一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重pcr检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物病毒学领域，具体涉及一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]水稻是我国主要的粮食作物之一，但病毒病的发生常影响其产量。病害严重时，可导致整个田块失收，给农业带来了巨大损失。因此，对危害水稻的病原进行快速准确的检测和诊断在农业生产实践上具有应用意义。
[0003]水稻瘤矮病毒(Ricegall dwarf virus, RGDV)、水稻齿叶矮缩病毒(Rice raggedstunt virus, RRSV)、南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarfvirus, SRBSDV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV )是四种常见的水稻病毒。其中SRBSDV引起的病害首次在广东省阳江市发现，其主要分布在我国南部及越南北部地区，严重影响了水稻产量。目前所知，白背飞風(Sogatella furciferaHorvath)为其主要介体，并以持久性方式传播病毒。水稻感染SRBSDV后，发病植株矮缩、叶片深绿、叶尖扭曲、茎杆上有白色瘤突等症状。RBSDV主要由灰飞虱(Laodelphaxsreiatellus Fallen)持久性传播,能侵染水稻、玉米和小麦等粮食作物,其在水稻上的主要症状表现为植株矮缩、叶片浓绿僵直、发病初期叶脉上有白色条状瘤突。RRSV以褐飞虱(Nilaparvata Iugens)为主要介体并作持久性传播，感病水稻明显矮缩、分蘖增多、叶缘呈锯齿状缺刻、叶脉和叶鞘常伴有不同长度的线状脉肿。RGDV引起的水稻病害，主要影响了我国华南地区的水稻产量，电光叶蝶(Recilia dorsalis)和黑尾叶蝶(Nephotettixcinticeps)是其主要介体。病株的典型特征是叶背或叶鞘长有球状的白色瘤状突起，且植株矮缩明显，严重影响水稻产量。
[0004]在田间，水稻不只感染单一的病毒，常以两种或两种以上病原混合侵染，无疑加重了水稻的发病情况，给粮食生产带来了巨大威胁。因此，防止这些病害的发生和蔓延有利于水稻产业的稳步发展。
[0005]目前国内有三重PCR检测SRBSDV、RRSV和RGDV，但未发现同时检测上述四种病毒的报道。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的缺陷，本发明所解决的技术问题在于提供一种同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，利用本发明的方法可以大量检测水稻样品，建立了能够从水稻样品中同时检测RGDV、RRSV, SRBSDV和RBSDV四种病毒复合侵染的多重PCR检测方法，成本低，特异性强，大大缩短了检测时间，为制定科学的病虫害防控体系提供了理论依据。
[0007]本发明的同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法，包括以下步骤: 步骤一，扩增引物的设计； 步骤二，样品总RNA的提取；
步骤三，单重RT-PCR检测；
步骤四，四重RT-PCR优化；
步骤五，四重RT-PCR的灵敏度分析；
其中，步骤一中先下载病毒基因组序列，然后对下载的序列进行同源比对，以RGDV S8、RRSV S8、RBSDV S6和SRBSDV SlO为模板，设计特异引物，利用BLAST在线软件检测特异引物，四种病毒的引物具体如下:
水稻瘤矮病毒的引物为:
上游引物:5 ’ -GTACTCAGACCTGAACGTAGT-3，
下游引物:5’ -CTCAATAGCGATCGCATACC-3’
水稻齿叶矮缩病毒的引物为:
上游引物:5 ’ -CGCCGTATCTAACGTTCCAG-3’
下游引物:5’ -TGCCGCGACATAATCAAC-3’
南方水稻黑条矮缩病毒的引物为:
上游引物:5 ’ - CGCGTCATCTCAAACTACAG-3 ’
下游引物:5’ -TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3’
水稻黑条矮缩病毒的引物为:
上游引物:5 ’ -AATGCCACTTGCCAGTTACG-3，
下游引物:5’ -GCTACTTCGTCAGTTAGATC-3’。
[0008]优选地，步骤二中的具体步骤如下:
(O分别剪取病害症状明显的水稻叶片约0.2g，液氮研磨后加入800 μ I Trizol和400 μ I的氯仿:异戊醇后转入2.0ml离心管涡旋混匀，其中，氯仿:异戊醇=24:1 ;
(2)4°C下12000rpm离心15min,取上清液于新的1.5ml离心管中加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于_20°C下20min ；
(3)然后4°CT 12000rpm 离心 1min,弃上清；
(4)加入75%的预冷的乙醇，4°C下7500rpm离心5min,室温晾干沉淀后加入10ul无RNase的水溶解，_20°C保存备用或继续下游实验。
[0009]优选地，步骤三中的单重RT-PCR检测包括以下步骤:
(1)一步法RT-PCR扩增:PCR反应体系为:20ul反应体系中，2X1 step buffer10.0ul，PrimeScript I step Enzyme Mix 0.5ul，RGDV、RRSV、SRBSDV 和 RBSDV 各 Iul 上下游引物混合物和1.0ul RNA模板，最后补水至20ul ；
PCR 反应参数为:50°C反转录 30min，94°C预变性 2min;然后 94°C 30s, 55°C 30s, 72°Clmin，共35个循环；最后在72°C延伸lOmin，降温至10°C结束反应；
(2)PCR产物电泳检测:取6ul PCR产物与Iul 6X loading buffer相混合，室温下进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压100V，时间40min，电泳结束后于凝胶成像系统观察电泳结果；
(3)电泳结果分析:分别得到RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV的扩增条带，依次约为244bp、397bp、682bp和lOOObp，其大小与理论值相符。
[0010]其中，步骤四的四重RT-PCR优化包括以下步骤: (O引物浓度比例的优化:设置了 4个引物浓度组合:
第一组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各1umoI/L)均为0.125umol/L ；
第二组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.2、0.125,0.125 和 0.25umol/L ；
第三组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.2、0.125,0.125 和 0.3umol/L ；
第四组:RGDV、RRSV、SRBSDV和RBSDV上下游引物混合物(各10umol/L)分别为0.25、0.25,0.25 和 0.3umol/L ；
按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应；
(2)DNA聚合酶用量的优化JfTaqDNA聚合酶的用量设为四个梯度:2.5U、4U、5U和6U四个梯度，按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应；
(3)退火温度的优化:最后对退火温度进行优化，从52°C到62°C每1°C为一个梯度，按照单重RT-PCR检测方法，进行多重RT-PCR反应。
[0011]进一步的，在步骤四中，根据优化的结果，多重PCR最佳反应体系为:2X1 stepbuffer 10.0ul, RGDV、RRSV、SRBSDV 和 RBSDV 引物的终浓度依次为:0.2、0.125,0.125 和
0.25 umol/L, PrimeScript I step Enzyme Mix 2.5U,退火温度为 58°C, RNA模板为 1.0ul,最后补水至20ul ;最后PCR反应条件为:50°C反转录30min，94°C预变性2min ;然后94°C30s, 58°C 30s, 72°C lmin，共35个循环；最后在72°C延伸lOmin，降温至10°C结束反应。
[0012]优选地，步骤五中，取浓度相当的四种病毒总RNA等体积混合在一起作为复合模板，测其含量后作5倍梯度稀释，共7个浓度梯度，采用步骤四中优化的方法，进行多重PCR扩增以检测其敏感性。
[0013]相比于现有检测方法，本发明同时检测水稻四种病毒的一步法多重PCR检测方法具有以下优势:本发明能有效的检测水稻4种病毒，快速准确，稳定性好，特异性强，避免了PCR的重复检测，减少了工作量，实现了水稻多种病毒的高效快速检测，有利于研究田间4种病害的发生程度，在农业生产上具有重要的指导意义。
【附图说明】
[0014]图1为四种病毒引物PCR检测特异性电泳图谱，M:DL2000 DNA分子量标准；1、3、5、7依次为:RGDV、RRSV、SRBSDV、RBSDV ;2、4、6、8分别为相对应的阴性对照。
[0015]图2为四种病毒引物浓度优化图谱，M:DL2000 DNA分子量标准；1_4依次为:第一组、第二组、第三组、第四