三并环化合物及其药物组合物和应用的制作方法

1.本发明属于药物化学领域，具体涉及一类三并环化合物、包含该类化合物的药物组合物及其在医药领域中的应用。


背景技术：

2.表达正常kras基因(鼠类肉瘤病毒癌基因)的蛋白质在正常组织信号转导中起到重要作用。由于单个氨基酸置换，特别是单个核苷酸置换导致的kras基因突变是激活突变的原因，这是许多癌症发展中的必要步骤。产生的突变蛋白涉及各种恶性肿瘤，包括肺腺癌、粘液腺癌、胰腺导管癌和结肠直肠癌。与ras家族的其它成员类似，kras蛋白是gtp酶并参与许多信号转导途径。
3.kras充当分子打开/关闭开关，一旦打开，它就会募集并激活生长因子和其它受体信号传播所必需的蛋白质，诸如c-raf以及pi-3激酶。正常的kras在活性状态下与gtp结合并具有固有的酶活性，即切割核苷酸的末端磷酸，将其转化为gdp。在将gtp转化为gdp后，kras被关闭。转化率通常较慢，但可以通过gtp酶活化蛋白(gap)类的辅助蛋白，例如rasgap来显着加速。反过来，kras可以结合鸟嘌呤核苷酸交换因子(gef)类的蛋白，例如sos1，其迫使释放结合的核苷酸。随后，kras结合存在于胞质中的gtp，并且gef从ras-gtp释放出来。在突变型kras中，其gtp酶活性被直接除去，使得kras组成性地处于活性状态。突变型kras通常具有特点：密码子12、13、61的突变或其混合的突变。
4.plk1是丝氨酸/苏氨酸激酶，由603个氨基酸组成，分子量为66kda，是细胞周期的重要调节因子。具体来说，plk1对于有丝分裂是重要的并且参与在细胞周期的m期期间的有丝分裂纺锤体的形成和变化以及cdk/细胞周期蛋白复合物的激活。
5.已知携带突变kras的癌细胞的活力依赖于polo样激酶1(plk1)，并且已经显示沉默plk1导致含有突变型kras的细胞死亡。因此，抑制plk1的化合物可用于治疗由kras突变引起的癌症。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一类结构新颖的用作plk1抑制剂的三并环化合物，其表现出对肿瘤细胞很好的抑制活性，且成药性好，具有广阔的药物开发前景。
7.第一方面，本发明提供了一种如式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药，其中
[0008][0009]
其中，
[0010]
l为-(ch2)
m-(a)
p-(ch2)
n-,其中a选立选自氧、cr
10
或nr
10
，m、p和n独立地为0至3中的任一整数；
[0011]
x、y和z各自独立地选自cr4或n；
[0012]
r1选自氢、c
1-c6烷基、c
1-c6杂烷基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
3-c8环烷氧基或c
3-c8杂环烷氧基，且其中所述烷基、杂烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烷氧基和杂环烷氧基各自任选地被至少1个r5取代；
[0013]
r2选自氰基、p(＝o)(ch3)2、n＝s(＝o)(ch3)2、s(＝o)(＝nh)ch3、so2nr6r7、nr
6-cor7、nr
6-co-nr7、co-or6或co-nr6r7；
[0014]
r3选自c
6-c
10
芳基、5至6元单环杂芳基或9至10元二环杂芳基，且其中所述芳基、单环杂芳基和二环杂芳基各自任选地被至多5个r8取代；
[0015]
r4和r5各自独立地选自氢、卤素、氰基、羟基、氨基、c
1-c6烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
1-c3烷氧基或c
1-c6卤代烷基，所述烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基和卤代烷基各自任选地被至少1个r9取代。
[0016]
r6和r7各自独立地选自氢、c
1-c8烷基、c
3-c6环烷基或c
3-c8杂环烷基，或者r6和r7与其所连接的氮原子共同形成c
3-c8环烷基或c
3-c8杂环烷基，且其中所述烷基和环烷基各自任选地被至少1个r9取代；
[0017]
r8独立地选自氢、卤素、氰基、羟基、氨基、c
1-c6烷基、c
1-c6杂烷基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
3-c8环烷氧基或c
3-c8杂环烷氧基，且其中所述烷基、杂烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烷氧基和杂环烷氧基各自任选地被至少1个r9取代；
[0018]
每一个r9各自独立地选自氢、卤素、氰基、羟基、氨基、氨基甲酰基、c
1-c6烷基、c
1-c6杂烷基、c
3-c8环烷基、3至14元杂环烷基、c
1-c3烷氧基、c
1-c3卤代烷氧基、c
6-c
10
芳基、5至6元单环杂芳基或9至10元二环杂芳基，且其中所述烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、卤代烷氧基、芳基、单环杂芳基二环杂芳基各自任选地被至少1个r
10
取代；
[0019]
r1至r9中所述杂烷基、杂环烷基、杂环烷氧基、杂芳基中所含的杂原子或杂原子团分别独立地选自-c(＝o)n(r
10
)-、-n(r
10
)-、-nh-、-n＝、-o-、-s-、-c(＝o)o-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-s(＝o)-、-s(＝o)
2-和-n(r
10
)c(＝o)n(r
10
)-，且所述杂原子或杂原子团的数目分别独立地选自1、2和3；
[0020]
每一个r
10
各自独立地选自氢、氯、氟、氰基、羟基、氨基、异丙基、环丙基、甲基、二氟甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、2,2-二氟乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基和苯基。
[0021]
优选地，其为如式i-1、i-2、i-3、i-4、i-5、i-6、i-7、i-8或i-9任一所示的化合物，
[0022][0023]
其中，o独立地为0至5中的任一整数。
[0024]
更优选地，其为如式i-1-1、i-2-1、i-3-1、i-4-1、i-5-1、i-6-1、i-7-1、i-8-1或i-9-1任一所示的化合物，
[0025][0026]
更优选地，本发明提供了如式i、i-1、i-2、i-3、i-4、i-5、i-6、i-7、i-8、i-9、i-1-1、i-2-1、i-3-1、i-4-1、i-5-1、i-6-1、i-7-1、i-8-1或i-9-1所示的具体化合物，其结构式为：
[0027][0028]
第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如式i、i-1、i-2、i-3、i-4、i-5、i-6、i-7、i-8、i-9、i-1-1、i-2-1、i-3-1、i-4-1、i-5-1、i-6-1、i-7-1、i-8-1或i-9-1所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药中的一种或多种。
[0029]
优选地，所述药物组合物中还包含至少一种药学上可接受的辅料。
[0030]
第三方面，本发明提供了如式i、i-1、i-2、i-3、i-4、i-5、i-6、i-7、i-8、i-9、i-1-1、i-2-1、i-3-1、i-4-1、i-5-1、i-6-1、i-7-1、i-8-1或i-9-1所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其的药物组合物在制备预防和/或治疗由plk1过度表达引起的疾病的药物中的用途。
[0031]
第四方面，本发明提供了如式i、i-1、i-2、i-3、i-4、i-5、i-6、i-7、i-8、i-9、i-1-1、i-2-1、i-3-1、i-4-1、i-5-1、i-6-1、i-7-1、i-8-1或i-9-1所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其的药物组合物，用作制备plk1抑制剂药物中的用途。
[0032]
第五方面，本发明提供了如式i、i-1、i-2、i-3、i-4、i-5、i-6、i-7、i-8、i-9、i-1-1、i-2-1、i-3-1、i-4-1、i-5-1、i-6-1、i-7-1、i-8-1或i-9-1所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症药物中的用途。
[0033]
优选地，所述癌症为血液肿瘤、胰腺癌、结直肠癌和肺癌中的任一种或多种。
[0034]
第六方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗由plk1过度表达引起的疾病或病症的方法，其包括将预防和/或治疗有效量的如式i、i-1、i-2、i-3、i-4、i-5、i-6、i-7、i-8、i-9、i-1-1、i-2-1、i-3-1、i-4-1、i-5-1、i-6-1、i-7-1、i-8-1或i-9-1所示的化合物或其
药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其的药物组合物施用于对其有需要的个体。
[0035]
本发明提供了新型plk1抑制剂化合物，其不但有着良好的plk1酶抑制活性，而且能显著降低kras突变体癌细胞系中的erk磷酸化，对kras突变体癌细胞有着优秀的抗肿瘤活性。
[0036]
与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
[0037]
本发明提供了一系列结构新颖的三并环化合物，经相关的酶和细胞活性试验证明，本发明的化合物具有优良的细胞增殖抑制活性，在体外实验中，对细胞增殖的ic
50
值达到nm级别，可在多种肿瘤中获得良好的应用。特别是，本发明的化合物能显著降低kras突变体癌细胞系中的erk磷酸化，对kras突变体癌细胞有着优秀的抗肿瘤活性。适于制备成plk1抑制剂，用于预防和/或治疗与plk1激活相关的疾病或病症，例如癌症(包括但不限于血液肿瘤、胰腺癌、结直肠癌和肺癌)。
具体实施方式
[0038]
一般术语和定义
[0039]
除非有相反陈述，否则在本发明中所使用的术语具有下述含义。
[0040]“烷基”是指饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子的直链和支链基团，例如可以是1至18个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子的直链和支链基团。在本发明中，“烷基”可以是一价、二价或三价基团。非限制性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基及其各种支链异构体等。非限制性实例还包括但不限于亚甲基、次甲基、亚乙基、次乙基、亚丙基、次丙基、亚丁基、次丁基及其各种支链异构体。另外，在本发明中，“烷基”可以是任选取代的或未取代的。
[0041]“烷氧基”是指
“‑
o-烷基”基团，其中“烷基”的定义如上所述。
[0042]“烯基”是指不饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子以及至少1个碳碳双键的直链和支链基团，例如可以是1至18个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子的直链和支链基团。在本发明中，“烯基”可以是一价、二价或三价基团。非限制性实例包括但不限于乙烯基(-ch＝ch2)、丙烯-1-基(-ch＝ch-ch3)、丙烯-2-基(-c(ch3)＝ch2)、丁烯-1-基(-ch＝ch-ch
2-ch3)、丁烯-2-基(-c(c2h5)＝ch2)、1-甲基丙烯-1-基(-c(ch3)＝ch-ch3)及其各种支链异构体等。非限制性实例还包括但不限于1,1-亚乙烯基(＝c＝ch2)、1,2-亚乙烯基(-ch＝ch-)、1,1-亚丙烯基(＝c＝ch-ch3)、1,2-亚丙烯基(-ch＝c(ch3)-)、1,3-亚丙烯基(-ch＝ch-ch
2-)及其各种支链异构体。另外，在本发明中，“烯基”可以是任选取代的或未取代的。
[0043]“炔基”是指不饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子以及至少1个碳碳叁键的直链和支链基团，例如可以是1至18个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子的直链和支链基团。在本发明中，“炔基”可以是一价、二价或三价基团。非限制性实例包括但不限于乙炔基丙炔基丁炔基
戊炔基及其各种支链异构体等。非限制性实例还包括但不限于亚乙炔基亚丙炔基亚丁炔基及其各种支链异构体。另外，在本发明中，“炔基”可以是任选取代的或未取代的。
[0044]“杂烷基”是指饱和的脂族烃基团，包括2至20个原子的直链和支链基团，例如可以是2至18个原子、2至12个原子、2至8个原子、2至6个原子或2至4个原子的直链和支链基团，其中一个或多个原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m为0、1或2)的杂原子，其余为碳。在本发明中，“杂烷基”可以是一价、二价或三价基团。非限制性实例包括但不限于甲氧甲基(2-氧杂丙基)、甲硫甲基(2-硫杂丙基)、甲氨甲基(2-氮杂丙基)及其各种支链异构体等。另外，在本发明中，“杂烷基”可以是任选取代的或未取代的。
[0045]“环烷基”是指饱和或部分不饱和的、单环或多环的脂族烃基团，包括3至12个环原子，例如可以是3至12个、3至10个或3至6个环原子(即3至6元环)。单环环烷基的非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等。在本发明中，“环烷基”可以是任选取代的或未取代的。
[0046]“杂环烷基”是指饱和或部分不饱和的、单环或多环的脂族烃基团，包括3至20个环原子，例如可以是3至16个、3至12个、3至10个或3至6个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m为0、1或2)的杂原子，其余环原子为碳。优选杂环烷基包括3至12个环原子，其中1至4个环原子是杂原子，更优选包括3至10个环原子，最优选包括5或6个环原子，其中1至4个，优选1至3个，更优选1至2个是杂原子。单环杂环烷基的非限制性实例包括但不限于吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环烷基的非限制性实例包括但不限于并环、螺环或桥环的杂环烷基。
[0047]“卤素”是指氟、氯、溴和碘，优选氟、氯和溴。
[0048]“卤代烷基”或“卤代烷氧基”是指烷基或烷氧基基团被一个或多个相同或不同的卤素原子所取代，优选的烷基或烷氧基的实例包括但不限于：三氟甲基、三氟乙基、三氟甲氧基。
[0049]“氰基”是指
“‑
cn”基团。
[0050]“羟基”是指
“‑
oh”基团。
[0051]“氨基”是指
“‑
nh
2”基团。
[0052]“氨基甲酰基”是指
“‑
(c＝o)-nh
2”基团。
[0053]“芳基”是指含有6-14个环原子的单环、双环和三环的碳环体系、其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含3-7个原子组成的环，且有一个或多个连接点与分子的其余部分相连。实例包括但不限于：苯基、萘基、蒽等。优选地，所述芳基为6-10个或6-7个环原子的碳环体系。
[0054]“杂芳基”是指含有5-14个环原子的单环、双环和三环体系，其中，至少一个环体系是芳香族的，且至少一个环体系包含一个或多个选自氮、氧、硫的杂原子，其中每一个环体系包含5-7个原子组成的环，且有一个或多个连接点与分子的其余部分相连。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳环”或“杂芳族化合物”交换使用。实例包括但不限于：呋喃基、咪唑基、2-吡啶基、3吡啶基、噻唑基、嘌呤基、喹啉基。优选地，所述杂芳基为5-10个环原子的环体系。
[0055]“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括
该事件或环境发生或不发生的情形。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但并非必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
[0056]“取代的”是指基团中的一个或多个氢原子，优选最多5个，更优选1至3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。
[0057]“药学上可接受的盐”是指由本发明中的化合物与相对无毒的酸或碱制备得到的盐。当本发明中的化合物含有相对偏酸性的官能团(例如羧基或磺酸基)时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与其游离形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的非限制性实例包括但不限于钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐、有机胺盐或类似的盐。当本发明中的化合物含有相对偏碱性的官能团(例如氨基或胍基)时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与其游离形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的非限制性实例包括但不限于无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、亚磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐等)、有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、葡糖醛酸等)以及氨基酸盐(例如精氨酸盐等)。药学上可接受的盐的具体形式还可参见berge et al.,“pharmaceutical salts”,journal of pharmaceutical science,1977,66:1-19)。本发明的某些特定化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱加成盐或酸加成盐。优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。根据本发明的实施例，优选如式i所示的化合物的药学上可接受的盐为酸加成盐，优选盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，更优选盐酸盐。
[0058]“药物组合物”是指可供药用的组合物，其包含一种或多种如式i所示的化合物或其药学上可接受的形式(例如盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物、前药等)，以及其他组分(例如药学上可接受的辅料)。
[0059]
在本发明中，“药学上可接受的辅料”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在于提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂，也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体ph值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
[0060]
本发明中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
[0061]
在本发明中，使用药物组合物的目的在于促进针对生物体的给药，有利于活性成分的吸收，进而发挥生物活性。本发明的药物组合物可以通过任何形式给药，包括注射(动
300核磁仪测定，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(dmso-d6)、氘代氯仿(cdc13)或氘代甲醇(cd3od)，内标为四甲基硅烷(tms)，化学位移以10-6
(ppm)计。ms图谱采用agilentsqd(esi)质谱仪(型号：6110)或shimadzu sqd(esi)质谱仪(型号：2020)测定。
[0068]
中间体的制备
[0069]
中间体int-1的制备
[0070][0071]
制备方法：
[0072]
第一步：合成化合物int-1b
[0073]
将化合物int-1a(10.0g,39.2mmol)溶于二氧六环(100.0ml)中，室温加入乙酸酐(4.8g,47.0mmol)和三乙胺(7.92g,78.4mmol)反应液于60℃反应18小时。tlc显示反应结束后，将反应液旋干后，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10:1到1:2(体积比))，得到化合物int-1b(10.4g，淡黄色固体，产率89％)。
[0074]
ms(esi):m/z298.0[m+1]
+
。
[0075]
第二步：合成化合物int-1c
[0076]
将化合物int-1b(2.0g,6.71mmol)溶于二氧六环(30.0ml)中，室温加入n-甲基哌嗪(671mg,6.71mmol),cs2co3(4.4g,13.4mmol),pd2(dba)3(0.3g,0.34mmol),4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(0.39g,0.67mmol),n2下反应液于95℃反应18小时。tlc显示反应结束后，将反应液旋干后，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10:1to 1:2(体积比))，得到化合物int-1c(2.6g，淡黄色固体，产率87％)。
[0077]
ms(esi):m/z318.1[m+1]
+
。
[0078]
第三步：合成化合物int-1d
[0079]
将化合物int-1c(0.89g,2.8mmol)加入到乙醇(10ml)中，然后冰浴下加入浓盐酸(2.5ml)，反应液80℃反应18h。tlc显示反应结束后，旋掉乙醇，并加水(50ml)稀释反应液，氨水调ph＝9，乙酸乙酯萃取(15ml
×
2)，合并有机相，并用饱和氯化钠水溶液洗涤(10ml
×
2)，用无水硫酸钠干燥有机相，旋干有机相得到化合物int-1d(0.72g，淡黄色固体，产率93％)。
[0080]
ms(esi):m/z276.1[m+1]
+
。
[0081]
第四步：合成化合物int-1
[0082]
室温下，将化合物int-1d(0.61g,2.22mmol)加入到乙腈(10ml)中，然后加入int-1e(0.35g,2.89mmol)。反应液80℃反应18h。tlc显示反应结束后，旋干反应液得到化合物int-1(0.64g，棕色固体，产率90％)。
[0083]
ms(esi):m/z318.2[m+1]
+
。
[0084]
中间体int-2的制备
[0085][0086]
制备方法：
[0087]
第一步：合成化合物int-2b
[0088]
将化合物int-1b(2g,6.71mmol)溶于二氧六环(30ml)中，室温加入int-2a(1.52g,6.71mmol),cs2co3(4.4g,13.4mmol),pd2(dba)3(0.3g,0.34mmol),4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽xantphos(0.39g,0.67mmol),n2下反应液于95℃反应18小时。tlc显示反应结束后，将反应液旋干后，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10:1到1:2(体积比))，得到化合物int-2b(2.6g，淡黄色固体，产率87％)。
[0089]
ms(esi):m/z444.2[m+1]
+
。
[0090]
第二步：合成化合物int-2c
[0091]
将化合物int-2b(3.2g,7.22mmol)溶于乙酸乙酯(15ml)中，然后滴加质量分数8％盐酸乙酸乙酯(30ml)，室温反应18h。tlc显示反应结束后，旋干反应液，etoac打浆残余物，过滤干燥滤饼得到化合物int-2c(3.0g，淡黄色固体，纯度：50％，产率55％)。
[0092]
ms(esi):m/z344.2[m+1]
+
。
[0093]
第三步：合成化合物int-2d
[0094]
将化合物int-2c(3.0g,50％纯度，4.37mmol)加入到二氯甲烷(30ml)和水(10ml)，冰浴下滴加37％甲醛水溶液(2.1g,26.2mmol)和醋酸(0.2ml)，室温反应1h。然后冰浴下，分批加入氰基硼氢化钠(0.82g,13.1mmol)，升至室温反应12h。tlc显示反应结束后，氨水调ph＝9,并加水(150ml)稀释反应液，用二氯甲烷萃取(50ml
×
2)，萃取，合并有机相，并用饱和氯化钠水溶液洗涤(30ml
×
2)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤所得有机溶液，旋干后的残余物用碱性氧化铝柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10:1到1:2(体积比))，得到化合物int-2d(1.0g，棕黄色油状物，产率64％)。
[0095]
ms(esi):m/z358.1[m+1]
+
。
[0096]
第四步：合成化合物int-2e
[0097]
将化合物int-2d(1g,2.8mmol)加入到乙醇(10ml)中，然后冰浴下加入浓盐酸
(2.5ml)，反应液80℃反应18h。tlc显示反应结束后，旋掉乙醇，加入水(50ml)稀释反应液，氨水调ph＝9，乙酸乙酯萃取(15ml
×
2)，合并有机相，并用饱和氯化钠水溶液洗涤(10ml
×
2)，用无水硫酸钠干燥有机相，过滤所得有机溶液，旋干得到化合物int-2e(0.8g，淡黄色固体，产率91％)。
[0098]
ms(esi):m/z316.1[m+1]
+
。
[0099]
第五步：合成化合物int-2
[0100]
室温下，将化合物int-2f(0.7g,2.22mmol)加入到乙腈(10ml)中，然后加入int-1e(0.35g,2.89mmol)。反应液80℃反应18h。tlc显示反应结束后，旋干反应液得到化合物int-2(0.8g，棕色固体，产率91％)。
[0101]
ms(esi):m/z358.2[m+1]
+
。
[0102]
目标化合物的制备和功能验证
[0103]
实施例1：化合物1的制备
[0104]
化合物1的结构式为：
[0105][0106]
化合物1的合成路线为：
[0107][0108]
化合物1的具体制备方法包括：
[0109]
第一步：合成化合物1c
[0110]
将化合物1a(3g,30mmol)溶于dcm(25ml)中，冰浴下加入四氢吡咯pyrrolidine(1.1g，15mmol)，室温反应2h，然后冰浴下加入1b(3.6g,30mmol),将反应液于40℃反应16小时。tlc显示反应结束后，将反应液旋干后，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝10:1(体积比))，得到化合物1c(3.5g，黄色固体，产率58％)。
[0111]
ms(esi):m/z203[m+1]
+
。
[0112]
第二步：合成化合物1d
[0113]
将化合物1c(6.6g,32.6mmol)溶于thf(60ml)中，氮气下-60度滴加lihmds(49ml,1m,48.9mmol)，-60℃反应0.5然后滴加草酸二乙酯(7.2g，48.9mmol)，升温到室温反应12h。tlc显示反应结束后，倒入冰水淬灭，用乙酸乙酯萃取，盐水洗，用无水硫酸钠干燥有机相，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝5:1(体积比))，得到化合物1d(3.1g，黄色固体，产率31％)。
[0114]
ms(esi):m/z303[m+1]
+
。
[0115]
第三步：合成化合物1e
[0116]
将化合物1d(2.9g,9.6mmol)加入到甲醇(25ml)和醋酸(5ml)中，冰浴下滴加1d-1(876mg,9.6mmol)，室温反应16h。tlc显示反应结束后，大量固体析出，过滤反应液得到化合物1e(2.3g，黄色固体，纯度75％，产率53％)。
[0117]
ms(esi):m/z343[m+1]
+
。
[0118]
第四步：合成化合物1f
[0119]
将化合物1e(2.2g,6.4mmol)和rucl3.h2o加入到乙腈(30ml)和水(6ml)中，然后冰浴下加入高碘酸钠(2.2g,9.6mmol)，反应液室温反应16h。tlc显示反应结束后，水稀释反应液，乙酸乙酯萃取，盐水洗，用无水硫酸钠干燥有机相，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1:1(体积比))，得到化合物1f(1.2g，淡黄色固体，产率73％)。
[0120]
ms(esi):m/z255[m+1]
+
。
[0121]
第五步：合成化合物1g
[0122]
室温下，将化合物1f(1g,3.9mmol)加入到dmf(6ml)中，然后加入n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛dmf-dma(6ml)。120℃反应2h。tlc显示反应结束后，旋干得到化合物1g(1.1g，棕色油状物，产率90％)。
[0123]
ms(esi):m/z310[m+1]
+
。
[0124]
第六步：合成化合物1h
[0125]
室温下将化合物1g(1.1g,3.6mmol)加入到dmf(10ml)中，室温加入化合物int-1(1.25g,3.6mmol)和碳酸钾(0.98g,7.1mmol)。然后加热到110℃反应32h。tlc显示反应结束后，水稀释反应液，乙酸乙酯萃取，盐水洗，用无水硫酸钠干燥有机相，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝5:1(体积比))，得到化合物1h(0.35g，黄色固体，产率17％)
[0126]
ms(esi):m/z564[m+1]
+
。
[0127]
第七步：合成化合物1
[0128]
室温下将化合物1h(350mg,0.06mmol)加入到含有nmp(5ml)的闷罐中，然后加入7.0m nh3的甲醇溶液(5ml)。然后加热到95℃反应48h。tlc显示反应结束后，冷却至室温固体析出，过滤，乙酸乙酯洗涤，得到化合物1(200mg，黄色固体，纯度70％，产率42％)。
[0129]
ms(esi):m/z535[m+1]
+
。
[0130]1h-nmr(400mhz,dmso):δppm 8.81(s,1h),8.20(s,1h),7.69(brs,1h),7.49(brs,1h)7.26(d,j＝4hz,1h),7.21-7.19(m,1h),6.76-6.73(m,1h),5.46(s,2h),4.64-4.59(m,2h),3.72-3.65(m,2h),3.13(t,j＝4hz,4h),2.44(t,j＝4hz,4h),2.21(s,3h)。
[0131]
实施例2：化合物2的制备
[0132]
化合物2的结构式为：
[0133][0134]
化合物2的合成路线为：
[0135][0136]
化合物2的具体制备方法包括：
[0137]
第一步：合成化合物2b
[0138]
将化合物2a(8.0g，34.3mmol)溶解于dcm中(100.0ml)中,冰浴下滴加四氢吡咯(1.22g，17.2mmol)，升至室温搅拌2小时。然后冰浴下滴加苯甲醛，升温至室温搅拌36小时。tlc显示反应结束后，将反应液旋干，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1(体积比))得到化合物2b(6.6g，黄色油状物，产率：60％)。
[0139]
ms(esi):m/z 322[m+1]
+
。
[0140]1h nmr(400mhz,cdcl3)δppm 7.45-7.25(m,11h),5.22(s,2h),4.75(s,2h),3.78-3.76(m,2h),2.75-2.52(m,2h).
[0141]
第二步：合成化合物2c
[0142]
将化合物2b(6g，18.7mmol)溶解于thf(80ml)，零下60度滴加入1.0m的lihmds的thf溶液(28ml，28mmol),零下60℃搅拌1小时，然后滴加草酸二乙酯(4.1g，28mmol)的thf(6ml)溶液。反应液缓慢升至室温搅拌12小时。tlc显示反应结束后，加入乙酸乙酯和水，萃取，有机相用盐水洗，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1(体积比))得到化合物2c(5g，黄色固体，产率：64％)。
[0143]
ms(esi):m/z 422[m+1]
+
。
[0144]
第三步：合成化合物2d
[0145]
将化合物2c(5g，11.86mmol)溶于甲醇(30ml)，thf(30ml)和醋酸(6ml)中，冰浴下滴加化合物1d-1(0.9g，11.86mmol)，升至室温搅拌16小时。tlc显示反应结束后，旋走大部分甲醇，加入乙酸乙酯和水，萃取，有机相用饱和碳酸氢钠和盐水洗，残余物经打浆(石油醚/乙酸乙酯＝1/1,40ml)纯化得到化合物2d(4.0g，白色固体，产率：73％)。
[0146]
ms(esi):m/z 462[m+1]
+
。
[0147]
第四步：合成化合物2e
[0148]
将化合物2d(4.0g，8.67mmol)溶于乙腈(80ml)和水(20ml)中，冰浴下加入三氯化钌水合物(0.19g，0.87mmol)和高碘酸钠(2.4g，10.4mmol)，升至室温搅拌4h。tlc显示结束后，将乙腈旋走，加入乙酸乙酯和水，萃取，有机相用盐水洗，旋干，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1(体积比))得到化合物2e(2g，淡黄色油状物，产率：60％)。
[0149]
ms(esi):m/z 388[m+1]
+
。
[0150]1h nmr(400mhz,cdcl3)δppm 7.41-7.25(m,5h),5.24(s,2h),5.00(s,2h),4.75-4.71(m,2h),4.48-4.45(m,2h),4.32(s,2h),4.10-4.05(m,2h),1.45-1.40(m,3h).
[0151]
第五步：合成化合物2f
[0152]
将化合物2e(1.0g，2.58mmol)溶于dmf中(12ml)，然后加入dmf-dma(6ml)，110℃下搅拌2h。tlc显示结束后，将反应液旋干，得到化合物2f(1.1g，棕黄色油状物，产率：96％),粗品直接在下一步使用。
[0153]
ms(esi):m/z 443[m+1]
+
。
[0154]
第六步：合成化合物2g
[0155]
将化合物2f(1.1g，2.49mmol)溶于dmf中(15ml)，然后加入int-1(0.29g，2.49mmol)和碳酸钾(1.03g，7.46mmol)，100℃下搅拌3天。tlc显示结束后，加入乙酸乙酯和水，萃取，有机相用盐水洗，旋干，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝10/1(体积比))得到化合物2g(0.55g，棕色油状物，纯度：60％，产率：19％)。
[0156]
ms(esi):m/z 697[m+1]
+
。
[0157]
第七步：合成化合物2h
[0158]
将化合物2g(0.55g，60％纯度，0.47mmol)溶于nmp中(8ml)，然后加入30％氨的甲醇溶液(8ml)，100℃下搅拌3天。tlc显示结束后，旋干，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝10/1(体积比))得到化合物2h(0.4g，棕色油状物，纯度：50％，产率：63％)。
[0159]
ms(esi):m/z 668[m+1]
+
。
[0160]
第八步：合成化合物2
[0161]
将化合物2h(100mg，0.07mmol)溶于甲醇(4ml)中，然后10％湿钯碳(10mg)，氢气球置换气体，室温搅拌16小时。tlc显示反应结束后，过滤，旋干，残余物用hplc制备纯化(waters sunfire obd 100x30mm,5μm，流动相a∶0.1％tfa in water，流动相b∶乙腈，梯度∶10％乙腈运行1min，52％-52％乙腈运行至10min，95％乙腈运行至14min，10％乙腈运行至16min结束)，纯化得到化合物2(15mg，黄色固体，产率：38％)。
[0162]
ms(esi):m/z 534[m+1]
+
。
[0163]1h nmr(400mhz,dmso)δppm 9.67(s,1h),9.33(s,1h),7.98(s,1h),7.68(s,1h),7.30-7.21(m,2h),6.86(dd,j＝9.2,2.9hz,1h),4.90-4.82(m,2h),4.66(s,1h),3.75(d,j＝4.8hz,2h),3.20-3.10(m,4h),2.46-2.40(m,4h),2.20(s,3h).
[0164]
实施例3：化合物3的制备
[0165]
化合物3的结构式为：
[0166][0167]
化合物3的合成路线为：
[0168][0169]
化合物3的具体制备方法包括：
[0170]
第一步：合成化合物3b
[0171]
室温下将化合物int-2的盐酸盐(0.4g,1mmol)加入到dmf(6ml)中，室温加入3a(0.35g,1.1mmol，参考专利wo200874788中第42-44页合成路线和方法合成得到)和碳酸钾(0.28g,2mmol)。然后加热到100℃反应48h。tlc显示反应结束后，水稀释反应液，乙酸乙酯萃取，盐水洗，用无水硫酸钠干燥有机相，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝5:1(体积比))，得到化合物3b(0.3g，棕色油状物，产率29％)
[0172]
ms(esi):m/z602.2[m+1]
+
。
[0173]
第二步：合成化合物3
[0174]
室温下将化合物3b(300mg,60％纯度，0.3mmol)加入到含有nmp(5ml)的闷罐中，然后加入7m nh3甲醇溶液(5ml)。然后加热到95℃反应3天。tlc显示反应结束后，旋干甲醇，乙酸乙酯和水稀释，萃取，旋干，残余物用hplc制备纯化(waters sunfire obd 100x30mm,5μm，流动相a∶0.1％tfa in water，流动相b∶乙腈，梯度∶10％乙腈运行1min，52％-52％乙腈运行至10min，95％乙腈运行至14min，10％乙腈运行至16min结束)，得到化合物3(20mg，淡黄色固体，纯度90％，产率12％)。
[0175]
ms(esi):m/z573.2[m+1]
+
。
[0176]1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δppm8.89(s,1h),8.24(s,1h),7.49(brs,1h),7.29(brs,1h),7.23(d,j＝4hz,1h),7.19(d,j＝8hz,1h),6.78(dd,j＝8hz,4hz,1h),4.64-4.61
(m,2h),3.64-3.61(m,2h),3.08(t,j＝4hz,4h),2.97(t,j＝8hz,2h),2.93(s,4h),2.79(t,j＝8hz,2h),2.22(s,3h),1.74(t,j＝4hz,4h)。
[0177]
实施例4：化合物4的制备
[0178]
化合物4的结构式为：
[0179][0180]
化合物4的合成路线为：
[0181][0182]
化合物4的具体制备方法包括：
[0183]
第一步：合成化合物4b
[0184]
将化合物4a(10.0g，71.3mmol)溶解于dmf中(100ml)中,滴加入dmf-dma(30ml)，升温至120度搅拌2h。tlc显示反应结束后，将反应液降至室温，旋干得到化合物4b(10.0g，棕色油状物，产率：72％)，直接用于下一步，无需进一步纯化。
[0185]
ms(esi):m/z 196.1[m+1]
+
。
[0186]
第二步：合成化合物4c
[0187]
将化合物4b(10.0g，51.2mmol)溶解于甲醇(100ml)和醋酸(10ml)中，滴加入化合物1d-1(3.9g，51.2mmol)，室温搅拌12h。tlc显示反应结束后，旋走甲醇，加入水(200ml),并用乙酸乙酯萃取(60ml
×
2)，合并有机相后，依次用饱和碳酸氢钠(60ml
×
1)和饱和氯化钠水溶液(60ml
×
1)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，将有机相旋干，得到的残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2/1(体积比))得到化合物4c(2.2g，淡黄色固体，产率：24％)。
[0188]
ms(esi):m/z 181[m+1]
+
。
[0189]
第三步：合成化合物4d
[0190]
将化合物4c(1.8g，9.99mmol)溶于乙腈中(30ml)中，冰浴下分批加入nbs(2.13g，11.99mmol)，升温至50℃搅拌4小时。tlc显示反应结束后，旋走大部分乙腈，加入水(100ml),并用乙酸乙酯萃取(30ml
×
2)，合并有机相后，依次用饱和碳酸氢钠(30ml
×
1)和饱和氯化钠水溶液(30ml
×
1)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，将有机相旋干，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1(体积比))得到化合物4d(2.0g，淡黄色固体，产率：77％)。
[0191]
ms(esi):m/z 259.0[m+1]
+
，261.0[m+3]
+
。
[0192]1h nmr(400mhz,cdcl3)δppm 4.71-4.65(m,2h),4.08-3.95(m,2h),2.69(t,j＝6.1hz,2h),2.63-2.56(m,2h),2.53(s,1h),2.22-2.11(m,2h).
[0193]
第四步：合成化合物4e
[0194]
将化合物4d(2.0g，7.72mmol)溶于dmf中(25ml)，然后加入dmf-dma(10ml)，120℃下搅拌1h。tlc显示结束后，将反应液旋干，得到化合物4e(2.4g，棕黄色油状物，产率：99％),粗品直接在下一步使用。
[0195]
ms(esi):m/z 314.0[m+1]
+
，316.0[m+3]
+
。
[0196]
第五步：合成化合物4f
[0197]
将化合物4e(2.4g，7.64mmol)溶于dmf中(30ml)，然后加入化合物int-1(2.42g，7.64mmol)和dipea(1.97g，15.28mmol)，100℃下反应16h。tlc显示结束后，加入水(100ml),并用乙酸乙酯萃取(30ml
×
2)，合并有机相后，用饱和氯化钠水溶液(30ml
×
1)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，将有机相旋干，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝10/1(体积比))得到化合物4f(1.0g，淡黄色固体，产率：23％)。
[0198]
ms(esi):m/z 568.1[m+1]
+
，570.1[m+3]
+
。
[0199]
第六步：合成化合物4
[0200]
将化合物4f(100mg，0.18mmol)溶于二氧六环(2.0ml)中，然后加入化合物4f-1(25mg，0.26mmol),碳酸铯(115mg，0.35mmol)，pd2(dba)3(16mg，0.02mmol),xantphos(20mg，0.04mmol)，氮气下反应液于110℃搅拌16小时。tlc显示反应结束后，加入乙酸乙酯和水，萃取，有机相用盐水洗，旋干，残余物用hplc制备纯化(waters sunfire obd 100x30mm,5μm，流动相a∶0.1％tfa in water，流动相b∶乙腈，梯度∶10％乙腈运行1min，52％-52％乙腈运行至10min，95％乙腈运行至14min，10％乙腈运行至16min结束)，得到化合物4(6.6mg，白色固体，产率：6％)。
[0201]
ms(esi):m/z 581[m+1]
+
。
[0202]1h nmr(400mhz,dmso)δppm 8.74(s,1h),8.26(s,1h),7.27(d,j＝2.4hz,1h),7.18(d,j＝7.9hz,1h),6.75(dd,j＝9.1,2.9hz,1h),4.61-4.35(m,3h),3.60-3.56(m,2h),3.28-3.24(m,5h),3.15-3.09(m,4h),2.72(t,j＝7.3hz,2h),2.45-2.40(m,4h),2.20(s,3h).
[0203]
实施例5：化合物5的制备
[0204]
化合物5的结构式为：
[0205][0206]
化合物5的合成参考实施例4中化合物4的合成步骤，其中第六步用氰化锌代替化合物4f-1，合成得到化合物5。
[0207]
ms(esi):515.2[m+1]
+
。
[0208]1h nmr(400mhz,dmso)δ(ppm)9.44(s,1h),9.16(s,1h),8.40(s,1h),7.34-7.16(m,2h),6.95-6.77(m,1h),4.78-4.72(m,2h),3.98-3.95(m,2h),3.35-3.29(m,8h),2.86-2.62(m,7h).
[0209]
实施例6：化合物6的制备
[0210]
化合物6的结构式为：
[0211][0212]
化合物6的合成参考实施例4中化合物4的合成步骤，其中第六步用二甲基氧化磷代替化合物4f-1，合成得到化合物6。
[0213]
ms(esi):566.2[m+1]
+
。
[0214]1h nmr(400mhz,dmso)δ(ppm)8.90(s,1h),8.33(s,1h),7.25-7.15(m,2h),6.78(dd,j＝9.1,2.7hz,1h),4.66-4.54(m,3h),3.63-3.53(m,2h),3.15-3.09(m,4h),2.95-2.75(m,4h),2.42(s,4h),2.20(s,3h),1.68(s,3h),1.63(s,3h).
[0215]
实施例7：化合物7的制备
[0216]
化合物7的结构式为：
[0217][0218]
化合物7的合成参考实施例4中化合物4的合成步骤，其中第六步用乙酰胺代替化合物4f-1，合成得到化合物7。
[0219]
ms(esi):547.2[m+1]
+
。
[0220]
实验例1：本发明化合物针对ht29细胞的抗增殖活性测试
[0221]
实验材料：
[0222]
mccoy's 5a培养基，盘尼西林/链霉素抗生素购自维森特，胎牛血清购自biosera。celltiter-glo(细胞活率化学发光检测试剂)试剂购自promega。ht29细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。nivo多标记分析仪(perkinelmer)。
[0223]
实验方法：
[0224]
将ht29细胞种于白色96孔板中，80μl细胞悬液每孔，其中包含3000个ht29细胞。细胞板置于二氧化碳培养箱中过夜培养。
[0225]
将待测化合物用排枪进3倍稀释至第9个浓度，即从0.6mm稀释至91.45nm，设置双复孔实验。向中间板中加入78μl培养基，再按照对应位置，转移2μl每孔的梯度稀释化合物至中间板，混匀后转移20μl每孔到细胞板中。转移到细胞板中的化合物浓度范围是3μm至0.457nm。细胞板置于二氧化碳培养箱中培养3天。另准备一块细胞板，在加药当天读取信号值作为最大值(下面方程式中max值)参与数据分析。向此细胞板每孔加入25μl细胞活率化学发光检测试剂，室温孵育10分钟使发光信号稳定。采用多标记分析仪读数。
[0226]
向细胞板中加入每孔25μl的细胞活率化学发光检测试剂，室温孵育10分钟使发光信号稳定。采用多标记分析仪读数。
[0227]
数据分析：
[0228]
利用方程式(sample-min)/(max-min)*100％将原始数据换算成抑制率，ic50的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(graphpad prism中"log(inhibitor)vs.response
‑‑
variable slope"模式得出)。表1提供了本发明的化合物对ht29细胞增殖的抑制活性。
[0229]
表1.本发明中的化合物的抗细胞增殖活性数据(ic
50
)
[0230][0231]
从表1中的实验结果可以看出，本发明中的化合物在抑制ht29细胞增殖方面具有良好的活性。化合物1的活性小于100nm。显示出极其重要的抗肿瘤潜力。
[0232]
实验例2：plk1酶活性测试实验
[0233]
此测定法用于检查化合物抑制plk1酶活性的效力，其中较低的ic
50
值表示作为plk1抑制剂的化合物在以下测定设置中的高效力。
[0234]
实验材料：
[0235]
plk1 active购自carna；
[0236]
casein protein购自signalchem；
[0237]
adp-glo kinase assay购自promega；
[0238]
kinase assay buffer iii购自signalchem；
[0239]
nivo多标记分析仪(perkinelmer)。
[0240]
实验方法：
[0241]
使用试剂盒里的kinase buffer稀释酶，底物，atp和抑制剂。
[0242]
将待测化合物用100％dmso稀释到1mm作为第一个浓度，然后再用排枪进行5倍稀释至第8个浓度，
[0243]
即从1mm稀释至0.013μm。用1x kinase buffer将化合物各浓度点进行20倍稀释，配制成含有5％dmso的化合物工作液，向微孔板中加入1μl化合物各浓度梯度工作液，设置双复孔。向微孔板中加入2μl plk1酶(15ng)，2μl底物和atp的混合物(20μm atp，0.2μg/μl casein protein)，此时化合物终浓度梯度为10μm稀释至0.13nm，反应体系置于25℃反应60分钟。反应结束后，每孔加入5μl adp-glo试剂，25℃继续反应40分钟，结束反应后每孔加入10μl的kinase detection试剂，25℃反应30分钟后采用perkinelmer nivo多标记分析仪读数化学发光，积分时间0.5秒。
[0244]
max孔:阳性对照孔读值无酶空白孔
[0245]
min孔：阴性对照孔读值为含有1％dmso溶剂孔
[0246]
数据分析：
[0247]
利用方程式(sample-min)/(max-min)*100％将原始数据换算成抑制率，ic
50
的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(graphpad prism中log(inhibitor)vs.response
‑‑
variable slope模式得出)。
[0248]
其中本发明制备得到的化合物1以及本领域常用的plk1酶抑制剂nms-1286937对于plk1酶活性的抑制效果如表2所示。
[0249]
表2.本发明的化合物对plk1酶抑制的ic
50
数据
[0250]
化合物编号ic
50
(nm)nms-12869374.60化合物117.20
[0251]
由表2可知，本发明的化合物，具体为化合物1，对plk1酶具有较好的抑制作用，活性达到nm级别，与临床化合物nms-1286937相比，仅有三到四倍的差距，是一个极其优秀的先导化合物，具有非常大的潜力进行进一步结构优化，获得更好的化合物结构，产生良好的临床应用前景。
[0252]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，这些变化、修改、替换和变型均涵盖在本发明的范围之中。