重组人源胶原蛋白及其人造角膜的制作方法

1.本发明属于生物医药与生物材料技术领域，更具体地，本发明涉及重组人源胶原蛋白及其人造眼角膜。


背景技术：

2.胶原蛋白是动物体内含量最丰富的一类结构蛋白质。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使结缔组织具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有良好的生物相容性与可生物降解的特性。基于这些特性，胶原蛋白在烧创伤修复、眼角膜疾病治疗、创面止血、药物传递与缓释、矫形、保健、美容等医疗卫生领域有广泛应有。常见的胶原蛋白是从牛骨、牛皮、鱼鳞、鱼皮、猪皮等动物组织中分离提取而来，存在动物病毒隐患、应用于人体时会产生异体或异种的排异反应且分子量不确定、分布范围广等缺点和不足。本发明人的前期研究成果很好的克服了这些缺陷：利用基因重组技术生产的人源胶原蛋白取代天然胶原。该重组胶原是以iii型胶原为模板，体外构建六串联序列并连入ppic9k形成类人胶原蛋白基因六串联体表达载体ppic9kg6。将该表达载体导入毕赤酵母后进行高密度发酵，并通过分离纯化，得到高纯度重组ⅲ型人源胶原蛋白rhc，作为本发明的首选原料。
3.目前全球每年有超过400,000例角膜致盲病例，原因是外伤或感染造成的角膜疤痕，这类病例可通过手术植入的生物工程角膜进行治疗。治疗方法包括人供体角膜移植或使用从转基因猪身上采集的角膜组织。然而，人供体角膜严重短缺，猪角膜存在光学透明度和耐久性不足的问题，这两种方法都需要额外的免疫抑制药物来防止移植排斥。人iii型胶原是一种存在于正常人角膜中的关键结构蛋白。利用人iii型胶原制成的生物合成角膜光学透明，可替代上述治疗方法，并无需使用免疫抑制药物。
4.壳聚糖，也称几丁质，是甲壳素的去乙酰化产物，甲壳素是节肢动物和真菌中最主要的结构生物高分子。它存在于甲壳类动物、真菌和酵母的细胞壁以及昆虫的外骨骼中。壳聚糖主要由螃蟹、虾或其他海洋甲壳类动物的壳中提取。壳聚糖拥有良好的生物相容性、降解速率以及一定的抗菌和创伤愈合作用，此外壳聚糖还被证明有优良的凝血性能和组织修复功能，因此壳聚糖被广泛地应用于止血、创伤敷料、骨修复和神经修复等领域。其中，壳聚糖的羧甲基产物(cmcs)具备良好的水溶性，在制备过程中可以不涉及有机酸溶剂，因此作为本发明的首选原料。
5.水凝胶作为一种不溶于水但有很强亲水性的柔性高分子材料，其分子具有独特的三维立体网络状构型并保持一定的形状。水凝胶作为一类高保水、生物相容性佳的仿生生物功能材料，长期以来一直用于组织工程支架材料的开发。而眼角膜属于软组织，同时大量含水，胶原基水凝胶的特性与角膜ecm高度相似，并具有较高的生物相容性，因此胶原基水凝胶是一种作为角膜替换、角膜修复、软性角膜接触镜(隐形眼镜)、硬性角膜接触镜(隐形眼镜)、角膜细胞体外培养及眼部缓释药物载体的优选生物材料。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供新的重组胶原蛋白和新的角膜。另外，本发明还提供它们的制备方法和应用等。
7.具体而言，在第一方面，本发明提供了重组人源胶原蛋白，其氨基酸序列
8.a)如序列表中的seq id no：1所示；或
9.b)是对序列表中的seq id no：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
10.在第二方面，本发明提供了核酸分子，其编码本发明第一方面的重组人源胶原蛋白。
11.在第三方面，本发明提供了载体，其含有本发明第二方面的核酸分子。载体优选是表达载体，更优选是酵母表达载体。
12.在第四方面，本发明提供了宿主细胞，其含有本发明第二方面的核酸分子。宿主细胞，其含有本发明第二方面的核酸分子。宿主细胞可以通过转染或转导本发明第三方面的载体来制备。宿主细胞优选是酵母细胞。
13.在第五方面，本发明提供了制备本发明第一方面的重组人源胶原蛋白的方法，其包括，用本发明第四方面的宿主细胞表达本发明第一方面的重组人源胶原蛋白，然后分离纯化所述重组人源胶原蛋白。
14.在第六方面，本发明提供了人造角膜，其由包括如下步骤的方法制备：
15.(1)分别配制重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液、壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸或水溶液、edc与nhs水溶液和β
‑
甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液；
16.(2)将重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液与壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸水或水溶液混合均匀，制得第一混合溶液；
17.(3)将edc与nhs水溶液、与第一混合溶液混合均匀，任选加入光引发剂，制得第二混合溶液；
18.(4)将β
‑
甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液与第二混合溶液混合均匀，并置于模具内固化成型，得到人造角膜；和
19.(5)任选将人造角膜取出并保存于磷酸盐缓冲液中。
20.在本文中，“任选”具有其词典意义，表明可以选择，也可以不选。例如，可以不加入光引发剂，则步骤(3)为：将edc与nhs水溶液、与第一混合溶液混合均匀，制得第二混合溶液。
21.在本文中，如未特别指出，所有制备操作均在室温无菌环境下进行，所需原料、试剂和仪器也是无菌的。
22.在本文中，所使用的重组胶原蛋白的类型可为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、
ⅴ
、
ⅵ
、
ⅶ
、
ⅸ
、
ⅹ
、
ⅺ
、
ⅻ
与g
‑
x
‑
y重复序列型或其他小分子量胶原；重组胶原蛋白可来自微生物表达系统(大肠杆菌、链球菌、汉森酵母、酿酒酵母、毕赤酵母等)、哺乳动物表达系统(转基因鼠、人胚肾上皮细胞等)、昆虫表达系统(昆虫细胞、转基因蚕等)和植物表达系统(转基因烟草、大麦种子、玉米等)；所使用的重组胶原蛋白分子量为2～500kd。
23.优选在本发明第六方面的人造角膜中，重组胶原蛋白优选为重组人源胶原蛋白。例如，本发明的重组人源胶原蛋白可以是中国专利zl 200610098297.5所公开的方法获得
的重组人源胶原蛋白，更优选的是，通过中国专利zl201110327865.5提供的高密度发酵和纯化方法，利用通过不同重复数同向串联基因重组质粒所构建的巴氏毕赤酵母基因工程菌(菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.5021)而生产的重组人源胶原蛋白。人源胶原蛋白比起动物(尤其是非哺乳动物)胶原蛋白而言，对人体的使用安全性更为可靠。
24.在本文中，成型方式包括静置成型、离心浇铸、铸模成型(模压)法、3d打印等。
25.优选在本发明第六方面的人造角膜中，甲基丙烯酸化重组胶原蛋白由包括如下步骤的方法制备：
26.(a)将重组胶原蛋白溶于磷酸缓冲液中，制得胶原蛋白磷酸盐溶液；
27.(b)向胶原蛋白磷酸盐溶液加入甲基丙烯酸酐，进行反应，优选反应45～75分钟；
28.(c)将步骤(b)得到的反应液离心，取上清液稀释并透析；和
29.(d)任选进行冷冻干燥。
30.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(1)中，重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白的浓度为1～30％(w/v)，优选为3～25％(w/v)。
31.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(1)中，壳聚糖或羧甲基壳聚糖的浓度为0.5～6％(w/v)，优选为1～4％(w/v)。
32.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(1)中，乙酸的浓度为0.05～1.0％(v/v)，优选为0.1～0.5％(v/v)。
33.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(1)中，edc与nhs的总浓度为1～20％(w/v)，优选为3～12％(w/v)。
34.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(1)中，edc与nhs的重量比为5～10：10～15，优选为6～8：12～14。
35.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(1)中，β
‑
甘油磷酸钠的浓度为10～60％(w/v)，优选为25～55％(w/v)。
36.也优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(1)中，碳酸氢钠的浓度为2～10％(w/v)，优选为3～6％(w/v)。
37.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(2)中，重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液与壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸水或水溶液的体积比为1：0.1～1：5，优选为1:0.2～1:5。
38.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(3)中，edc与nhs水溶液与第一混合溶液的体积比为1:1～1:30，优选为1:5～1:15。
39.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(3)中，光引发剂为2
‑
羟基
‑4‑
(2
‑
羟乙氧基)
‑2‑
甲基苯丙酮(i2959)或苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(lap)。
40.也优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(3)中，光引发剂的浓度为0～2％(w/v)，优选为0.2～0.5％(w/v)。
41.优选在本发明第六方面的人造角膜中，在步骤(4)中，β
‑
甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液与第二混合溶液的体积比为1：1～1：10，优选为1:2～1:5。
42.在第七方面，本发明提供了本发明第六方面的人造角膜的制备方法，其包括如下步骤：
43.(1)分别配制重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液、壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸或水溶液、edc与nhs水溶液和β
‑
甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液；
44.(2)将重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液与壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸水或水溶液混合均匀，制得第一混合溶液；
45.(3)将edc与nhs水溶液、与第一混合溶液混合均匀，任选加入光引发剂，制得第二混合溶液；
46.(4)将β
‑
甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液与第二混合溶液混合均匀，并置于模具内固化成型，得到人造角膜；和
47.(5)任选将人造角膜取出并保存于磷酸盐缓冲液中。
48.优选本发明第七方面的制备方法在步骤(1)前还包括制备甲基丙烯酸化重组胶原蛋白的方法，其包括如下步骤：
49.(a)将重组胶原蛋白溶于磷酸缓冲液中，制得胶原蛋白磷酸盐溶液；
50.(b)向胶原蛋白磷酸盐溶液加入甲基丙烯酸酐，进行反应，优选反应45～75分钟；
51.(c)将步骤(b)得到的反应液离心，取上清液稀释并透析；和
52.(d)任选进行冷冻干燥。
53.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(1)中，重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白的浓度为1～30％(w/v)，优选为3～25％(w/v)。
54.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(1)中，壳聚糖或羧甲基壳聚糖的浓度为0.5～6％(w/v)，优选为1～4％(w/v)。
55.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(1)中，乙酸的浓度为0.05～1.0％(v/v)，优选为0.1～0.5％(v/v)。
56.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(1)中，edc与nhs的总浓度为1～20％(w/v)，优选为3～12％(w/v)。
57.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(1)中，edc与nhs的重量比为5～10：10～15，优选为6～8：12～14。
58.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(1)中，β
‑
甘油磷酸钠的浓度为10～60％(w/v)，优选为25～55％(w/v)。
59.也优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(1)中，碳酸氢钠的浓度为2～10％(w/v)，优选为3～6％(w/v)。
60.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(2)中，重组胶原蛋白或甲基丙烯酸化重组胶原蛋白水溶液与壳聚糖或羧甲基壳聚糖的乙酸水或水溶液的体积比为1：0.1～1：5，优选为1:0.2～1:5。
61.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(3)中，edc与nhs水溶液与第一混合溶液的体积比为1:1～1:30，优选为1:5～1:15。
62.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(3)中，光引发剂为i2959或lap。
63.也优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(3)中，光引发剂的浓度为0～2％(w/v)，优选为0.2～0.5％(w/v)。
64.优选在本发明第七方面的制备方法中，在步骤(4)中，β
‑
甘油磷酸钠与碳酸氢钠水溶液与第二混合溶液的体积比为1：1～1：10，优选为1:2～1:5。
65.在第七方面，本发明提供了本发明第六方面的人造角膜在制备角膜替换制品、角膜修复制品、软性角膜接触镜、硬性角膜接触镜、角膜细胞体外培养制品或眼部缓释药物载体中的应用。
66.本发明的有益效果在于，本发明的人造角膜工艺无需剧烈条件和叫不安全的原料、试剂，生物相容性好，机械强度适中、适合运用于角膜，透光率高、理化性能良好，不含杂质，成形性良好，可以用于角膜替换、角膜修复支架、适合配戴的角膜接触镜(隐形眼镜)，角膜细胞体外培养及眼部药物缓释载体等相关领域的应用。
67.为了便于理解，下面将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别说明的是，具体实施例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然，本领域及相关领域的普通技术人员均可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变或丰富应用领域，这些修正和改变或在其他领域的应用也纳入本发明的范围。
附图说明
68.图1：a为甲基丙烯酸化重组胶原蛋白/羧甲基壳聚糖(cmcs)制得的人造角膜实物图；b为重组胶原蛋白/壳聚糖制得的人造角膜实物图。
69.图2：本发明重组胶原蛋白/壳聚糖制备的人造角膜在可见光(波长380nm至780nm)范围的透光率统计图，在569nm处，透光率为83.34％；在780nm处，透光率为100％。证明本发明重组胶原蛋白/壳聚糖制备的人造角膜透光性能良好。
70.图3：为接种于重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜表面的小鼠胚胎成纤维细胞(nih
‑
3t3)，经培养24小时图，所示成纤维细胞紧密附着于人造角膜表面且细胞形态正常。
71.图4：a为甲基丙烯酸化重组胶原蛋白/羧甲基壳聚糖人造角膜埋于大鼠皮下14天h&e染色图，可见连续上皮覆盖，无明显创面可见。结缔组织结构完整，无血管新生无炎细胞浸润，可见成熟皮肤附属器官。b为甲基丙烯酸化重组胶原蛋白/羧甲基壳聚糖人造角膜包埋于大鼠皮下14天masson染色图，皮肤表面完整无缺损，masson阳性染色质地紧密，分层分布。证明本发明人造角膜在动物体内具有良好的生物相容性，降解产物无毒副作用。
具体实施方式
72.以下实施例中所用到的试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售产品。重组胶原蛋白为根据中国专利zl 201110327865.5所制备的重组人源胶原蛋白，无菌水为自制高温高压灭菌去离子水。以下实施例中所涉及的实验操作方法如无特殊说明，均为室温常压下在无菌条件下实施的。
73.实施例1重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜的制备1
74.将500mg重组人源胶原蛋白加入10ml无菌水中，搅拌10分钟使其完全溶解，配制成5％(w/v)重组人源胶原蛋白水溶液；将200mg羧甲基壳聚糖(cmcs)溶解于10ml无菌水中，搅拌20分钟使其完全溶解，配制成2％(w/v)的壳聚糖水溶液；按1：1体积比(v/v)均匀混合配制的重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液；将35mg edc与65mg nhs充分溶解于2ml无菌水中，制成5％(w/v)的edc/nhs交联液；将0.5gβ
‑
甘油磷酸钠与0.05g碳酸氢钠溶于1ml无菌水中，制得β
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液；取500μl重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液置于1.5ml离心管中，
添加50μledc/nhs交联液与100μlβ
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液，并充分混匀；将配置好的溶液注入人造角膜模具内，每个模具加注100～150μl，静置于37℃培养箱中2小时待其完全成胶(成型)；将模具中已成型的重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜取出，经紫外灯光照40分钟灭菌后保存于磷酸盐缓冲液中。由此制备的人造角膜如图1b所示。
75.实施例2重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜的制备2
76.将2000mg重组人源胶原蛋白加入10ml无菌水中，搅拌30分钟使其完全溶解，配制成20％(w/v)重组人源胶原蛋白水溶液；将150mg羧甲基壳聚糖(cmcs)溶解于10ml无菌水中，搅拌20分钟使其完全溶解，配制成1.5％(w/v)的壳聚糖水溶液；按1：1体积比(v/v)均匀混合配制的重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液；将70mg edc与130mgnhs充分溶解于2ml无菌水中，制成10％(w/v)的edc/nhs交联液；将0.3gβ
‑
甘油磷酸钠与0.06碳酸氢钠溶于1ml无菌水中，制得β
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液；取500μl重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液置于1.5ml离心管中，添加50μl edc/nhs交联液与200μlβ
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液，并充分混匀；将配置好的溶液注入人造角膜模具内，每个模具加注100～150μl，静置于37℃培养箱中1.5小时待其完全成胶(成型)；将模具中已成型的重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜取出，经紫外灯光照40分钟灭菌后保存于磷酸盐缓冲液中。
77.实施例3重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜的制备3
78.将500mg重组人源胶原蛋白加入10ml无菌水中，搅拌10分钟使其完全溶解，配制成5％(w/v)重组人源胶原蛋白水溶液；将200mg壳聚糖溶解于10ml0.2％(v/v)乙酸溶液中，搅拌20分钟使其完全溶解，配制成2％(w/v)的壳聚糖溶液；按1：1体积比(v/v)均匀混合配制的重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液；将35mg edc与65mgnhs充分溶解于2ml无菌水中，制成5％(w/v)的edc/nhs交联液；将0.5gβ
‑
甘油磷酸钠与0.05碳酸氢钠溶于1ml无菌水中，制得β
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液；取500μl重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液置于1.5ml离心管中，添加50μledc/nhs交联液与100μlβ
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液并充分混匀；将配置好的溶液注入人造角膜模具内，每个模具加注100～150μl，静置于37℃培养箱中2.5小时待其完全成胶(成型)；将模具中已成型的重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜取出，每片人造角膜浸泡于10ml磷酸盐缓冲液中，每12小时换液一次，连续操作5天；紫外灯光照40分钟灭菌后保存于磷酸盐缓冲液中。
79.实施例4重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜的制备4
80.将2000mg重组人源胶原蛋白加入10ml无菌水中，搅拌10分钟使其完全溶解，配制成20％(w/v)重组人源胶原蛋白水溶液；将300mg壳聚糖溶解于10ml0.5％(v/v)乙酸溶液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配制成3％(w/v)的壳聚糖溶液；按1：1.5体积比(v/v)均匀混合配制的重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液；将35mg edc与65mgnhs充分溶解于2ml无菌水中，制成5％(w/v)的edc交联液；将0.5gβ
‑
甘油磷酸钠与0.05碳酸氢钠溶于1ml无菌水中，制得β
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液；取500μl重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液置于1.5ml离心管中，添加100μl edc/nhs交联液与200μlβ
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液，并充分混匀；将配置好的溶液注入人造角膜模具内，每个模具加注100～150μl，静置于37℃培养箱中2小时待其完全成胶(成型)；将模具中已成型的重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜取出，每片人造角膜浸泡于10ml磷酸盐缓冲液中，每12小时换液一次，连续操作7天；紫外灯光照40分钟灭菌后保存于磷酸盐缓冲液中。
81.实施例5重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜的制备5
82.将1g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成10％(w/v)胶原蛋白磷酸盐溶液。将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，搅拌反应60分钟，将反应后的溶液离心后取上清液加去离子水稀释2倍，然后把稀释后的溶液加入到36mm透析袋(mw:14000)中，室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水。透析结束后将溶液ph值调整为7，在
‑
80℃下冷冻，再置于真空冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司，型号：lgj
‑
10d，参照其厂商说明条件进行冷冻干燥)中冷冻干燥，形成冻干的甲基丙烯酸化重组胶原蛋白。
83.将500mg甲基丙烯酸化重组胶原蛋白加入10ml无菌水中，搅拌10分钟使其完全溶解，配制成5％(w/v)重组人源胶原蛋白水溶液；将200mg羧甲基壳聚糖(cmcs)溶解于10ml无菌水中，搅拌20分钟使其完全溶解，配制成2％(w/v)的羧甲基壳聚糖水溶液；按1：1体积比(v/v)均匀混合配制的甲基丙烯酸化重组胶原蛋白羧甲基壳聚糖混合溶液；将35mg edc与65mg nhs充分溶解于2ml无菌水中，制成5％(w/v)的edc/nhs交联液；将0.5gβ
‑
甘油磷酸钠与0.05g碳酸氢钠溶于1ml无菌水中，制得β
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液；取500μl重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液置于1.5ml离心管中，添加光引发剂lap0.005g，50μledc/nhs交联液与100μlβ
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液，并充分混匀；将配置好的溶液注入人造角膜模具内，每个模具加注100～150μl，使用405nm波长光源照射30秒，之后静置于37℃培养箱中1小时；将模具中已成型的甲基丙烯酸化重组胶原蛋白/羧甲基壳聚糖人造角膜取出，经紫外灯光照40分钟灭菌后保存于磷酸盐缓冲液中。由此制备的人造角膜如图1a所示。
84.实施例6重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜的制备6
85.将2g重组人源胶原蛋白加入10ml磷酸缓冲液中，搅拌30分钟使其完全溶解，配置成20％(w/v)胶原蛋白磷酸盐溶液。将0.6ml甲基丙烯酸酐在2分钟内加入至胶原蛋白磷酸盐溶液，搅拌反应120分钟，将反应后的溶液离心后取上清液加去离子水稀释2倍，然后把稀释后的溶液加入到36mm透析袋(mw:14000)中，室温下去离子水条件下透析7天，每8小时更换去离子水。透析结束后将溶液ph值调整为7，在
‑
80℃下冷冻，再置于真空冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司，型号：lgj
‑
10d，参照其厂商说明条件进行冷冻干燥)中冷冻干燥，形成冻干的甲基丙烯酸化重组胶原蛋白。
86.将1g甲基丙烯酸化重组胶原蛋白加入10ml无菌水中，搅拌10分钟使其完全溶解，配制成10％(w/v)重组人源胶原蛋白水溶液；将200mg羧甲基壳聚糖(cmcs)溶解于10ml无菌水中，搅拌20分钟使其完全溶解，配制成2％(w/v)的羧甲基壳聚糖水溶液；按1：1体积比(v/v)均匀混合配制的甲基丙烯酸化重组胶原蛋白羧甲基壳聚糖混合溶液；将35mg edc与65mg nhs充分溶解于2ml无菌水中，制成5％(w/v)的edc/nhs交联液；将0.5gβ
‑
甘油磷酸钠与0.05g碳酸氢钠溶于1ml无菌水中，制得β
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液；取500μl重组胶原蛋白壳聚糖混合溶液置于1.5ml离心管中，添加光引发剂lap 0.01g，50μledc/nhs交联液与100μlβ
‑
甘油磷酸钠碳酸氢钠溶液，并充分混匀；将配置好的溶液作为3d生物打印墨水进行3d打印，打印过程中以405nm波长的光源交联固化，之后静置于37℃培养箱中0.5小时；将已成型的甲基丙烯酸化重组胶原蛋白/羧甲基壳聚糖人造角膜取出，经紫外灯光照30分钟灭菌后保存于磷酸盐缓冲液中。
87.实施例7重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜透光性能测试
88.可见光波长范围在380nm至780nm之间。使用紫外可见分光光度计对本发明所得人造角膜在可见光波长范围内进行透光性测试。将实施例1所得重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜1置于紫外可见分光光度计(美国thermo fisher evolution220，参照其厂商说明书进行相关操作)内进行测试，测得在特定波长的吸光度a。之后根据吸光度a与透光率t之间的关系式a＝
‑
lg进行换算，从而得到在特定波长的透光率。
89.结果如图2所示，本发明重组胶原蛋白/壳聚糖制备的人造角膜在380nm至780nm范围内，在569nm处，透光率为83.34％；在780nm处，透光率为100％。证明本发明重组胶原蛋白/壳聚糖制备的人造角膜透光性能良好。
90.实施例8成纤维细胞在重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜上培养方法
91.一种小鼠胚胎成纤维细胞nih
‑
3t3培养基，培养基中含有以下组分：每100ml完全培养基含有15ml胎牛血清、1ml青链霉素混合液(100
×
)、84ml dmem。
92.用上述培养基将小鼠胚胎成纤维细胞重悬。
93.将重悬的小鼠胚胎成纤维细胞接种于12格孔板中固化后的重组胶原蛋白/壳聚糖人造角膜1表面，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，隔天换培养液，并在荧光倒置显微镜(日本olympus，参照其厂商说明条件进行相关操作)下观察细胞的生长状态。
94.在培养24小时，将载有小鼠胚胎成纤维细胞的人造角膜于荧光倒置显微镜下观察。
95.结果如附图3所示。结果显示小鼠胚胎成纤维细胞适应人造角膜水凝胶的环境，正常增殖、细胞形态良好且基本无细胞毒性。
96.实施例9
97.以sd大鼠为动物实验模型，大鼠经10％水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧固定于手术板上。常规备皮消毒，在鼠背开1cm左右切口，将实施例5制得的甲基丙烯酸化重组胶原蛋白/羧甲基壳聚糖人造角膜样品塞入，观察无异常后缝合皮肤。模型制备完成后放入饲养笼自然苏醒。大鼠饲养环境条件符合中华人民共和国国标gb14925
‑
2010，温度：室温25℃，相对湿度40～70％，人工照明，12小时明暗交替(07点开灯，19点关灯)，喂养co60辐照实验鼠维持饲料。
98.动物模型制备后第14天对动物进行处死，取包埋位置皮肤。样本取材完成后进行后期h&e与masson检测。
99.检测结果如图4所示。a为样品包埋于大鼠皮下14天h&e染色图，可见连续上皮覆盖，无明显创面可见。结缔组织结构完整，无血管新生无炎细胞浸润。可见成熟皮肤附属器官。b为样品包埋于大鼠皮下14天masson染色图，皮肤表面完整无缺损，masson阳性染色质地紧密，分层分布。证明本发明人造角膜在动物体内具有良好的生物相容性，降解产物无毒副作用。
100.101.102.103.