用于检测和鉴定肠出血性大肠杆菌的方法
【专利说明】用于检测和鉴定肠出血性大肠杆菌的方法
[0001] 本发明涉及对人类健康构成严重风险的产志贺毒素的大肠杆菌（STEC)的鉴定。
[0002] 产志贺毒素的大肠杆菌（STEC)是属于超过400种大肠杆菌0:H血清型的大肠 杆菌的一个多元化群体，其中的一些引起从腹泻至出血性肠炎（HC)和溶血性尿毒综合征 (HUS)范围的食源性疾病的爆发和偶发事件。根据它们的人类致病性，再后菌株也被称为 肠出血性大肠杆菌（EHEC) (Levine 1987, Nataro and Kaper 1998)。HC 和 HUS 的许多病例 已经被归因于EHEC血清型0157: H7株，但现在已经认识到STEC的其它血清型属于EHEC群 体。
[0003] 因此，来自许多国家的累积证据表明，高达30-60%的人类STEC感染是由非0157 STEC引起的并且只有五至七种"优先级" STEC血清型与HC和HUS的爆发和偶发事件有关。 这些包括血清型 026: [HI 1]、045: [H2]、0103: [H2]、0111: [H8]、0121: [H19]、0145: [H28]、 0157:[H7]以及它们的无运动性（non-motile)衍生物。此外，0104:[H4]的一株不寻常的 菌株与2011年全球范围内HC和HUS的最大爆发有关（Scheutz et al·，2011 ;Frank et al. , 2011 ；Struelens et al. , 2011 ；Gault et al.,2011)〇
[0004] 因此，许多司法管辖区正在考虑实施食品检验计划（food inspection program) 以保护公众免受这些对人类具有高毒力的STEC株的侵害。作为基于风险的食品检验计划 的一部分，用于这些肠出血性大肠杆菌（EHEC)株的检测的理性方法需要优先级STEC的标 志性特征的明确定义（例如血清群、血清型、毒力和其它标记）和在食品中检测这些致病性 STEC的有效方法。非0157EHEC的检测尤其具有挑战性，因为它们没有特定特征将它们和共 享同样生态位（niches)的大量无害共生大肠杆菌区分开。Karmali et al. (2003)提出了 血清致病型分类，作为基于疾病的严重性、频率和与爆发的关联来鉴定参与食源性疾病爆 发的最重要的0血清型的框架，但是各种STEC株之间的毒力差异的原因仍然不清楚。有可 能这种差异是由于STEC株所具有的毒力基因谱的差异，需要研宄以证实这一点并鉴定合 适的分子标记。
[0005] 已有技术通过例如检测stxl/stx2基因和定位于LEE (肠道细胞擦抹基因座，该基 因座首次鉴定于肠致病性大肠杆菌（EPEC)中）上eae基因的存在，来测定样品中STEC污 染的存在。但是STEC致病性的遗传基础比这些基因之一或二者的存在或不存在更加复杂 得多。在复杂的样品（例如食品、粪便、环境样品）中可能包括菌株的混合物（例如STEC 和EPEC株的混合），stxl/2和eae基因的存在并不表示在该样品中存在EHEC。
[0006] 然而，考虑到一些STEC株可引起人类非常严重的健康问题，在食品产品中检测到 STEC株就会丢弃所述产品，即使可能该STEC不会对人类健康构成威胁。由于缺乏对非致病 性STEC株和EHEC株的区分，这造成大量的浪费。
[0007] 已经提出采用除stxl/2和eae标记外的其它遗传标记以选择性检测EHEC株并将 它们与非致病性STEC株区分开。例如，PCT WO 2011/018762介绍了一种涉及基因 stxl、 stx2、eae、nleB和espK的组合检测以预测样品中EHEC的存在的方法。
[0008] 但是，仍然需要可靠测试，用于区分性筛选包括非0157 EHEC的EHEC的存在，以及 特异性检测EHEC血清型，尤其是在"排名前七位"血清型026: [Hll]、045: [H2]、0103: [H2]、 0111: [H8]、0121: [H19]、0145: [H28]、0157: [H7]中的 EHEC 血清型。
[0009] 本发明人现在已经鉴定出了与构成人类健康严重风险的几种STEC株相关 的区分性遗传标记。特别地，他们已经鉴定出了位于对人类具有高毒力的EHEC株的 CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成族的、规律 间隔的短回文重复序列）序列内的遗传标记。
[0010] CRISPRs存在于许多细菌种属（包括大肠杆菌）的基因组内。它们由含有21至 47bp长度并由相似大小的间隔序列分开的直接重复序列的串联序列组成。间隔序列衍生自 外源核酸，如噬菌体或质粒，并且已有假说称它们可以保护细菌免受随后由同源噬菌体和 质粒带来的感染。
[0011] 本发明人已经对与全球最频繁的临床病例有关的各种EHEC株的CRISPR基因座 进行了测序，并且已经鉴定出了不同的间隔序列，所述间隔序列可以用于特异性鉴定造成 人类中大部分 EHEC 感染的 EHEC 血清型 0157: [H7]、0145: [H28]、0103: [H2]、0111: [H8]、 0121: [H19]、045: [H2]、026: [Hll]、0104: [H4]以及它们的无运动性衍生物。
[0012] 因此，本发明的一个目的是一种用于鉴定怀疑存在于样品中的EHEC的血清型的 方法，其中所述方法包括检测在所述样品或由其分离的DNA中以下大肠杆菌CRISPR序列的 存在或不存在：
[0013] a)用于鉴定EHEC 0157: [H7]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列选自以下的序 列中：
[0014] -CRISPR 序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 3,其中所述 CRISPR SEQ ID NO: 1-3的一个或多个序列的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在；和/或
[0015] -CRISPR序列SEQ ID NO: 4,其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0157: [H7]的 存在；和
[0016] b)用于鉴定EHEC 0145: [H28]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 5,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0145: [H28]的存在；和
[0017] c)用于鉴定EHEC 0111: [H8]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 6,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0111: [H8]的存在；和
[0018] d)用于鉴定EHEC 0121: [H19]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 7,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0121: [H19]的存在；和
[0019] e)用于鉴定 EHEC 0103: [H2]和 / 或 EHEC 045: [H2]的 CRISPR 序列，其中所述 CRISPR序列是序列SEQ ID N0:8,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0103: [H2] 和/或EHEC 045: [H2]的存在；和
[0020] f)用于鉴定EHEC 0104: [H4]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID N0:9,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0104: [H4]的存在；和
[0021] g)用于鉴定EHEC 026: [H11]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 10,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 026: [H11]的存在。
[0022] 根据本发明的优选的实施方案，所述方法包括采用设计用于扩增所述CRISPR序 列的引物对所述样品或由其分离的DNA进行PCR测定，并检查相应扩增产物的存在。
[0023] 优选地，所述PCR测定是采用引物的组合进行的，所述引物的组合包括：
[0024] a)用于检测EHEC 0157: [H7]的引物，其中所述引物由以下组成：
[0025] -靶向两个CRISPR序列SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2的引物组，其中所述引物由 以下序列定义：
[0026] GGGAACACAAACCGAAACACA(SEQ ID NO:11)
[0027] CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID N0:12)和
[0028] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:3的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
[0029] GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(SEQ ID NO:13)；
[0030] CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID NO:14),
[0031] 其中针对所述引物组至少之一的扩增产物的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在； 和/或：
[0032] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:4的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
[0033] GAACACAAACCGAAACACACG(SEQ ID NO:15)
[0034] ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(SEQ ID NO:16),
[0035] 其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在；和
[0036] b)用于检测EHEC 0145: [H28]的引物，其中所述引物由以下组成：
[0037] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:5的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
[0038] GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(SEQ ID NO:17)
[0039] ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(SEQ ID NO:18),
[0040] 其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC 0145: [H28]的存在；
[0041] 和
[0042] c)用于检测EHEC 0111: [H8]的引物，其中所述引物由以下组成：
[0043] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:6的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
[0044] GTGACCGCCTGTACACGC(SEQ ID NO:19)
[0045] CGGATATTTGGGCGTAATACC(SEQ ID NO:20)
[0046] CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(SEQ ID NO:21),
[0047] 其中针对引物对SEQ ID NO: 19和SEQ ID N0:20或SEQ ID NO: 19和SEQ ID N0:21 的至少之一的扩增产物的存在表示EHEC 0111: [H8]的存在；和
[0048] d)用于检测EHEC 0121: [H19]的引物，其中所述引物由以下组成：
[0049] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:7的引物组，其中