一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种微生物发酵生产四氢嘧啶的方 法。
【背景技术】
[0002] 四氢啼陡（1，4, 5, 6-tetrahydr〇-2-methyl-4-pyrimidineca;rboxylic acid ; ectoine)是一种在耐盐及嗜盐微生物中应用最为广泛的渗透压调节物。四氢嘧啶分子具有 高度水溶性、不带电荷的特点，在高盐环境下细胞可通过四氢嘧啶的高浓度积累提高胞内 渗透压，却不会影响胞内生物大分子正常的生理功能。研究表明在高盐、高温、冷冻和干燥 等逆境下四氢嘧啶对核酸、蛋白质、细胞膜及整个细胞可提供保护作用，因此在生物制剂、 化妆品生产和制药等领域具有广泛的应用前景。
[0003] 四氢嘧啶的生产传统工艺是利用嗜盐或耐盐微生物在高盐环境下合成积累四氢 嘧啶，而在低盐环境下释放四氢嘧啶的特性，采用"细菌挤奶（Bacterial milking)"的方 法，通过渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的高效分泌合成。该方法使用高盐培养基易对 设备造成腐蚀，而且发酵产物成份复杂，增加了下游纯化工艺的难度，使得四氢嘧啶的生产 成本居高不下，严重制约了四氢嘧啶的大规模应用。
[0004] 目前现有的生产方法严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此开发 一种高效的四氢嘧啶生产方法从而降低其生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意 义。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法。
[0006] 本发明提供的一种制备四氢嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸钠的溶液中加入 重组大肠杆菌，经生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了 SEQ ID N2:2所 示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4所示蛋白的；
[0007] 所述重组大肠杆菌为含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重组大肠杆 菌：
[0008] 1)序列表中SEQ ID Ns :1所示的核苷酸序列；
[0009] 2)编码序列表中SEQ ID Ns :2、SEQ ID Ns :3和/或SEQ ID Ns :4所示蛋白质序 列的多核苷酸序列；
[0010] 3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序 列；
[0011] 4)与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以 上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0012] 所述方法中，所述重组大肠杆菌具体为将重组载体导入出发大肠杆菌后得到的重 组菌；所述重组载体具体为在出发载体pBAD/HisA的多克隆位点插入具有SEQ ID Ns :1所 示核酸序列的DNA片段所得的质粒；具体的，所述出发大肠杆菌为带有AaraBAD阿拉伯糖 代谢缺陷性状的大肠杆菌；再具体的，所述出发大肠杆菌为大肠杆菌BW25113(rrnB3Al ac Z4787hsdR514 A (araBAD)567 A (rhaBAD)568rph-l)。
[0013] 所述重组载体具体为口8八04(^48(：，其核苷酸序列如序列表中的3￡〇10施.5所 /_J、i〇
[0014] 所述方法中，所述重组大肠杆菌具体为大肠埃希氏菌Escherichia coli Bff-pBAD-ectABC CGMCC NO. 8334〇
[0015] 所述方法中，所述含L-天冬氨酸钠的溶液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述含 L-天冬氨酸钠的溶液中的浓度如下：
[0016] L-天冬氨酸钠 2M; 葡萄糖 l〇〇g/L; 甘油 l〇〇g/L; KC1 100g/L； 溶剂为水。
[0017] 所述方法中，所述生物转化反应的条件包括：转化温度为30°C，控制生物转化反 应体系的溶氧在20%以上，和维持pH至7. 0。
[0018] 具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制生物转化反应体系的溶氧在20%以上， 所述搅拌速度为500转/分钟，通气量为2L/min ;具体的，通过2. 7M氨水和1M柠檬酸水溶 液维持pH至7.0。
[0019] 所述方法中，所述生物转化反应的过程包括：将所述重组大肠杆菌进行诱导培养， 得到含有表达了 SEQ ID Ns :2所示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4所示蛋白 的重组大肠杆菌的诱导培养液；向所述诱导培养液中加入所述含L-天冬氨酸钠的溶液至 L-天冬氨酸钠终浓度为200mM ;转化培养至葡萄糖被消耗完，开始补加所述含L-天冬氨酸 钠的溶液，所述含L-天冬氨酸钠的溶液的流加速度为40mL/h，继续进行转化培养，继续转 化培养过程中一直补加所述含L-天冬氨酸钠的溶液；转化培养结束即得四氢嘧啶转化液。
[0020] 所述方法中，所述"将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了 SEQ ID Ns :2所示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培 养液"的方法包括下述1)和2):
[0021] 1)菌体培养过程：将300mL所述重组大肠杆菌的种子液接种于2. 7L含100 y g/ ml氨苄青霉素的发酵培养基中，搅拌培养至葡萄糖消耗完时流加补料培养基，补料培养基 的流加速度为50mL/h，流加至菌体密度0D600达到50,菌体培养过程结束，进入诱导培养阶 段；
[0022] 2)诱导培养过程：将上述菌体培养后的发酵液的温度降至30°C，加入L-阿拉伯 糖，使得L-阿拉伯糖终浓度为lg/L，进行诱导培养；诱导培养过程中要一直流加补料培养 基，补料培养基的流加速度调至20mL/h ;当重组蛋白EctABC的表达量不再增加时，诱导培 养过程结束；
[0023] 所述菌体培养的条件为：培养温度为37°C，控制菌体培养体系的溶氧在20%以 上，和维持pH至7.0 ;
[0024] 具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制菌体培养体系的溶氧在20%以上，所述 搅拌速度为500 - 800转/分钟，通气量为3L/min ;具体的，通过2. 7M氨水和1M磷酸维持 pH 至 7. 0 ;
[0025] 所述诱导培养的条件为：培养温度为30°C，控制诱导培养体系的溶氧在20%以 上，和维持pH至7.0 ;
[0026] 具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制诱导培养体系的溶氧在20%以上，所述 搅拌速度为500 - 800转/分钟，通气量为3L/min ;具体的，通过2. 7M氨水和1M磷酸维持 pH 至 7. 0 ;
[0027] 每 1L发酵培养基的配制：葡萄糖 10g，（NH4)2HP048g，KH2P0 413. 3g，MgS04.7H201. 2g， 柠檬酸1. 7g，微量盐溶液10mL，用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7. 0 ;
[0028] 每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g，MgS04 WHWlOg，微量盐溶液20mL，用水定 容至1L ;
[0029] 每 1L微量盐溶液的配制：FeS04 WHWlOg，ZnS04.7H2〇2. 25g，CuS04.511201& MnS04 4 H200. 5g，Na2B407 .lOKOO. 23g，CaCl2 .2112028,（NH4)6M〇70 240. lg，用 5M盐酸水溶液定容，定容至 lL〇
[0030] 所述发酵培养基置于NBS Biof 1〇30006L发酵罐中。
[0031] 所述方法中，所述种子液的制备过程为：挑取所述重组大肠杆菌单菌落接入20ml 含有100 U g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C、200rpm培养12小时；然后将20ml培 养物转接至300ml含有100ii g/ml氨苄青霉素的种子培养基中，37°C、200rpm振荡培养12 小时，即得种子液；
[0032] 所述种子培养基的配制：蛋白胨16g,酵母膏10g,氯化钠5g,用水定容至1L， pH7. 0。
[0033] 所述方法中，所述生物转化反应完后，还包括胞内或胞外四氢嘧啶的抽提过程；
[0034] 所述胞内四氢嘧啶的抽提过程包括：
[0035] 取1ml所述四氢嘧啶转化液，8000rpm，20分钟离心收集菌体，菌体加入500 ill抽 提液，所述抽提液由体积比为10:5:4的甲醇：氯仿：水组成，震荡1小时，13000rpm离心 20分钟促进分相；上清转移至新离心管中，加入等体积的体积比为1:1的氯仿：水，振荡1 小时，再次13000rpm离心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥， 得到含有四氢嘧啶的干粉；
[0036] 所述胞外四氢嘧啶的抽提过程包括：
[0037] 取所述四氢嘧啶转化液8000rpm离心20分钟，取上清1ml置于离心管中，加入1ml 氯仿振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干 燥，得到含有四氢嘧啶的干粉。
[0038] 本发明的另一个目的是提供一种菌体多批次重复使用合成四氢嘧啶的方法，所述 方法包括：将每3L按照权利要求1-8任一所述的方法得到的四氢嘧啶转化液，按照下述步 骤1)和2)操作：
[0039] 1 )8000rpm，20分钟离心收集菌体，用3L连续转化液重悬菌体后置于发酵罐中，转 化培养至葡萄糖消耗完，开始补加转化培养基，转化培养基的流加速度为40mL/h，继续进行 转化培养，继续转化培养过程中一直补加转化培养基；转化培养结束即获得四氢嘧啶转化 液2 ;
[0040] 所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述连续转化液中的浓度如下：
[0041] L-天冬氨酸钠 200mM; 葡萄糖 i〇g/L; 甘油 l()g/L; KCl 10 g/L； 溶剂为lOOmM、pH 7.0的PBS缓冲液；
[0042] 所述100mM PBS缓冲液由380ml0. 1M磷酸二氢钠溶液加入620ml0. 1M磷酸氢二钠 溶液配置而成；
[0043] 所述转化培养基由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述转化培养基中的浓度如下：
[0044] L-天冬氨酸钠 2M; 葡萄糖 l〇〇g/L; 甘油 l〇〇g/L; KCl 100g/L； 溶剂为水；
[0045] 所述转化培养的条件包括：培养温度为30°C，控制转化培养体系的溶氧在20%以 上，和维持pH至7.0 ;
[0046] 具体的，通过调整搅拌速度和通气量控制生物转化反应体系的溶氧在20 %以上， 所述搅拌速度为500转/分钟，通气量为2L/min ;具