一个生物素官能团。

334.实施方案324至333中任一项的试剂盒，其还包括包含多个共活化分子的试剂，每个共活化分子具有被配置为与链霉亲和素的结合位点结合的结合部分，并且其中每个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。

335.实施方案334的试剂盒，其中多个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子和辅助tcr活化分子。

336.实施方案335的试剂盒，其中容纳包含多个共活化分子的试剂的容器含有的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20。

337.实施方案324至336中任一项的试剂盒，其中所述tcr共活化分子是cd28受体的激动剂。

338.实施方案324至337中任一项的试剂盒，其中所述辅助tcr活化分子是cd2受体的激动剂。

339.实施方案324至338中任一项的试剂盒，其还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。

340.实施方案339的试剂盒，其中生长因子受体配体包括il-21或其片段。

341.实施方案339或340的试剂盒，其还包括第二生长刺激性分子，其包括il-7或il-2。

342.一种用于制备孔板的试剂盒，该孔板包括具有用于t淋巴细胞(t细胞)的抗原特异性活化的呈递抗原的共价功能化的区域的表面，该试剂盒包括：包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的孔板；以及第一活化试剂，其包括多个主要组织相容性复合物(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置为与t细胞的t细胞受体结合，并且进一步地，其中mhc分子被配置为与链霉亲和素的结合位点结合。

343.实施方案342的试剂盒，其中所述孔板是实施方案1至38中任一项的包括具有呈递链霉亲和素的共价功能化的区域的表面的孔板，其中反应性部分是链霉亲和素；或者实施方案141至162中任一项的孔板。

344.实施方案343的试剂盒，其中多个mhc分子中的每一个还包括至少一个生物素官能团。

345.实施方案342至344中任一项的试剂盒，其还包括试剂，该试剂包括多个共活化分子，每个共活化分子具有被配置为与链霉亲和素的结合位点结合的结合部分，并且其中每个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子或辅助tcr活化分子。

346.实施方案345的试剂盒，其中多个共活化分子包括t细胞受体(tcr)共活化分子和辅助tcr活化分子。

347.实施方案346的试剂盒，其中容纳包含多个共活化分子的试剂的容器含有的tcr共活化分子与辅助tcr活化分子的比率为约20:1至约1:20。

348.实施方案342至347中任一项的试剂盒，其中所述tcr共活化分子是cd28受体的激动剂。

349.实施方案342至348中任一项的试剂盒，其中所述辅助tcr活化分子是cd2受体的激动剂。

350.实施方案342至349中任一项的试剂盒，其还包括包含生长刺激性分子的试剂，其中每个生长刺激性分子包括生长因子受体配体。

351.实施方案350的试剂盒，其中所述生长因子受体配体包括il-21或其片段。

352.实施方案350或351的试剂盒，其还包括第二生长刺激性分子，其包括il-7或il-2。

353.一种治疗需要治疗癌症的受试者的方法；包括：从受试者获得多个t淋巴细胞(t细胞)；使多个t细胞与孔板的表面接触，所述孔板包括呈递抗原的共价功能化的区域，其中呈递抗原的共价功能化的区域包括多个主要组织相容性复合体(mhc)分子(例如，i类或ii类)，其被配置成与多个t细胞中的每一个的t细胞受体结合，其中所述mhc分子包括对受试者的癌症具有特异性的抗原；产生多个活化的t细胞，其中所述活化被配置为对受试者的癌症具有特异性；从未活化的细胞中分离出多个特异性活化的t细胞；以及将多个抗原特异性活化的t细胞引入到受试者中。

354.实施方案353的方法，其中包括具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面的孔板是实施方案12至38中任一项的孔板，其中淋巴细胞活化部分包括主活化部分和共活化部分；或者实施方案159至182中任一项的孔板。

355.实施方案353或354的方法，其中包括具有呈递抗原的共价功能化的区域的表面的孔板是通过实施方案242至283中任一项的方法制备的。

356.一种治疗需要治疗癌症的受试者的方法；包括：从受试者获得多个t淋巴细胞(t细胞)；通过实施方案38至87中任一项的方法产生多个活化的t细胞，其中所述活化被配置为对受试者的癌症是特异性的；从未活化的细胞中分离出多个特异性活化的t细胞；以及将多个抗原特异性活化的t细胞引入到受试者中。