由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用图
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请是要求在2012年3月23日递交的美国临时申请No. 61/615, 178的权益和 优先权，该美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明在广义上涉及含有小于200个氨基酸残基的重组肽和一个或多个源于超 折叠绿色荧光蛋白或其变体的新的载体蛋白或变体，以及使用源于超折叠绿色荧光蛋白或 其突变体的新的载体蛋白生产重组肽的方法。
【背景技术】
[0004] 肽是一类生物分子，其被广泛地在许多生物医学研宄领域中用作试剂、在疾病的 治疗中用作治疗性药物、在检测病原菌中用作诊断剂以及用作生物标记物。合成肽通常有 两种方法，一种是化学合成，另外一种是重组表达。化学合成已被用于制备多种治疗性肽， 包括可的瑞林、甲状旁腺素（PTH)、胰高血糖素样肽（GLP-I)及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁 肽、恩夫韦肽、降血钙素、比伐卢定、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽和胰 岛素。该方法需要氨基酸片段的多步缩合而形成肽，同时也需要繁琐的保护、去保护和纯化 等步骤。到目前为止，大多数低于50个氨基酸残基的商业化肽是用这种方法生产。由于制 药行业和生物医学研宄中肽的需求在不断增加，用于化学合成的氨基酸片段的价格也在持 续攀升。因此，日常使用的治疗性肽药物比如GLP-I类似物，在未来将难以保持可以承受的 价格。尽管化学合成小于50个氨基酸残基的肽在技术上是可行的，但较低的产量以及合成 过程中产生的大量的有机废物是相当不合算的。现在，大多数超过50个氨基酸残基的肽是 在细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等细胞宿主中重组表达的。多年来，使用融合蛋白表达多肽一 直是比较常用的方法。可用的载体蛋白包括谷胱甘肽-S-转移酶（W094/04688 and Ray et al.，BioTechnology, 11，64, 1993)、核酬糖激酶（US patent No. 5, 206, 154 and Callaway et al.，Antimicrob. Agents&Chemo.，37, 1614-1919, 1993)、gp-55 蛋白（Gram H. et al.， Biotechnology, 12, 1017-1023, 1994)、类固醇异构酶（Kuliopulos A. et al.，J. Am. Chem. Soc·，116,4599-4607, 1994)、泛素 （Pilon A. et al.，Biotecnol.Prog. 374-379, 1997)、 牛凝乳酶原（Hauht et al.，Biotechnolo. Bioengineer· ,7, 55-61，1998)、GBl 结构 域（Darrinm et al·，Biochemistry, 41，7267-7274,2003)、RNA 结合蛋白（Sharon M.et al·，Protein Exp. And Purif·，24, 374-383, 2002)、SH2 结构域（Fairlie W.et al.，Protein Exp. And Purif. 26, 171-178, 2002)、纤维素酶结合蛋白、小泛素样修饰蛋白、 内含肽、抗菌/增加通透性的蛋白、碳酸酐酶（US Patent N〇:5,962,270 and W097/29127)、 乳清蛋白（W095/27782)、beta-牛乳糖（Shen S.，PNAS, 281，4627-4631，1984)以及氯霉素 乙酰转移酶（Dykes C.et al·，European Journal of Biochemistry, 174, 411-416, 1988) 〇 选择这些融合载体是因为它们在宿主细胞内具有相对高的表达水平和快速折叠的特性。虽 然可用，但使用融合载体蛋白重组表达的肽的终产率一般不会超过l〇〇mg/L。此外，用于肽 表达的现在可用的融合蛋白方法有许多技术上的问题，尤其对于产生小于50个氨基酸残 基的肽（Vileghe et al·，Drug Discovery Today, 15, 40-56, 2010) 〇
[0005] 非常有必要研发一种新的载体蛋白，所述新的载体蛋白克服其它现有载体蛋白产 生重组肽的限制。
【发明内容】
[0006] 本发明至少部分基于这样的意外发现：超折叠绿色荧光蛋白或其变体当被用作载 体蛋白时，在细菌细胞的细胞质或者包涵体中会得到高表达水平的重组肽。因此，本发明的 一个方面涉及一种用于构建用于产生作为融合蛋白的重组肽的稳定表达系统的新的载体 蛋白。具体而言，所述载体蛋白包括超折叠绿色荧光蛋白或其变体。
[0007] 在一个实施方案中，所产生的融合蛋白以完整和稳定的形式表达。在一个实施方 案中，所述新的载体蛋白容易通过方便的方法去除并且不会使后续的肽纯化步骤复杂化。 在本发明的一个实施方案中，所述目标肽被靶向以通过对本发明的载体蛋白进行基因工程 而形成包涵体，用于避免细胞内的蛋白水解式降解。依据本发明，提供了一种用于表达目标 肽的融合载体蛋白，该融合载体蛋白来自于超折叠绿色荧光蛋白或者其变体，长度包括237 个或者更多个氨基酸。优选地，所述的融合载体蛋白的氨基酸序列在结构式I中列出：
[0008] T1-A1-T2(I)
[0009] 其中，
[0010] Tl为不存在、甲硫氨酸、组氨酸标签或者至少一个肽裂解位点；
[0011] Al为超折置绿色灰光蛋白；
[0012] T2为不存在、组氨酸标签或者至少一个肽裂解位点，条件是Tl和T2至多有一个不 存在。
[0013] 在实施方案中，Al为超折萱绿色焚光蛋白，所述蛋白具有如下氣基酸序列：Ser-L yS-Gly-Glu-Glu-Leu-Phe-Thr-Gly-Val-Val-Pro-Ile-Leu-Val-Glu-Leu-Asp-Gly-Asp-Va I-Asn-Gly-His-Lys-Phe-Ser-Val-Arg-Gly-Glu-Gly-Glu-Gly-Asp-Ala-Thr-Asn-Gly-Lys -Leu-Thr-Leu-Lys-Phe-Ile-Cys-Thr-Thr-Gly-Lys-Leu-Pro-Val-Pro-Trp-Pro-Thr-Leu-Val-Thr-Thr-Leu-Thr-Tyr-Gly-Val-Gln-Cys-Phe-Ser-Arg-Tyr-Pro-Asp-His-Met-Lys-A rg-His-Asp-Phe-Phe-LyS-Ser-Ala-Met-Pro-Glu-Gly-Tyr-Val-Gln-Glu-Arg-Thr-Ile-Se r-Phe-Lys-Asp-Asp-Gly-Thr-Tyr-LyS-Thr-Arg-Ala-Glu-Val-Lys-Phe-Glu-Gly-Asp-Thr -Leu-Val-Asn-Arg-Ile-Glu-Leu-Lys-Gly-Ile-Asp-Phe-Lys-Glu-Asp-Gly-Asn-Ile-Leu-Gly-His-Lys-Leu-Glu-Tyr-Asn-Phe-Asn-Ser-His-Asn-Val-Tyr-Ile-Thr-Ala-Asp-Lys-G In-Lys-Asn-Gly-Ile-Lys-Ala-Asn-Phe-Lys-Ile-Arg-His-Asn-Val-Glu-Asp-Gly-Ser-Va I-Gln-Leu-Ala-Asp-His-Tyr-Gln-Gln-Asn-Thr-Pro-Ile-Gly-Asp-Gly-Pro-Val-Leu-Leu -Pro-Asp-Asn-His-Tyr-Leu-Ser-Thr-Gln-Ser-Val-Leu-Ser-Lys-Asp-Pro-Asn-Glu-Lys-Arg-Asp-His-Met-Val-Leu-Leu-Glu-Phe-Val-Thr-Ala-Ala-Gly-Ile-Thr-His-Gly-Met-A sp-Glu-Leu-Tyr-Lys(SEQIDN0 :l)，或与SEQIDN0:l至少80%，至少90%，至少95%， 至少97%或者至少99%相同的氨基酸序列。
[0014] 肽裂解位点可以选自例如：Met、Cys、Pro、Asn、Glu、Tyr、Trp、Lys、Arg、 Asn-Gly、Asp-Met-Gln-Asp-Ile、Asp-Glu-Val-Asp-Ile、Leu-Glu-Val-Asp-Ile、 Trp-Glu-His-Asp-Ile、 Leu-Glu-His-Asp-Ile、 Val-Glu-Ile-Asp-Ile、 Val-Glu-His-Asp-Ile、 Ile-Glu-Thr-Asp-Ile、 Leu-Glu-Thr-Asp-Ile、 Ile-Glu-Ala-Asp-Ile、 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、 Arg-Gly-Glu-Iie、 Arg-Gly-Asp-Ile、Arg-Gly-Asp-Ile、Arg-Gly-Asp-Ala、Ile_Glu-Pr〇-Asp-Ile、 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-