本发明涉及生物医学,尤其是涉及一种前列腺癌干细胞培养基、培养方法和应用。
背景技术:
1、前列腺癌是常见的男性恶性肿瘤,其中大多数类型是具有管腔细胞特征的腺癌。前列腺癌研究模型主要包括动物模型、前列腺癌细胞系、人源肿瘤异种移植模型(pdx)。这些模型各有其优缺点,动物模型虽然容易进行基因修饰,但是由于动物和人的生理、病理和基因组有一定差异,利用动物模型得到的实验结果往往不能应用于临床;前列腺癌细胞系比较容易培养,但是与原始肿瘤差异较大,难以反映原始肿瘤的生物学特征和患者个体差异性;pdx模型是肿瘤研究和药物筛选的金标准,现有的常规操作方法是将从临床获取的少量人肿瘤组织块直接接种于免疫缺陷小鼠体内,生成的肿瘤组织用于药物筛选,但是由于前列腺癌穿刺样本较小,很难在免疫缺陷小鼠体内生成肿瘤组织,导致前列腺癌的pdx模型成功率较低。另外,很难从前列腺癌的穿刺组织中分离大量前列腺癌干细胞用于实验室研究,虽有报道前列腺癌细胞培养方法,但是都不能维持其腺癌特征。比如有研究者报道了体外培养管腔类型前列腺干细胞的方法,但是,这些前列腺干细胞不具备癌症干细胞特征,没有致瘤性,需要对其进行转基因操作,使其过表达致癌基因后才具有一定的致瘤性。这些基因操作改变了原始肿瘤细胞的基因组,使其不适用于个体化精准医疗。
2、前列腺癌干细胞是导致前列腺癌产生去势抵抗性和耐药性的一个重要根源,研究前列腺癌干细胞的生物学特性有利于制定靶向治疗策略,提高治疗效果。然而,目前很难在体外培养具有腺癌特征的前列腺癌干细胞,这一瓶颈限制了前列腺癌药物研发。
3、有鉴于此,特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种前列腺癌干细胞培养基,以解决现有技术中存在前列腺癌干细胞培养基很难从前列腺癌的穿刺组织中分离大量前列腺癌干细胞的技术问题。
2、本发明的目的之二在于提供一种前列腺癌干细胞的培养方法,以解决现有技术中培养的前列腺癌干细胞无法维持腺癌特征的技术问题。
3、本发明的目的之三在于提供上述的前列腺癌干细胞培养基或上述的培养方法在构建肿瘤原代细胞异种移植模型中的应用。
4、本发明的目的之四在于提供一种构建肿瘤原代细胞异种移植模型的方法。
5、为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
6、第一方面,本发明提供了一种前列腺癌干细胞培养基,由基础培养基和添加物组成,所述添加物包括在基础培养基中为以下浓度的组分:1~3%(v/v)的胎牛血清、1xn2、1xb-27、10~50ng/ml的egf、10~50ng/ml bfgf、1~10nm雄激素dht、20-100μm抗坏血酸、0.02~3μm gsk3抑制剂、0.1~20μm tgf-β抑制剂和0.1~20μm rock抑制剂;
7、所述基础培养基包括dmem/f12、dmem或rpmi-1640。
8、进一步的,所述gsk3抑制剂包括chir99021、azd1080或ly2090314,优选为chir99021;
9、优选地,所述tgf-β抑制剂包括a83-01、repsox或gw788388,优选为a83-01;
10、优选地,rock抑制剂包括y27632、rki-1447或gsk269962a,优选为y27632。
11、进一步的,所述添加物还包括在基础培养基中浓度为100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。
12、第二方面,本发明提供了一种前列腺癌干细胞的培养方法,包括使用上述的培养基从前列腺癌组织块分离得到的原代前列腺癌干细胞中培养得到前列腺癌干细胞。
13、进一步的,所述前列腺癌组织块分离得到的原代前列腺癌干细胞的制备方法包括将前列腺癌组织块在消化液i中消化,分离得到原代前列腺癌干细胞;
14、优选地,所述从前列腺癌组织块分离得到的原代前列腺癌干细胞中培养得到前列腺癌干细胞包括待原代前列腺癌干细胞贴壁培养至80~90%时,依次加入缓冲液和消化液ii,收集细胞悬液离心,收集细胞沉淀,加入培养基重悬后进行传代培养;
15、优选地,所述传代培养的代次为≤4代。
16、进一步的,所述将前列腺癌组织块在消化液i中消化,分离得到原代前列腺癌干细胞的方法为循环消化方法;
17、优选地,所述循环消化方法包括以下步骤:
18、a、向肿瘤穿刺组织块中加入1~5ml消化液i,每10~20min取出含有已消化下来的细胞的消化液i,收集细胞沉淀,加入培养基重悬后保存备用,向剩余的组织块中加入新的消化液i;
19、b、重复步骤a直至所有组织块消化完为止;
20、优选地,所述消化的条件为36~38℃消化,优选为37℃消化;
21、优选地,所述保存的温度为2~8℃。
22、进一步的,所述消化液i包括基础培养基、胶原酶、抗坏血酸和rock抑制剂;
23、优选地,所述胶原酶为i型胶原酶或ii型胶原酶,优选为i型胶原酶;
24、优选地,所述胶原酶在基础培养基中浓度为1~3mg/ml,优选为2mg/ml;
25、优选地,所述抗坏血酸在基础培养基中浓度为20~100μm,优选为50μm。
26、优选地,所述rock抑制剂在基础培养基中浓度为0.1~20μm,优选为5μm。
27、优选地,所述rock抑制剂包括y27632、rki-1447或gsk269962a,优选为y27632。
28、进一步的,所述培养的条件包括在37℃环境温度下,95%湿度下培养至少1周。
29、第三方面,本发明提供了上述的培养基或上述的培养方法在构建肿瘤原代细胞异种移植模型中的应用。
30、第四方面,本发提供了一种构建肿瘤原代细胞异种移植模型的方法,其特征在于,包括将权利要求4~8任一项培养方法培养得到的前列腺癌干细胞与基质胶混合后移植至免疫缺陷小鼠体内,获得肿瘤原代细胞异种移植模型;
31、优选地,所述前列腺癌干细胞的细胞密度为50~100万细胞/100μl基质胶;
32、优选地,所述移植的量为50~200μl,优选为100μl。
33、本发明提供的一种前列腺癌干细胞培养基,通过添加1xn2和1xb-27相互配合促进前列腺癌干细胞内的合成代谢、铁离子转运、抗氧化、细胞增殖,同时配合生长因子(egf和bfgf)调节细胞生长和增殖;激素可影响前列腺癌干细胞培养微环境中的细胞之间及细胞与培养基之间的相互作用,促进前列腺癌干细胞生长和增殖;抗坏血酸对前列腺癌干细胞的活性和生长具有一定作用;gsk3抑制剂、tgf-β抑制剂和rock抑制剂可协同促进前列腺癌干细胞增殖和干性维持,对前列腺癌干细胞的分离产生正向调控促进作用。通过在基础培养基中添加一定量范围内的1xn2、1xb-27、egf、bfgf、激素、抗坏血酸、gsk3抑制剂、tgf-β抑制剂和rock抑制剂,能够促进前列腺癌干细胞生长增殖,能够从前列腺癌的小块穿刺组织中分离并在体外扩增培养前列腺癌干细胞,且由于添加物具有调节细胞培养微环境的作用,能够较好地使增殖细胞保留前列腺癌干细胞的生物学特征。解决了前列腺癌的穿刺组织中分离大量前列腺癌干细胞难度高的技术问题。另一方面使用该培养基培养前列腺癌干细胞的方法,使前列腺癌干细胞维持了腺癌特征。可应用于构建原代细胞异种移植模型(prdx),提高异种移植成功率。