一种磺胺类抗生素降解菌及其应用

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种磺胺类抗生素降解菌paenarthrobacternicotinovoranssmk-1及其应用。
背景技术：
：抗生素是一类具有抑制或杀死微生物的化学物质，一般由微生物代谢产生或人工合成，由于在治疗和预防动物疾病、促进动物生长发育方面效果显著，抗生素在全球范围内被广泛使用于畜禽养殖业(chee-sanfordetal.,2001)，其中包括常用的四环素类和磺胺类药物。据报道，2010年全球抗生素使用量达10～20万吨(tashoandchoetal.,2016)，我国2013年抗生素使用量约为16.2万吨(zhangetal.,2015)。未经处理或处理不完善的禽畜粪肥和污水常被直接且持续排放环境中，导致抗生素不断积累并长期保持在较高含量，目前是受到广泛关注的一类环境污染物质。环境中有毒有害有机污染物的自然衰减主要依赖相关微生物代谢作用，生物修复技术具有成本低、效果好、无二次污染等优点，微生物降解是抗生素去除的主要途径和主要修复措施之一。目前已分离得到多种能够利用磺胺类化合物作为碳源的单菌或混合菌群，主要来自于变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，出现频率较高的属为假单胞属(pseudomonassp.)，细杆菌属(microbacteriumsp.)，红球菌属(rhodococcussp.)、无色杆菌属(achromobactersp.)，产碱杆菌属(alcaligenessp.)、罗尔斯通菌属(ralstoniasp.)，希瓦氏菌属(shewanellasp.)，节杆菌属(arthrobactersp.)，副球菌属(paracoccussp.)，科瑞贝拉属(kribbellasp.)，芽孢杆菌属(bacillussp.)，诺卡氏菌属(nocardioidessp.)，梭菌属(clostridiumsp.)(chenandxie,2018；dengetal.,2016；zhouetal.,2019；闫雷etal.,2019)。近年来国内外科研工作者证实了磺胺甲恶唑的降解能力，并对其降解性能进行初步研究。sas(磺胺类抗生素)污染物在微生物降解过程中，充当着碳源，为微生物的生长代谢提供必要养分。而微生物对磺胺类污染物的利用过程，对水环境等有着重要的影响，高极性c-s键使得磺酰基产生吸电子效应，从而令与芳香族化合物结合的磺酸极为牢固，这极大地加大了磺胺类污染物被微生物降解的难度。张珈瑜等从城市污水处理厂活性污泥中分离得到一株能以磺胺二甲基嘧啶为唯一碳源的菌株蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)，在温度为30℃、ph＝8.0、初始od600＝0.1、磺胺二甲基嘧啶起始浓度为50mg·l-1的最佳条件下，36h内对磺胺二甲基嘧啶的降解率就可达到100％(张珈瑜etal.,2019)。还有学者以哈尔滨污水厂的活性污泥为样本，加入到含有磺胺甲噁唑的最小矿物盐介质培养基(mmsm)中，在10℃、150r·min-1的条件下，筛选出一株嗜冷假单胞菌(pseudomonaspsychrophila)，并将该菌株接种于含有100mg·l-1磺胺甲噁唑的mmsm中，于10℃、150r·min-1的条件下培养192h，可将污染物降解34.30％(jiangetal.,2014)。gauthier(gauthieretal.,2010)购买了玫瑰红红球菌(rhodococcusrhodochrous)等，将其先在bhi培养基中培养一次，然后在mmsm培养基中培养两次，最后接种于含有30mg·l-1磺胺甲噁唑和3g·l-1外加碳源葡萄糖的培养基中，于26℃和150r·min-1的培养箱中进行降解实验，结果表明在培养36天后，玫瑰红红球菌可降解20％的磺胺甲噁唑。目前，由于工矿业、农业等人为活动以及土壤环境背景值高等因素已经造成了环境中抗生素的严重污染，并且农田土壤抗生素不断积累并长期保持在较高含量，影响动植物生长、微生物群落结构和酶活性，进而影响农产品安全和土壤功能(kummerer,2009；zouetal.,2011；徐秋桐etal.,2014)。因此，筛选出能有效降解高浓度抗生素磺胺甲恶唑的菌株更具应用价值。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种磺胺类抗生素降解菌paenarthrobacternicotinovoranssmk-1。该菌是从广州新塘污水处理厂曝气池采集活性污泥，进行长期驯化通过多次筛选和分离纯化得到高效的、能降解高浓度磺胺甲恶唑的抗生素降解菌。本发明的另一目的在于提供上述磺胺类抗生素降解菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种磺胺类抗生素降解菌，菌株命名为paenarthrobacternicotinovoranssmk-1，是从广州新塘污水处理厂曝气池采集活性污泥，进行长期驯化通过多次筛选和分离纯化得到。所述的paenarthrobacternicotinovoranssmk-1的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmccno：61613，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年4月21日。本发明的磺胺类抗生素降解菌paenarthrobacternicotinovoranssmk-1的菌学特性描述如下：该菌经活化以后，在30℃有氧的条件下在固体营养培养基制成的平板上生长48h后，能形成直径为0.3～2.5mm淡黄色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的、不透明、边缘整齐、无芽孢、无鞭毛的菌落，其菌落图见图1。分子生物学特性：该菌的dnag+c含量为57.0％，扩增该菌的16srrna基因并测序，得到如seqidno：1所示的dna序列，利用该序列采用邻位相接法和最小进化法构建系统发育树的结果表明，该菌与paenarthrobacternicotinovoransdsm420同源性最高，且该菌在分子生物学层面上是属于paenarthrobacter同一个属的不同株种系，因此将本发明的磺胺类抗生素降解菌smk-1命名为paenarthrobacternicotinovoranssmk-1。paenarthrobacternicotinovoranssmk-1应用于磺胺甲恶唑降解的实验结果表明：在30℃，ph6～8，不添加nacl的无机盐培养基的培养条件下，paenarthrobacternicotinovoranssmk-1能够降解抗生素，在磺胺甲恶唑初始浓度为30mg·l-1的无机盐培养基培养5天后，降解率均可达25％以上，培养10天时，降解率均可达45％以上；在磺胺甲恶唑的初始浓度在100mg·l-1、ph6～7的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达到20％以上，在100mg·l-1、ph8的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达到73％以上；说明paenarthrobacternicotinovoranssmk-1是一种降解磺胺甲恶唑及耐受磺胺甲恶唑能力均很强的菌株，从而可以预见该菌对磺胺甲恶唑具有较好的耐受性和降解性。本发明还提供一种生物制剂，基于上述磺胺类抗生素降解菌制备得到。所述的生物制剂由该磺胺类抗生素降解菌经液体培养制备得到，优选包含以下步骤：将该磺胺类抗生素降解菌接种至lb液体培养基中培养，即可获得生物制剂。所述的培养指在25～40℃，ph5.0～9.0下培养24～72h。进一步的，所述的培养指在25～37℃，ph5.0～9.0下培养24～72h。更进一步的，所述的培养指在30～37℃，ph5.0～9.0下培养24～72h。本发明的另一个目的是提供磺胺类抗生素降解菌paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在降解磺胺类抗生素中的应用，进一步的，磺胺类抗生素降解菌paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在降解抗生素磺胺甲恶唑中的应用。本发明的paenarthrobacternicotinovoranssmk-1是在活性污泥中分离并鉴定的新型菌株，关于paenarthrobacternicotinovorans对抗生素降解研究国内外还未见报道；paenarthrobacternicotinovoranssmk-1能以高浓度抗生素作为碳源从而有效降解，该菌在抗生素初始浓度为30mg·l-1、ph6～8的无机盐培养基培养5天后，降解率均可达25％以上，培养10天时，降解率均可达45％以上；在磺胺甲恶唑的初始浓度在100mg·l-1、ph6～7的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达到20％以上，在100mg·l-1、ph8的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达到73％以上；该菌是一种降解抗生素及耐受抗生素能力均很强的菌株，对磺胺甲恶唑适应性强；在磺胺甲恶唑污染环境的生物修复中具有很好的应用前景。一种降解磺胺类抗生素的方法，是将上述磺胺类抗生素降解菌paenarthrobacternicotinovoranssmk-1或上述生物制剂施放到含有磺胺类抗生素的环境中，实现降解磺胺类抗生素的目的。所述的含有磺胺类抗生素的环境是含有磺胺类抗生素的水或土壤。所述的磺胺类抗生素的浓度为1～100mg·l-1。所述的磺胺类抗生素为磺胺甲恶唑。所述的环境中，温度25～40℃，初始ph为5～9，好氧情况下。进一步的，所述的环境中，温度25～37℃，初始ph为5～9，好氧情况下。更进一步的，所述的环境中，温度30～37℃，初始ph为6～8，好氧情况下。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明分离得到一株以磺胺甲恶唑为碳源的降解菌株，根据菌株形态、生理特征、16srdna基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为paenarthrobacter属的不同种并将其命名为paenarthrobacternicotinovoranssmk-1。该菌能够利用磺胺甲恶唑作为唯一碳源并且很快地降解抗生素磺胺甲恶唑，菌株smk-1在抗生素初始浓度为100mg·l-1、ph为8的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达73％以上；在ph为6、磺胺甲恶唑的初始浓度在30mg·l-1的无机盐培养基培养3天后，降解率均可达到31％以上；在ph为6、磺胺甲恶唑的初始浓度在30mg·l-1的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达到79％以上；在ph为8的时候，该菌的降解效果整体最好。该菌是一种降解抗生素及耐受抗生素能力均很强的菌株，对磺胺甲恶唑适应性强；在磺胺甲恶唑污染环境的生物修复中具有很好的应用前景。附图说明图1是paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在固体营养培养基上生长的的群落形态。图2是利用最小进化法构建的paenarthrobacternicotinovoranssmk-1和其相关菌的基于16srrna基因序列的系统发育树，图中仅展示了自展值大于90％的结果，比例尺0.002代表每个核苷酸的替换率，smk-1代表paenarthrobacternicotinovoranssmk-1。图3是不同生长温度对paenarthrobacternicotinovoranssmk-1的影响。图4是不同生长ph对paenarthrobacternicotinovoranssmk-1的影响。图5是不同耐盐度对paenarthrobacternicotinovoranssmk-1的影响。图6是paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在含不同浓度抗生素、ph为7的无机盐培养基中生长曲线，磺胺甲恶唑的初始浓度为1～100mg·l-1。图7是paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在含不同浓度磺胺甲恶唑、不同ph的无机盐培养基中培养7天后磺胺甲恶唑降解情况，磺胺甲恶唑的初始浓度为1～100mg·l-1，ph为4～9。图8是paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在含不同浓度磺胺甲恶唑、ph为6的无机盐培养基中磺胺甲恶唑降解情况，磺胺甲恶唑的初始浓度为1～100mg·l-1。图9是paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在含不同浓度磺胺甲恶唑、ph为7的无机盐培养基中磺胺甲恶唑降解情况，磺胺甲恶唑的初始浓度为1～100mg·l-1。图10是paenarthrobacternicotinovoranssmk-1在含不同浓度磺胺甲恶唑、ph为8的无机盐培养基中磺胺甲恶唑降解情况，磺胺甲恶唑的初始浓度为1～100mg·l-1。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。实施例11材料1.1样品来源该菌是从广州新塘污水处理厂曝气池采集活性污泥，进行长期驯化通过多次筛选和分离纯化得到高效的、能降解高浓度磺胺甲恶唑的抗生素降解菌smk-1。1.2培养基1.2.1无机盐培养基无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养和纯菌条件下磺胺甲恶唑降解实验。该无机盐培养基配方见表1(不含磺胺甲恶唑)。表1无机盐培养基配方试剂名称浓度nacl0.5g/lnh4cl1g/lna2hpo4·12h2o8.5g/lkh2po43g/lmgso4·7h2o0.2g/lcacl214.7mg/lcuso40.4mg/lmnso4·h2o4.0mg/lznso4·7h2o4.0mg/lh3bo35.0mg/lh2moo4·2h2o1.6mg/lfecl3·6h2o2.0mg/l1.2.2营养培养基营养培养基(lb培养基)用于细菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体营养培养基，仅需在原有液体营养培养基配方的基础上增添1.5～2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基ph均调节至7.2。表2营养培养基成分试剂名称浓度胰化蛋白胨10g/l酵母提取物5g/lnacl10g/l2方法2.1菌株的驯化、筛选和分离将采集的活性污泥加入到无机盐培养基中，以浓度为100mg/l的抗生素磺胺甲恶唑作为降解的底物(即无机盐培养基中含有磺胺甲恶唑)，放置于30℃培养箱中避光震荡培养。利用以磺胺甲恶唑为唯一碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周期；取10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜以磺胺甲恶唑为碳源的无机盐培养基中并重复上述富集过程，如此重复三次。将上述获得的第四代富集培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基分离。将涂布好的样品置于原培养温度条件下培养，经过48小时左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、透明度等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到1株对磺胺甲恶唑有高效降解性能的菌株smk-1。挑取纯化后的smk-1单菌落到相应液体营养培养基中培养至对数期，将菌液和无菌的甘油混合分装至无菌的2ml冻存管中(甘油浓度为25％)，放置于-80℃长期保存。2.2菌株smk-1的形态特征smk-1是一株从活性污泥中分离出的细菌，经活化以后，在30℃有氧的条件下在固体营养培养基制成的平板上生长48h后，能形成能形成直径为0.3～2.5mm淡黄色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的、不透明、边缘整齐、无芽孢、无鞭毛的菌落，其菌落图见图1。2.3菌株smk-1的分子生物学特性鉴定分子生物学特性鉴定主要包括dnag+c含量测定、所分离的菌株smk-1测序及系统发育树的构建，这些实验都能为细菌在分类学上的定位提供科学证据。2.3.1dnag+c含量测定dnag+c含量的测定主要运用到高效液相色谱法，具体步骤参考mesbahetal.(1989)的报告。测定得到smk-1的dnag+c含量为57.0％。2.3.2测序及系统发育树的构建在进行测序和构建系统发育树之前，首先需要提取细菌的dna(实验使用的细菌基因组dna快速提取试剂盒来自北京艾德莱生物科技有限公司)。为了对细菌的分类学进行研究，通常需要扩增16srrna基因以及构建系统发育树，扩增的基因为原核生物中编码rrna所组成部分中的一段dna，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定细菌。聚合酶链式反应(pcr)主要是用来扩增不同的基因片段，pcr需要不同的引物(正向和反向引物分别为27f和1492r；bakeretal.,2003)，pcr扩增反应的体系：正向引物27f(10mmol/l)0.5μl，反向引物1492r(10mmol/l)0.5μl，taq酶12.5μl，dna组模板1μl，去离子水10.5μl。pcr扩增反应条件：95℃条件下变性，55℃的条件下退火，72℃的条件下延伸，这个过程循环30次，72℃的条件下延伸5min，pcr反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用1％～1.5％的琼脂糖并加入核酸染色剂配制成凝胶块，在凝胶块中加入pcr产物和包含各种长度片段的dna标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入tae缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定pcr产物扩增反应成功。然后将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。通过将pcr产物进行基因测序得到的一个长为1410bp的smk-116srrna基因序列，其序列如序列表中的seqidno：1所示。将测序所得的细菌smk-1的16srrna基因序列上传到ncbi上，此网站会将提交的序列与已被公认种的典型菌株的16srrna基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的16srrna基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株smk-1具有差异，从而来鉴定分离的菌株smk-1。构建系统发育树利用mega5.05程序(tamuraetal.,2011)，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常常设定为重复1000次计算(felsensteinetal.,1985)。利用smk-1的16srrna基因序列和与其相似度较高的16srrna基因序列制作系统发育树，从而获得smk-1的16srrna基因与其相似性较高的16srrna基因之间的同源性结果。采用最小进化法构建的系统发育树见图2，结果表明smk-1与paenarthrobacternicotinovoransdsm420同源性最高，且该菌在分子生物学层面上是属于paenarthrobacter同一个属的不同株种系。因此，将该菌株smk-1命名为paenarthrobacternicotinovoranssmk-1。所述的paenarthrobacternicotinovoranssmk-1的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号：gdmccno：61613，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年4月21日。2.4菌株smk-1的生长条件生长温度的测定：配置菌株smk-1生长所需的液体营养培养基，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌株smk-1接入到培养基内(实验组)，用不接种细菌的培养基做为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出smk-1可生长温度和最适生长温度范围。测试温度如下：25℃、30℃、37℃、40℃。结果如图3所示，在液体营养培养基中，菌株smk-1能够在25～40℃的温度条件下生长，最适生长温度为该菌的富集温度30℃。生长ph的测定：配置菌株smk-1生长所需的液体营养培养基，用如下缓冲体系调节培养液的ph，ph4.0～5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；ph6.0～8.0，0.1mol/lnaoh和0.1mol/lkh2po4；ph9.0～10.0，0.1mol/lnahco3和0.1mol/lna2co3；ph11.0，0.1mol/lnaoh和0.05mol/lna2hpo4(zhangetal.,2009)。将菌株smk-1接入到液体营养培养基内，每个ph做三个重复，用不接种细菌的培养基作为对照，将液体营养培养基放入新菌生长最适温度30℃下培养，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出菌株smk-1可生长ph和最适生长ph范围。测试的ph如下：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。结果如图4所示，菌株smk-1能够在5.0～9.0的ph条件下生长，最适生长ph为7.0。盐浓度耐受：配置菌株smk-1生长所需的液体营养培养基，调节培养基的盐浓度。将活化好的菌株smk-1接入到已灭菌的液体营养培养基内，每个盐浓度做三个重复，用不接菌的培养基作为对照，将液体营养培养基放置在smk-1生长最适条件(30℃、ph7.0)下培养，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的情况时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最好得到新菌所能耐受的盐浓度范围。测试盐浓度(质量分数)如下：0％、1％、3％、5％、7％、10％。结果如图5所示，菌株smk-1的盐耐受能力较弱，能在盐浓度为0％到5％的条件下生长，且在0％的盐浓度下长势最好。2.5不同磺胺甲恶唑浓度条件下菌株smk-1的生长及降解根据以上实验结果，确定菌株的最佳生长条件为温度30℃，ph7.0，不添加nacl。菌株smk-1在不同抗生素浓度、不同ph中的生长及降解实验均在这个条件(温度30℃、不添加nacl)下进行。将处于对数生长期的菌株smk-1按10％(v/v)的接种量分别接种于含有初始磺胺甲恶唑浓度为1、10、30、50、100mg·l-1的无机盐培养基中，ph如下：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，振荡培养，并做平行实验3次。磺胺甲恶唑浓度的测定采用紫外分光光度法，即将收集的菌液以10000rpm离心1min，菌液过0.22μm有机滤膜，进行波长扫描找到最适宜的波长，最终于255nm波长处测定吸光度，计算其降解率，以上所有实验步骤都尽量避光。微生物细胞浓度的测定采用光电比浊法，以od来表示，即波长为600nm时紫外光透过所测定菌液样品的光密度值。菌株smk-1的生长曲线如图6所示。结果显示，smk-1能够在高浓度磺胺甲恶唑条件下生长。菌株smk-1对磺胺甲恶唑降解情况如图7～10所示，其中，图7为7天磺胺甲恶唑的降解情况，图8～10分别为ph为6、7、8情况下菌株对磺胺甲恶唑的降解情况。根据紫外分光光度法测定并分析得出菌株smk-1在抗生素初始浓度为30mg·l-1、ph6～8的无机盐培养基培养5天后，降解率均可达25％以上，培养10天时，降解率均可达45％以上；在磺胺甲恶唑的初始浓度在100mg·l-1、ph6～7的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达到20％以上，在100mg·l-1、ph8的无机盐培养基培养10天后，降解率均可达到73％以上；该菌是一种降解抗生素及耐受抗生素能力均很强的菌株，对磺胺甲恶唑适应性强；在磺胺甲恶唑污染环境的生物修复中具有很好的应用前景。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一种磺胺类抗生素降解菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1410<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cttacacatgcaagtcgaacgatgatcccagcttgctgggggattagtggcgaacgggtg60agtaacacgtgagtaacctgcccttgactctgggataagcctgggaaactgggtctaata120ccggatatgactcctcatcgcatggtggggggtggaaagcttttgtggttttggatggac180tcgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccgg240cctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggca300gcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatg360acggccttcgggttgtaaacctctttcagtagggaagaagcgtaagtgacggtacctgca420gaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgtta480tccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgctgtgaaagacc540ggggctcaactccggttctgcagtgggtacgggcagactagagtgcagtaggggagactg600gaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggca660ggtctctgggctgtaactgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaacaggattagat720accctggtagtccatgccgtaaacgttgggcactaggtgtgggggacattccacgttttc780cgcgccgtagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaact840caaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacg900cgaagaaccttaccaaggcttgacatgaaccggaaagacctggaaacaggtgccccgctt960gcggtcggtttacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtta1020agtcccgcaacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcggttcggccggggactcata1080ggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgcccctt1140atgtcttgggcttcacgcatgctacaatggccggtacaaagggttgcgatactgtgaggt1200ggagctaatcccaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatga1260agtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggcctt1320gtacacaccgcccgtcaagtcacgaaagttggtaacacccgaagccggtggcctaaccct1380tgtgggggagccgtcgaaggtgacggacta1410当前第1页12