红林蚁AChE基因、红林蚁AChE及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)基因、 所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)、制备该酶的方法。
【背景技术】
[0002] 现在全球环境污染尤其是农药污染日益严重，能快速、简便地检测农药残留尤显 迫切。多数农药是有机磷及氨基甲酸酯类，已被大量运用于各类农作物的生产。但此类农药 已经给环境造成严重污染、毒害人畜，为此开发灵敏快速的农药残留监测具有重要实意义。
[0003] 目前运用较广的检测农药残留方法是利用乙酰胆碱酯酶 (achetylcholinesterase，AChE)与有机磷和氨基甲酸类农药的抑制反应，通过分光光度检 测的方法来定量农药残留量的多少。此方法具有成本低、检测快、相对较灵敏的优点，适宜 于较大范围的农残检测需求。因此，农残检测试剂盒的核心试剂原料--乙酰胆碱酯酶的 制备即成为技术的关键。
[0004] 运用基因工程手段以毕赤酵母真核表达体系来制备AChE是主流发展趋势。现有 技术中，虽有大量有关利用昆虫乙酰胆碱酯酶基因制备的真核表达体系的研究和报道，但 由于对农药的灵敏度仍不太理性，因而仍待改进。而到目前为止，尚未见到有关利用红林蚁 的乙酰胆碱酯酶基因及利用其制备的真核表达体系的有关研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因、所编码的红林蚁乙酰 胆碱酯酶（AChE)、制备该酶的方法，简而言之，本发明目的在于提供一种利用红林蚁乙酰胆 碱酯酶基因及利用该基因所构建的毕赤酵母真核表达体系，利用该体系表达获得的红林蚁 乙酰胆碱酯酶可以用于制备农药残留检测试剂盒，从而实现在农药残留试剂检测方面的应 用。
[0006] 本发明所采取的技术方案如下。
[0007] 红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)基因，碱基序列如序列表序列1所示。
[0008] 红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)，其氨基 酸序列如序列表序列2所示。
[0009] 所述红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的制备方法，包括以下步骤： (1)构建并PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因全序列，具体包括以下步骤： 1、 提取总RNA，反转录获得cDNA; 2、 获得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因保守序列； 引物序列设计如下： U-ACHE-F：GGTTCGAGGGAGAGGAGATGTGGAA, U-ACHE-R：CCGTGCATCACTCCCATCCATTC； 以红林蚁cDNA为模板，以所设计的U-ACHE-F和U-ACHE-R为引物，PCR扩增出红林蚁 的乙酰胆碱酯酶基因的保守序列； 3、 红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因的3'端和5'端扩增； 设计3'端和5'端特殊引物，引物序列设计如下： 3'GSP-Outer:CACGCAGAGGACGAGTACCAACGTA, 3'GSP-Inner:GAATATGTCACAAATCGAGCGAGAAGCC； 5'GSP-Outer:GACGCTTAGTGAAGTATCGCCTGCA, 5'GSP-Inner: GAGATGTTGGTGTTTGGGTTCCACA。
[0010] PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶基因的3'端和5'端基因片段； 4、PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因全序列； 根据已知的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE)基因全序列设计引物，引物设计目的在于 引入限制性内切酶EcoRI和Notl的酶切位点，引物设计序列如下(序列中下划线部分为酶 切位点）： FF：TCAGAATTCATGAGTTTTTGGATGAATTGTCCGTC， FR：CAAGCGGCCGCCCCTGTGTATGCGAATTGCGAGAA； 以步骤2所得红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE)基因保守序列、步骤3所得红林蚁乙酰 胆碱酯酶(AChE)基因的3'端和5'端为模板进行PCR扩增，获得红林蚁乙酰胆碱酯酶基因 (AChE)基因全序列（即红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE)编码区开放阅读框）； (2) 利用步骤1所构建的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因（AChE)全序列构建真核重组表达载 体； 所采用的真核表达载体是pPICZ a A，该载体是表达6 XHis标签的高效表达载体，同时 该载体具有多酶切位点，易于插入外源基因片段如红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)基因编码序 列； (3) 将步骤2所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母宿主细胞，培养，诱导 表达红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE); 将所构建的真核重组质粒表达载体电击转化进入毕赤酵母X33感受态菌株，筛选阳性 菌株，扩增培养，甲醇诱导红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)表达； (4) 红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的纯化； 由于所采用的真核表达载体pPICZ a A特异性表达6XHis标签，因而进一步通过Ni-NTA His-Bind Resins柱即可获得纯化的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)。
[0011] 所述红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)在农药残留中的应用，所述农药为有机磷或氨基 甲酸酯类农药。
[0012] 红林蚁ci/?ae)，属于蚁亚科（Formicinae)蚁属（Fomicia)，以捕食昆虫 为食，广泛分布在我国北方地区。本发明通过将红林蚁乙酰胆碱酯酶基因克隆、重组后转化 到毕赤酵母内，加甲醇诱导，获取目的蛋白乙酰胆碱酯酶，用于农产品中农药的残留检测。 通过实验证明，本发明所制备的红林蚁乙酰胆碱酯酶相较于现有的果蝇乙酰胆碱酯酶具有 更高的活性和灵敏度，因而在未来的农药检测试剂制备技术领域具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0013] 图1为重组质粒的酶切与PCR鉴定图，在图1中，M:DNAMaker(DL5000) ;1、2 :重 组质粒EcoRI和Notl双酶切结果；3、4 :重组质粒PCR鉴定结果。
[0014] 图2是真核重组质粒表达载体转化至毕赤酵母X33后不同阶段电泳图；图中M:低 分子量蛋白Maker;1 :甲醇诱导表达后纯化的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)，2 :毕赤酵 母X33发酵液中上清蛋白，3:未诱导表达的发酵液中上清蛋白，4:甲醇诱导后未纯化的上 清蛋白。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0016] 介绍具体实施例前，首先对本发明中所用到的主要仪器设备和试剂简要介绍如 下。
[0017] 主要设备：台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1650-W); 电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-7C型)，PCR仪（TAKARABIOINC，D-8707); 紫外仪(北京六一仪器厂，DWD-9403C型）； 恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司，ZWY-2012C); Bio-RadMicroPulser(北京友华照钦医疗器械有限公司，MicroPulser); CL-BID八通道残留农药测定仪(上海博纳新技术研究所，CL-BIII八通道）。
[0018] 主要试剂：MolluscRNAKit(OMEGA,R6875_00); PrimeScript?-^ 1ststrandcDNASynthesiskit(TaKaRa, 6210A)； 3'-FullRACECoreSet(TaKaRa,D314)； 5'-FullRACECoreSet(TaKaRa,D315)； TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer. 4. 0(TaKaRa, 9760)； T4DNA连接酶(纽英伦生物技术(北京）有限公司，M0202); 酵母粉(天津科密欧化学试剂有限公司）； 蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司）； 甲醇(天津市风船化学试剂科技有限公司）； S-乙醜基硫代乙醜胆喊，96%(AlfaAesar,AJohnsonMatheyCompany，A16802);DTNB(生工生物，D8350); 乙酰胆碱酯酶(家蝇）（北京中生瑞泰科技有限公司，9000-81-1); 马拉硫磷、杀扑磷、辛硫磷、乙酰甲胺磷均为农药检测标准品（上海 农药研究所，SPL-BA-017、SPL-BA-022、SPL-BA-009、SPL-BA-011)。
[0019] 菌株和载体： 大肠杆菌感受态E.coliJM109 (TaKaRa，9052); PMD?19-TVectorCloningKit(TaKaRa,6013)； 毕赤酵母PichiapastorisX33 (Invitrogen,K1740-01); 酵母表达载体pPICZaA(Invitrogen,K1740-01)。
[0020] 实验材料： 红林蚁，2013年9月份取材于河南省焦作市云台山中。 实施例
[0021] 红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因，碱基序列如序列表SEQIDNO. 1所示。
[0022] 红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)，其氨基 酸序列如序列表SEQIDN0. 2所示。
[0023] 制备红林蚁乙酰胆碱酯酶的技术原理是：利用重组DNA技术将红林蚁乙酰胆碱酯 酶基因克隆至真核表达载体，并使其在毕赤酵母中大量表达，进一步纯化即可得到其表达 产物乙酰胆碱酯酶。
[0024] 红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，具体包括以下步骤： 1、构建并PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)基因全序列 (1)提取总RNA，反转录获得cDNA A.提取总RNA，以捕获的太行山脉红林蚁作为实验材料，按照MoluseRNAkit实验步 骤提取总RNA;提取步骤具体如下： a.取红林蚁头部约50mg,液氮研磨，转至1.5mLEP管（RNase-free)中，加入1mL RNA-Solv试剂用力涡旋至红林蚁头部研磨物团块全部溶解，室温孵育3min; 比加入0.2