猪精液品质性状关联的C7H15orf39基因SNP分子标记及应用

猪精液品质性状关联的c7h15orf39基因snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明属于动物分子标记筛选领域，具体涉及一种猪精液品质性状关联的c7h15orf39基因snp分子标记及应用。该snp标记可用于非诊断目的的猪精子活力和精子畸形率性状的标记关联分析。


背景技术：

2.养猪生产中，公猪精液品质直接影响其繁殖效率,是衡量公猪生产效益的重要指标之一。提高公猪精液品质对规模化养猪生产和公猪的遗传改良具有重要意义。公猪精液品质主要包括精液量、精子浓度、精子活力和精子畸形率等四个指标。公猪的精液品质与精子活力的强弱和精子畸形率的高低密切相关。一般认为，完整精子的正常运动能力是保障精子受精成功的基础条件。因此，改良公猪的精液品质有利于提升规模化养殖的经济效益，而标记辅助选择是改善公猪精液品质的有效方法。
3.chromosome 7 c15orf39 homolog(c7h15orf39)是一个功能尚未被发现的基因，其人类同源物c15orf39的功能也未知，目前尚未有有关改基因的文献报道。ncbi表明，人类c15orf39基因在睾丸组织中表达量最高。突变位点使密码子编码asn而不是以前的asp，蛋白质结构预测软件预测该位点突变的sift为0，由于蛋白质的结构决定其功能，因此该位点的突变对c15orf39蛋白的功能产生了较大影响。本发明通过对精液品质好的猪和精液品质差的猪的睾丸样本进行rna测序并通过star与gatk软件检测发现了该snp位点，利用sas软件对该snp位点与猪精液品质性状进行了关联性分析，结果表明所述的snp与猪精液量、精子密度、精子活力和精子畸形率显著相关。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于获得一种检测猪精液品质性状关联的分子标记，根据测序结果，寻找c7h15orf39基因的突变位点，检测了该基因的多态性，为猪的标记辅助选择提供一种新的标记资源和选择方法。
5.具体地，本发明的技术方案如下所述：
6.本发明获得了一种猪精液品质性状的分子标记，它是基于以三头猪精液品质好的和三头猪精液品质差的杜洛克品种猪睾丸组织rna测序对比产生的结果，在测序结果里，精液品质好的杜洛克相对于精液品质差的杜洛克存在c7h15orf39基因上存在多态位点，其外显子ensssce00000309970上的g.58385473处碱基处(即本发明克隆的序列的281位的等位基因替换)存在一个等位基因g/t的突变，该突变导致pcr-taqi-rflp多态性。
7.具体地，申请人提供了一种snp分子标记在猪精液品质性状关联分析中的应用，所述猪品种为杜洛克，所述猪精液品质性状为精液量、精子密度、精子活力和和精子畸形率，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：
8.ctaccgcccacccacagaaagctccgagaaagtacaggattctggccccgtggagctcctgcccttcagtccgcaggctcattcctacccaggcccgccattggcggcacccaagcctgtctaccgcaaccctctgtgttatgg
gctccccacgtgcttgggggagggggcagcgaagagaccattggatgtggattggacgctggtgactggatccctattacccccagctgacccatcttgttctctgcccccagctcctggcaagggcccgtccctcratggcaccttcttgcgtggggtgtctgctgggacatctggcaaagactccacagtgagcttctccccatgccaggcattcttggagaagtatcgcaccatccacagcacgggcttcctggcctccaagtatgcaggcccttactctggggaccccaagcaggcattgtccgagggacctcccagtccttggacccagctggctcaacccctgggaccagcctgccaggatgcagtgcctacccactatccactgccccaccccacacaggccctgccttgcccaacagcctgtcgccacccagagaagcagggtggctatggctcggtgcttgcacta，
9.上述序列中的281位的碱基r是g或t，该突变导致taqi-rflp多态性，其中aa基因型的精液量显著大于ag基因型；ag基因型的精子密度极显著大于gg基因型；aa基因型、精子活力显著高于ag和gg基因型；aa基因型精子畸形率显著低于ag和gg基因型。
10.与此同时本发明设计了一个引物组合的应用，所述猪品种为杜洛克，所述猪精液品质性状为精液量、精子密度、精子活力和和精子畸形率，所述引物对的核苷酸序列如序列表seq id no：2和seq id no：3所示。
11.申请人提供了一种筛选猪精液品质性状的遗传标记的方法，按照以下步骤：
12.从猪精液中提取基因组dna。登录ensembl数据库中下载猪c7h15orf39基因序列(登录号为enssscg00000001885)作为靶序列，在序列中找出从测序结果中筛选出的snp位点，即外显子ensssce00000309970上的g/t等位基因(位于本发明克隆基因片段的第281位碱基处)突变(或称碱基替换，其核苷酸序列如图1所示和序列表seq id no:1所示)，对该snp位点设计特异引物，该特异引物的序列如序列表seq id no：2和seq id no：3所示。以常用的杜洛克猪基因组dna为模板进行扩增，根据其所获得的目的片段发现了该突变引起了taqi酶切位点(t
↓
cga)多态性，然后对该g/t突变的taqi-rflp(限制性内切酶酶切片段长度多态性)进行检测，所得snp位点的检测结果见图2所示。
13.本发明提供了鉴定上述序列g/t突变的taqi-rflp(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法，通过在猪基因组dna中进行pcr扩增，pcr扩增片段经taqi酶切分型及检测。并利用taqi-rflp方法确定杜洛克猪的不同基因型个体与精液品质性状间的关联分析的应用。
14.更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。
附图说明
15.图1：是从ensemble数据库中获取的包含snp位点的c7h15orf39扩增序列,其中r为突变位点。
16.图2：是猪c7h15orf39基因片段taqi-rflp检测结果的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.2％。附图标记说明：泳道m为dna marker dl2,000；泳道1，2，4为tg基因型，片段大小分别为619bp，340bp，279bp；泳道3为tt基因型，片段大小为619bp；泳道5、6为gg基因型，片段大小为340bp，279bp。
17.根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。
具体实施方式
18.对序列表序列的说明：
19.序列表seq id no：1：是本发明扩增的国外血缘猪品种“杜洛克”的核苷酸序列。该序列就是本发明克隆得到的与猪精液品质性状关联的snp分子标记的序列，在该序列的281bp碱基处存在一个等位基因g/t的突变，该突变导致的taqi-rflp的多态性。
20.序列表seq id no：2：是实施猪c7h15orf39基因外显子(登陆号ensssce00000309970)上(即本发明克隆序列的281位的碱基替换)g/t突变的taqi-rflp(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型的正向引物序列。
21.序列表seq id no：3：是实施猪c7h15orf39基因外显子(登陆号ensssce00000309970)上(即本发明克隆序列的281位的碱基替换)g/t突变的taqi-rflp(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型的反向引物序列。
22.实施例1：猪c7h15orf39基因片段的获得及多态性检测方法的建立
23.登录ensembl数据库中下载猪taqi基因序列(登录号为enssscg00000001885)，在序列中找出所筛选的snp位点，利用primer premier 5软件设计引物。正向引物序列如seq id no：2所示，即，c7h15orf39-taqi-f：cta ccg ccc acc cac aga a，反向引物序列如seq id no：3所示，即，c7h15orf39-taqi-r：acc gag cca tag cca ccc t。扩增得到一个619bp长的目的片段(该片段的序列如seq id no：1所示(见图1)。pcr反应体系为15μl，其中模板dna为1μl，每条引物为0.25μl，pcr mix为7.5μl，最后再加6μl去离子水至总体积为15μl；pcr反应程序：94℃预变性5min；然后94℃变性40s、67℃退火30s、72℃延伸20s，共36个循环；最后72℃延伸10min。上述扩增片段大小为619bp，而snp位点是位于该片段的281bp处的一个g/t突变(见图1)，该突变引起了taqi酶切位点(t
↓
cga)多态性。
24.pcr扩增后，对获得的目的片段进行taqi-rflp酶切分型。具体步骤为：取10μl pcr产物加入0.3μl限制性内切酶和1.2μl 10
×
buffer，37℃酶切2h，取10μl酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，记录酶切结果(如图2所示)，扩增片段大小为619bp。当281bp位点的碱基为g时，会有一个taqi酶切位点产生，酶切得到两条片段，长度分别为279bp和340bp(g等位基因)；当此位点为t碱基时，不存在taqi酶切位点，酶切得到长度为619bp的一个片段(t等位基因)。
25.实施例2：本发明筛选的分子标记在不同猪群中的多态性分布
26.猪基因组dna的提取(样本如表1所示)方法参照熊远著，《猪生化及分子遗传实验导论》，中国农业出版社，1999，报道的方法进行。
27.在3个国外血缘猪群体中检测猪c7h15orf39基因pcr-taqi-rflp多态性，检测结果如表1所示。
28.表1猪c7h15org39基因pcr-taqi-rflp在不同猪种中的分布结果
29.30.注：上述猪品种群体材料均为中国公开养殖的品种。
31.结果表明：在杜洛克猪中存在3种基因型。其中：在杜洛克猪群体中，g等位基因频率为0.68，所以g是优势等位基因(见表1)。
32.实施例3：本发明的分子标记在猪精液品质性状关联分析中的应用
33.为了判定猪c7h15orf39基因pcr-taqi-rflp与猪精液品质差异是否相关，选择广西扬翔股份有限公司种猪场培育的杜洛克猪群为试验材料，采用实施例1建立的taqi-rflp方法进行多态性检测，并分析杜洛克猪taqi-rflp不同基因型与猪精液品质性状的相关关系。采用sas统计软件(sas institute inc,version 9.4)glm程序进行单标记方差分析，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为：
34.y
ij
＝μ+gi+fj+e
ij
35.y
ij
为性状表型值，μ为平均值，gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表gg、tg和tt基因型，显性效应用1，-1和1分别代表gg、tg和tt基因型)；其中fj为猪场综合效应；e
ij
为残差效应。
36.在杜洛克猪进行不同基因型与精液品质性状间的关联分析，统计分析结果总结于表2。
37.表2猪c7h15orf39基因pcr-taqi-rflp基因型精液品质性状的统计分析表
[0038][0039]
注：以上数值为最小二乘均值
±
标准误；含有相同字母表示差异不显著，小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应正值表示g等位基因增加性状表型值。**表示p《0.01，*表示p《0.05。
[0040]
由表2可以看出，在杜洛克猪品种中，aa基因型的精液量显著大于ag基因型(p《0.05)；ag基因型的精子密度极显著大于gg基因型(p《0.01)；aa基因型的精子活力显著高于ag和gg基因型(p《0.05)；aa基因型精子畸形率显著低于ag和gg基因型(p《0.05)。