)，皮下免疫400yg/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接 ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50000进行，最终采血制备抗血清， 并准备纯化。抗体纯化：将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血 清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需 纯化抗体，立即在PBS中进行4°C透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。抗体鉴定：通 过ELISA检测纯化抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定，并 通过SDS-PAGE电泳，纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度 (图 7)。
[0057] 结论：获得高质量的AlVg蛋白特异性肽链抗体，其效价大于512, 000,抗体的浓度 0. 46mg/ml，抗体纯化后纯度在95 %以上。
[0058] 实施例6 :Western杂交验证
[0059] 绿盲蝽饲养：绿盲蝽虫源米自江苏省大丰市豌豆田，在室内用四季豆（Phaseolus vulgarisL.)豆荚继代饲养，成虫期补充10%蜂蜜水，饲养条件为温度（25±1)°C，相对湿 度70% ±5%，光周期L:D= 12 : 12。取绿盲蝽7日龄成虫，提取蛋白开展Western杂 交实验。
[0060] Western杂交样品使用30头雌成虫所提取的蛋白样品，总蛋白提取使用南京 钟鼎生物技术有限公司的总蛋白提取试剂盒。总蛋白的浓度测定参考Bicinchoninic acid(BCA)法，并稍加改进。Western杂交流程根据Towbin等人的实验方法做了稍许的改 动。蛋白样品在10%的SDS凝胶中电泳分离，在Tris-HCl缓冲液，100mA的电流中转膜3h， 将蛋白质转移到NC膜上。NC膜在含有5%的脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中37°C封闭lh。AlVg 蛋白特异性肽链抗体1 : 1000稀释，37°C孵育NC膜lh，TBS-T缓冲液洗3次，每次5min。 羊抗兔的酶标二抗1 : 5000稀释，37°C孵育NC膜lh，TBS-T缓冲液洗3次，每次5min。最 后通过化学发光试剂盒（GEHealthcare)进行显色，结果见图8。
[0061] 结论:AlVg蛋白特异性肽链抗体可以用于Western杂交分析AlVg蛋白的表达情 况，其杂交出的单一条带在210-220kDa之间，与AlVg蛋白预测分子量一致。
[0062] 实施例7 :绿盲蝽生育期AlVg基因表达谱构建
[0063] 绿盲蝽处理：绿盲蝽饲养方法参照实施例6,其整个生育期取样为，1-5龄若虫、 1-9日龄雌、雄成虫，每个样品取5头绿盲蝽样品，重复5次，共计25头，RNA提取方法及反 转录方法参照实施例1。
[0064] 本研宄所用荧光定量引物，分别为AlVg基因引物AlVg-4F^-AGACCGTCATGCTCG GAGAT-3')及AlVg-4R(5' -CTGGGAITGGGAGGGACA-3')，和绿盲蝽内标持家基因 0-actin 引物Al-0-actin-lF(5' -ACCTGTACGCCAACACCGT-3'）及Al-0-actin-lR(5'-TGGAGAG AGAGGCGAGGAT-3')。荧光定量PCR试验所用试剂采用SYBRPremixExTaqKit(TaKaRa公 司，东京，日本），仪器为iCycleriQ(Bio-Rad)，分析软件为version3. 0a(Bio-Rad)。焚光 定量PCR反应以RNase-free水（TaKaRa,Tokyo,Japan)为阴性对照，每个样品5次重复，反 应条件为3步法。？〇?反应参数为：94°0 51^11;941：208,50-601：208,721：308,40个循环； 72°C继续延伸 10min;PCR反应体系为：SYBRPremix12.5yl，1.25yl10yM上游引物， 1. 25y1 10yM下游引物，起始cDNA上样量均为80ng，加ddH20至25y1。AlVg基因不同生 育期相对表达量变化以2_AAet法计算，相对表达量差异显著性分析采用统计软件SAS(SAS v8. 0)中的Tukey氏新复极差法。
[0065] 结论：绿盲蝽7日龄雌成虫体内AlVg基因的表达量显著高于其它生理时期 (P〈0. 01)(图9)，可以利用此结果深入研宄，绿盲蝽取食不同寄主后的表达量差异，以及与 单雌产卵量的相关性。
[0066] 实施例8 :不同寄主饲养下绿盲蝽AlVg蛋白表达量差异及其与产卵量的相关性
[0067] 绿盲蝽处理：绿盲蝽饲养方法参照实施例6,设定5种寄主，分别为四季豆、茼蒿、 国抗19Bt棉，泗棉3号及常规棉，从卵始养殖绿盲蝽至7日龄雌成虫采样分析AlVg蛋白表 达量差异，剩下的雌成虫分别统计每种寄主下的单雌产卵量。
[0068] Western杂交步骤相见实施例6,AlVg蛋白Western杂交抗体利用本专利发明 的AlVg蛋白特异性肽链抗体，而绿盲蝽内标|3 -actin蛋白的Western杂交抗体使用的 老鼠0-actin蛋白抗体购于南京钟鼎生物技术有限公司，免疫杂交后的光密度分析通过 desktopscanner(HanwangE60)和ImageJfreesoftware。AlVg蛋白水平的表达量变 化程度，根据QuantityOne软件通过计算Western杂交后AlVg蛋白条带的光密度值与 |3 -actin蛋白条带的光密度值的比值比较鉴定，本发明的Western杂交实验重复3次。盲 蝽取食不同寄主植物后，AlVg蛋白相对表达量，即AlVg蛋白/f3 -actin蛋白后的差异以及 单雌产卵量差异显著性分析采用统计软件SAS(SASv8.0)中的Tukey氏新复极差法。具体 结果见图10,表1，2。
[0069] 表1不同寄主饲养绿盲蝽后的单雌产卵量
【主权项】
1. 一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -种绿盲蝽卵黄原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3.-种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO: 3所示。
4. 一种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所 不〇
5.含有权利要求3所述的用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列的重组表 达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求3所述的DNA序列插 入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的重组表达载体。
7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为 pCznl〇
8. -种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求5或6所述的重组表达载 体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
9.权利要求3所述的DNA序列、权利要求5所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转 基因重组菌在生产绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链抗体中的应用。
10. -种绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的PCR扩增，所述绿盲蝽卵黄原蛋白特异 性肽链cDNA序列如SEQ ID NO :3所示； 2)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的原核表达载体构建； 3)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的变性和复性； 4)、绿盲蝽卵黄原蛋白特异性肽链的纯化即得。
【专利摘要】本发明公开了一种用于编码绿盲蝽卵黄原蛋白的DNA序列。本发明还公开了一种可利用Western-blot检测AlVg蛋白表达量的特异性多肽序列，利用此多肽特异性的分析绿盲蝽体内AlVg在蛋白水平上的差异表达。本发明还构建了雌成虫羽化后日龄与AlVg表达趋势的图谱。通过调查各种寄主植物持续饲养后，雌成虫体内AlVg基因、蛋白的表达量及单雌产卵量的相关性，构建相关预测模型对于预测绿盲蝽产卵潜力具有很大的意义。本发明明确了羽化后7天绿盲蝽雌成虫AlVg的表达量与单雌产卵量呈现正相关的关系，此发明可以用于田间对于绿盲蝽种群动态的测报工作，同时可为利用Vg为绿盲蝽田间种群监控新技术的研发提供基础。
【IPC分类】C12R1-19, C07K14-435, C12N15-70, C12N1-21, C12N15-12
【公开号】CN104711265
【申请号】CN201510166980
【发明人】孙洋, 肖留斌, 柏立新, 谭永安, 赵静, 戴瀚洋
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月9日