本发明涉及多肽和免疫学,具体涉及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原表位肽、应用及试剂盒。
背景技术:
1、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein,ecp)是一种由嗜酸性粒细胞(eos)释放的碱性蛋白,也称为核糖核酸酶3(rnase 3),由rnase 3基因编码,是rnase a 蛋白超家族的成员。ecp是活化eos释放的强碱性蛋白中的重要组分,可以直接杀伤病原体,参与调节免疫,促进炎症反应和免疫细胞的聚集。同时它又是eos活化的重要标志,反映了eos的活化程度。在与嗜酸性粒细胞活化相关的临床疾病中,如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎或关节的自身免疫性疾病的患者ecp水平会升高。ecp含量还与哮喘的严重程度有关。在哮喘发作期,ecp含量较高,当炎症程度减轻达缓解期时ecp含量降低。因此,ecp含量的升高可以提示气道炎症等相关疾病的发生,反映临床病情的严重程度,可用于过敏性哮喘、鼻炎、特应性皮炎等疾病的辅助诊断。
2、临床和研究中检测ecp的理想方法为免疫检测,通常需要基于ecp抗体进行抗原抗体反应,因此需要有特异性的ecp抗原及抗体。
3、ecp与rnase a 蛋白超家族的其他成员序列相似性较高。特别是嗜酸性粒细胞源性神经毒素(edn/rnase 2),是嗜酸性粒细胞释放的另一种蛋白质,ecp与edn的氨基酸序列相似度达71.64%。并且ecp有三种天然糖基化形式 (分子量分别为18、20和22 kda),因此常规方法制备的抗体很容易与ecp的类似物产生免疫交叉反应,或不能识别所有糖基化、非糖基化的ecp类型,导致检测方法特异性不足。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是常规方法制备的抗体很容易与ecp的类似物产生免疫交叉反应,或不能识别所有糖基化、非糖基化的ecp类型,导致检测方法特异性不足,目的在于提供一种嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原表位肽、应用及试剂盒,解决了检测方法特异性不足的问题。
2、本发明通过下述技术方案实现:
3、第一方面,本发明提供一种嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原表位肽,嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原表位肽为seq id no.1和seq id no.2氨基酸序列所示的多肽的组合。
4、抗原表位肽①是ecp蛋白n端第16至25位的一段,含10个氨基酸的肽段,加赖氨酸(k)、丝氨酸(s)两个氨基酸组成,氨基酸序列为seq id no.1;抗原表位肽②是ecp蛋白n端第112至123位的一段,含12个氨基酸的肽段,加k、s两个氨基酸组成,氨基酸序列为seq idno.2。赖氨酸侧链较长且有伯胺,便于后续步骤的偶联;丝氨酸含有一个极性的羟基(oh),亲水且提供构象灵活性,使得表位肽更容易形成抗原结合位点。上述抗原表位肽通过生物信息学方法分析和实验确认,具有良好的抗原性,与ecp同源蛋白—rnase a 蛋白超家族成员的对应局部肽段结构差异较大,且不包含ecp的天然糖基化位点。
5、①seq id no.1:ksislnpprcti
6、②seq id no.2:ksdnrdprdspryp
7、第二方面,本发明提供一种嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原,包含上述的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原表位肽。
8、作为一种可能的设计,上述嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原的制备方法,包括:
9、使用双功能交联剂将嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原表位肽与载体蛋白偶联,得到嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗原;
10、所述双功能交联剂包括磺基琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(nhs-酯-马来酰亚胺),所述载体蛋白包括人血清白蛋白(hsa)、钥孔血蓝蛋白 (klh)、牛血清白蛋白(bsa)、或鸡卵清白蛋白(ova卵清蛋白)。
11、优选的,上述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
12、第三方面,本发明提供一种嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗体,所述嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗体是上述抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。
13、第四方面, 本发明提供上述嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗体在制备嗜酸性粒细胞阳离子蛋白定量检测试剂盒中的应用。
14、第五方面,本发明提供一种定量检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白的试剂盒,包括上述的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白抗体。
15、上述试剂盒可用方法学包括磁微粒管式化学发光法、胶乳凝集法和流式荧光发光法等。
16、化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式。该技术的原理是利用化学反应释放的自由能激发中间体(常用碱性磷酸酶-金刚烷胺、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物、辣根过氧化酶-鲁米诺衍生物等),使其从激发态回到基态。当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子,对光子进行测定而进行分析。化学发光具有荧光的特异性,同时不需要激发光,避免了荧光分析中激发光杂散光的影响从而提高了灵敏度,并且避免了放射分析造成的环境污染和健康危害,是一种非常优秀的定量分析方法。磁微粒管式发光采用粒径极小的纳米磁微粒作为固相载体,拥有更快的反应速度和灵敏度,远远强于酶标板或纤维素膜的结合能力,使得固相能装载更多的包被物。超顺磁性磁微粒,在磁场作用下能快速聚合和分离,洗涤更彻底和快速。相比较下,板式发光固相载体多为酶标板,固/液相反应接触面积小,反应不彻底,测量结果变异较大,灵敏度也较低,所以在目前对定量检测要求越来越高的情况下,其使用逐渐受到限制。
17、胶乳增强免疫比浊法是利用抗原抗体在缓冲中快速形成网状的抗原-抗体分子复合物,使反应液出现浊度,透光率下降。在一定的比例范围内,反应液的浊度和抗原抗体的量呈线性相关关系。其基于抗原抗体特异性反应以及胶乳增强放大的原理,具有灵敏度高,特异性好,抗干扰能力强等优点。小尺寸的胶乳颗粒的具有较大的表面积,能增加抗体的结合效率,加快反应速度;均相反应的条件,易于实现自动化检测,检测具有较高的准确度和一致性。
18、流式荧光发光法,又称悬浮阵列、液相芯片等,是一种多指标联合诊断技术。该技术以荧光编码微球为核心,结合流式原理、激光分析和高速数字信号处理等多种技术,能够实现多指标并行分析。其工作原理是将荧光标记后的单细胞(或颗粒)悬液进入吸样管,随鞘液进入流动室。在检测区,液流、激光和探测器互相垂直并聚焦于一点,实现流体动力聚焦。荧光标记的细胞或颗粒在激光激发下发出散射光和荧光的发射波,这些信号被检测器获取并经处理后输入计算机,由软件进行分析处理。流式荧光发光法具有高通量、高灵敏度、并行检测等特点。该技术最多可一管同时准确定量检测多种不同的生物分子,大大提高了检测效率。
19、以上三种方法学还能实现高程度的自动化,是实现定量检测分析要求的重复性、线性、准确度等指标效果较好的方法。相比较下,免疫层析(胶体金、荧光层析)、板式发光或酶联免疫法(elisa)等方法学存在自动化程度不高、反应非均相等缺点,导致重复性不佳、准确度差等问题,不满足本发明检测定量分析的要求。
20、作为一种可能的设计,上述包括磁微粒化学发光法反应体系,所述磁微粒化学发光法反应体系包括缓冲液、单克隆抗体和校准品,所述单克隆抗体为上述单克隆抗体。
21、作为一种可能的设计,上述包括胶乳凝集反应体系,所述胶乳凝集反应体系包括r1试剂和r2试剂,所述r1试剂包括缓冲液、表面活性剂和防腐剂,所述r2试剂包括嗜酸性粒细胞阳离子蛋白乳胶颗粒、抑菌剂和表面活性剂。
22、作为一种可能的设计,上述嗜酸性粒细胞阳离子蛋白乳胶颗粒通过如下方法制备:
23、将两种不同粒径的羟基微球混合后加入缓冲液,反应活化,得到微球混合液;
24、将微球混合液与双交联剂反应后,清洗离心后,超声,得到重悬浮微球液;
25、将上述多克隆抗体用缓冲液稀释后,与重悬浮微球液混合,孵育,清洗离心后,超声,得到嗜酸性粒细胞阳离子蛋白乳胶颗粒。
26、不同粒径微球可与不同浓度范围的目标分析物产生最佳的免疫反应,小粒径微球与低浓度分析物,大粒径微球与高浓度分析物的结合效果更佳。两种粒径的微球联用可扩展方法的线性范围,提高灵敏度。
27、优选的,上述羟基微球为jsr life sciences生产的。
28、本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
29、本发明提供了一种ecp抗原表位肽,基于该表位肽制备的抗体具有高特异性、强结合力,不会与edn或rnase a超家族的其他蛋白发生交叉反应,并且可以检测糖基化和非糖基化的ecp。包含这两种抗体的试剂盒,用于ecp的定量检测,具有较好的临床应用价值。