2] gRNA2上游引物gRNA2-R(如SEQ ID NO. 7所示）：
[0053] 5'-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACACGGACC CTGCAAACCTGG-3'
[0054] 2) PCR扩增插入片段
[0055] PCR体系：上游引物gRNAl-F(10 y M) 5 y 1，下游引物gRNAl-R(10 y M) 5 y 1，pfu酶 (康为世纪）l〇y 1。
[0056] PCR程序：94°C 5分，72°C 3分，68°C 3分，64°C 3分。
[0057] 胶回收lOObp大小的gRNAl插入片段二。
[0058] 用上述方法获得100bp大小的gRNA2插入片段三。
[0059] 3、分别将片段二和片段三连入gRNA空载体
[0060] 使用无缝克隆试剂盒（Biomiga)分别将片段一和片段二连接构建gRNAl质粒，片 段一和片段三连接构建gRNA2质粒。具体操作步骤参考试剂盒说明书。将连接产物转化 DH5a大肠杆菌（康为世纪），在含有kana(50yg/ml)的平板尚均匀涂布，16小时后PCR筛 选阳性克隆菌，挑取克隆，37°C摇菌16小时，抽提质粒。
[0061] 4、测序
[0062] 将抽提的质粒送三博远志公司测序，测序结果证实序列正确。
[0063]gRNAl序列：如SEQ IDNO. 8 所示。
[0064]gRNA2 序列：如SEQ IDNO. 9 所示。
[0065]gRNA活性验证
[0066] 1、细胞培养
[0067] 小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1培养于37°C，5%C02的恒温培养箱中。使用2. 5% EDTA胰酶（Gibco)消化细胞，加入适量培养液反复吹打混匀细胞，离心后接种到6孔板中， 细胞密度融合到80 %转染质粒。
[0068] 2、gRNAl和gRNA2分别和Cas9质粒共转染细胞
[0069]Cas9质粒购买于addgene公司，启动子为真核生物强启动子CMV。其Cas9及核定 位信号相关序列如SEQIDNO. 10所示。
[0070]使用lipofectamine3000 转染试剂（Invtrogen)将Cas9 和gRNAl(gRNA2)各 1yg 转染到MC3T3-E1中。具体方法参照说明书。24小时加入1000ng/ml浓度的G418筛选， 72小时后收集剩余的活细胞，使用通用型柱式基因组提取试剂盒（康为世纪）提取基因组 DNA〇
[0071] 3、从基因组DNA中PCR扩增包括GGCX靶点的片段
[0072]GGCX靶点上游引物GGCX-F(如SEQ ID NO. 11所示）
[0073] 5'-CTTGTTCTGAAAACTGTC-3'
[0074] GGCX靶点下游引物GGCX-R(如SEQ ID NO. 12所示）
[0075] 5'-TTATCAGAGTAATAGAAAGC-3'
[0076]PCR扩增产物预计913bp
[0077]PCR反应体系：ES TaqmaterMix(康为世纪）10 y 1，GGCX-F引物1 y 1，GGCX-R弓丨 物1 y 1，基因组DNA模板100ng，dH20补至20 y 1。
[0078]PCR反应条件：预变形94°C5分，变形94°C30秒，退火55°C30秒，延伸72°C1分， 35个循环，终延伸72°C5分。
[0079] 测序验证活性
[0080] 将PCR产物送公司测序，结果显示两条设计的gRNA在各自靶点处都出现套峰，表 明两条gRNA都具有活性。测序套峰结果图见附图2。
[0081]四、构建CMV-Cas9_gRNA
[0082] 1、酶切Cas9质粒
[0083] 使用SexAI内切酶（Thermo)单酶切Cas9质粒，胶回收片段四，去磷酸化酶 (Takara)使切口去磷酸化。
[0084] PCR扩增gRNA片段
[0085] 设计引物序列如下：
[0086]SexAI-gRNA(如SEQIDNO. 13 所示）：
[0087] CATACCAGGTATTCGCCCTTTGTA
[0088]gRNA-SexAI(如SEQIDNO. 14 所示）：
[0089]TGAACCTGGTTAATGCCAACTTTGTA
[0090]XhoI-gRNA(如SEQIDNO. 15 所示）：
[0091] CATCTCGAGATTCGCCCTTTGTA
[0092]gRNA-XhoI(如SEQIDNO. 16 所示）：
[0093]TGACTCGAGTAATGCCAACTTTGTA
[0094] 2) PCR扩增及酶切
[0095] 使用pfu酶分别以gRNAl和gRNA2为模板，以SexAI-gRNA和gRNA-SexAI为引 物PCR扩增片段。扩增的gRNAl和gRNA2片段两端添加了SexAI酶切位点。片段回收后 使用SexAI内切酶酶切后，胶回收片段SexAI-gRNAl-SexAI片段五和SexAI-gRNA2_Sex AI片段六。
[0096] 以gRNAl为模板，SexAI-gRNA和gRNA-XhoI为引物PCR扩增片段。扩增的片段 在gRNAl上游添加SexAI，下游添加XhoI。片段回收后使用SexAI和Xhol内切酶酶切 后，胶回收片段七SexAI-gRNAl-XhoI。
[0097] 以gRNA2为模板，XhoI-gRNA和gRNA-SexAI为引物PCR扩增片段。扩增的片 段在gRNA2上游添加XhoI，下游添加SexAI。片段回收后使用SexAI和Xhol内切酶酶 切后，胶回收片段八XhoI-gRNA2-SexAI。
[0098] 使用T4连接酶（NEB)分别将片段四与片段五连接构建CMV-Cas9-gRNAl; 片段四与片段五连接构建CMV-Cas9-gRNA2 ;片段四与片段六和片段七连接构建 CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2〇
[0099] 将连接产物转化DH5 a大肠杆菌，在含有AMP (100 μg/ml)的平板尚均匀涂布，16 小时后PCR筛选阳性克隆菌，挑取克隆，37°C摇菌16小时，抽提质粒。
[0100] 测序
[0101] 将抽提的质粒送公司测序，测序结果表明插入序列完全正确。三个质粒示意图见 附图3。
[0102] 检测基因敲除效率
[0103]1、验证活性
[0104] 1)将CMV-Cas9-gRNAl，CMV-Cas9-gRNA2,CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2 三个质粒转染到 MC3T3-E1中，24小时加入1000ng/ml浓度的G418筛选，72小时后收集剩余的活细胞，提取 基因组DNA。
[0105] 2)从基因组DNA中PCR扩增包括靶点的片段
[0106] 3)测序
[0107] 将PCR产物送公司测序发现CMV-Cas9-gRNAl，CMV-Cas9-gRNA2在各自的靶点上出 现套峰，CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2在两个靶点上都出现套峰。表明设计三个质粒都能有效敲 除GGCX。详细信息见附图4。
[0108] 2、检测基因敲除效率
[0109]1)将CMV-Cas9-gRNAl，CMV-Cas9-gRNA2,CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2 三个质粒转染到 MC3T3-E1中，72小时后收集细胞，提取基因组DNA。
[0110] 2)从基因组DNA中PCR扩增包括靶点的片段，胶图可见CMV-Cas9-gRNAl， CMV-Cas9-gRNA2条带与对照相比变小，CMV-Cas9-gRNAl，CMV-Cas9-gRNA2可以见到多条 带，结果也证实三个质粒能够剪切GGCX。胶图见附图5。
[0111] 3)从基因组DNA中PCR扩增包括靶点的片段，使用快速DNA产物纯化试剂盒（康 为世纪）回收所有PCR产物，连接到pMd-20T载体（Takara)中，涂布在含有AMP(100yg/ ml)，X-gal(20mg/ml)，ITPG(lmM)琼脂糖平板上培养16小时，挑取至少20个白色克隆摇菌。 37°C摇菌16小时，抽提质粒。
[0112] 4)质粒送公司测序，测序结果表明CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2转染细胞后剪切效率 为 83. 3% (20/24)，明显高于Cas9-gRNAl的 65% (15/23)和Cas9-gRNA2 的 56% (14/24)。 CMV-Cas9-gRNAl-gRNA2基因敲除效果最高，因此选择该系统进行下一步实验。详细信息见 附图6。
[0113] 六、条件性基因敲除质粒0SX-Cas9-gRNA构建
[0114] 1、从小鼠基因组中PCR扩增出小鼠osterix启动子，在上游引物添加MluI酶切 位点，在下游添加Nhe