序列，包括信号肤序列、转录终止序列、增强子序列等，优 选地，本发明的载体为真核细胞载体。优选地，本发明的载体为来自用于抗体真核表达的 的抑载体，其包含了CMV的启动子、内部核糖体进入位点序列（Internalribosomeentry site,IRESXDHFR筛选标记等元件。氨甲噪岭（MTX)是DHFR的抑制剂，可阻碍其作用。当 细胞培养基内含有MTX时，DHFR被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带其上下 游基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可提高目的蛋白的表达量。
[0050] 在本发明的另一方面，涉及包含有所述载体的宿主细胞，用于表达所需的多功能 抗体多肤。"宿主细胞"包括单个的细胞或细胞培养物，其能够并且已经接受包含插入的多 核巧酸的载体。
[0051] 与使用的载体相适应，本发明的宿主细胞可W是任意的原核宿主细胞或真核宿主 细胞。真核宿主细胞，包括酵母、昆虫细胞、植物细胞，哺乳动物细胞等可W是优选的，因为 真核细胞存在复杂的目的蛋白的翻译后修饰(例如糖基化)，越来越多的被用于规模化的培 养。常用的宿主细胞系包括猴肾细胞（C0S-7ATCCC化1651)、人胚胎肾细胞293及其亚克 隆细胞系，幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC(XL10)，中国仓鼠卵巢细胞（CH0)等。优选地，本发明 的真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0052] 本发明还包括特异性识别pro-抓NF前体结构域的一种或多种抗体多肤在制备减 缓和/或抑制选自如下慢性疼痛的药物中的应用：慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼 痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、H叉神经 痛、偏头痛，复杂区域疼痛综合症，及其组合。
[0053] 本发明还包括特异性识别pro-BDNF前体结构域的第19-128位氨基酸的一种或多 种抗体多肤在制备减缓和/或抑制选自如下急慢性疼痛的药物中的应用：手术后疼痛，急 性炎性疼痛，慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性 内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、H叉神经痛、偏头痛，复杂区域疼痛综合症，及其 组合。
[0054] 本发明还包括包含所述抗体多肤的药物组合物。该组合物还可W包含药学上可接 受的载体。药物组合物可W通过常规途径给药，其中包括但不限于静脉内，腹腔内注射等。 本发明的药物组合物还可W与其他的疼痛抑制/预防剂合并使用。
[0055] 本发明所述的药物、化合物或药物组合适用的"有效量"是指足W产生有益的和所 需的结果的量，所述结果包括减轻或减少痛感的临床结果。有效量可W通过一次或多次给 药来进行。为本发明的目的，有效量是指足够治疗，减轻，减少，抑制疼痛的强度和/或预防 疼痛的量。如同在临床条件下所理解的，有效量的药物可W连同或不连同另外一种药物可 获得。因此，"有效量"可W被认为在给药一种或多种药剂的条件下进行，如果在与一种或多 种其他药剂一同给药时可W获得或已经获得了所需的结果，则该单一种药剂可W认为是被 有效量给药了。具体的剂量应当考虑给药途径，病人状况等因素来决定，该些是熟练医师的 技能范围之内的。
[0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，该些实施例仅用于说明本 发明而不能用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New化rk:ColdSpringHarbor L油oratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件实施。
[0057] 实施例1;人pro抓NF抗原的原核表达 1. 1祀T2化-pro抓NF载体构建及鉴定 W人肿瘤细胞U87MG的cDNA为模板(购自RAYGE肥公司），W如下引物进行PC扩增，PR0BDNF-F;5'GCGAATTCCCCATGAAAGAAGCAAACATCC3'(沈QIDNo: 15) PR0BDNF-R;5'CCGCTCGAGTTATCTTCCCCTTTTAATGGTCAATG3'（沈QIDNo: 16) 获得两端带有酶切位点ECORlAhoI的PRO抓NF基因片段（703bp)，用ECORlAhoI双 酶切（购自肥B公司），得到目的基因片段pro抓NF。将载体质粒祀T2化（购自Novogen 公司。）用ECORlAhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段，与前述目的基因片段 pro抓NF在T4连接酶(购自肥B公司）作用下连接，然后转化大肠杆菌T0P10 (购自LI阳公 司），经氨予抗性进行筛选，经ECORlAhoI酶切鉴定含插入片断的阳性克隆，并通过测序验 证，得到含有正确的人pro抓NF基因序列的原核表达质粒祀T2化-pro抓NF。
[005引人pro抓NF蛋白的表达与纯化 将祀T2化-pro抓NF质粒转化于表达宿主菌化21 (DE3)(购自Novagen公司），并平铺 于氨予青霉素抗性的平皿上37C倒置培养过夜，挑取单克隆进行诱导表达，挑取单克隆后 振荡培养至ODe。。为0. 6-0. 8,加入终浓度为1mlIPTG，3(TC诱导化后收集菌液。通过离 也收集沉淀，加入1/10体积的缓冲液A(50mM化&?04，300mM化C1，lOmM咪哇，pH8. 0)重 息，加入PMSF(终浓度为1ml)置冰上超声（超声3砂，间隔10砂，一轮99次，共4轮）， 离也（4°C，12000g)15min，离也收集上清，通过Ni-NTAAgarose(购自QIAGEN公司）亲和柱 层析，纯化得到目的表达蛋白，然后对PBS溶液进行透析，再通过12%SDS-PA(iE分析透析后 的纯化蛋白的纯度，A280检测其含量，并取少量进行SDSPAGE电泳检测其分子量。如图1 所示的SDS-PAGE结果显示第一栏中纯化得到的目的条带分子量在30kD附近，该分子量与 pro抓NF分子的理论分子量27. 8kD基本符合。
[0059] 实施例2;人proBDNF前体结构域（人proBDNFpro-domain)的真核表达 2. 1人proBDNF前体结构域表达载体V5F-pr〇-domain的构建 W上述得到的质粒祀T2化-pro抓NF为模板，W下列引物进行PCR扩增， 抓NFproVFl5，gctggctagcAcccatgaaagaagcaaacatccgag3，（沈QIDN0:17) 抓NFproVRl 5, CCGCTCGAGGTGGCGCCGGACCCTCATG 3，（沈Q ID NO: 18) 获得两端带有酶切位点化elAhoI的人pro抓NF前体结构域基因片段（350bp)。将该PCR片段用限制性内切酶化elAhoI(购自肥B公司）进行双酶切，获得的前体结构域基因 片段和经同样化elAhoI(购自肥B公司）双酶切的载体V5F(购自RAYGE肥公司）通过T4 DNA连接酶连接后，转化于宿主菌T0P10(购自LI阳公司）中，挑取阳性克隆进行PCR鉴定， 并通过测序验证正确，成功构建V5F-pr〇-domain质粒。
[0060] 人proBDNF前体结构域蛋白的表达与纯化 将生长良好的肥K293F细胞（肥K293F，购自LI阳公司）WlXl〇6细胞/毫升的 密度接种于细胞H角培养瓶，37°C，5%C〇2 12化pm培养过夜备用；将上述步骤获得的 V5F-pr〇-domain质粒与脂质体（293化ctin，购自LI阳公司)分别用DMEM稀释并温和混合， 室温赔育20min，将赔育好的DNA-脂质体复合物加至肥K293F细胞中，37°C5%CA120巧m 培养72h。收集细胞培养液，4500g离也15min，除去细胞取上清。取1ml的FLAG抗体亲和 填料（ANTI-FLAGAgaroseAffinityGel,购自Sigma-Al化ich公司)装柱，将FLAG亲和柱 用裂解缓冲液（50mMPB，0. 3M化C1，5%甘油)平衡5-10个柱体积。将离也后的细胞培养液 上清WIml/min通过化AG亲和柱收集流穿液4°C保存。用清洗缓冲液1 (50mMPB，抑7. 8， 0. 3M化C1，5%甘油）洗5-10个柱体积，收集洗杂液1，于4°C保存。用清洗缓冲液2 (50mM PB，pH7.8，0.5M化Cl，5%甘油)洗4-5个柱体积，收集洗杂液2，于4°C保存。用洗脱缓 冲液（50mMGlycine.肥l，p册.0，0.3M化Cl，5%甘油）洗4-5个柱体积，收集洗脱液加 入中和缓冲液（1MTris.肥1P服.0)，在透析液（50mMPB，pH7. 8,0. 3M化Cl，5%甘油）中 4C透析过夜，保存，并取少量进行SDSPAGE电泳。如图2所示的电泳结果显示第一栏的 目的条带的分子量在20kD左右，略大于人pro抓NF前体结构域蛋白的理论分子量13kD相 当。不限于理论所表示的，该可能与表达的目的蛋白在真核系统中的糖基化程度有关。
[00川实施例3;大鼠pro抓NF前体结构域融合蛋白（大鼠pro抓NFpro-domain-Fc)的 真核表达 3. 1大鼠proBDNF前体结构域融合表达载体V5FC-rat-pr0-domai-Fc的构建 W大鼠cDNA(购自RAYGE肥公司）为模板，W下列引物进行PCR扩增， Ra1:p;roFl5'GCTGGCTAGCgcgcccatgaaagaagcaaac3'(沈QIDN0:19) Ra化roRl5，CCGCTCGAGGCGCCGAACCCTCATAGACATG3，（SEQIDNO: 20) 获得两端带有酶切位点化el/BamHI的大鼠pro抓NF前体结构域基因片段（356bp)。将 该PCR片段用限制性内切酶化el/BamHI(购自N邸公司）进行双酶切，获得的前体结构域 基因片段和经同样化el/BamHI(购自肥B公司）双酶切的化融合表达载体V5FC(购自 RAYGE肥公司)通过T4DNA连接酶连接后，转化于宿主菌T0P10(购自LI阳公司）中，挑取 阳性克隆进行PCR鉴定，并通过测序验证正确，成功构建V5FC-rat-pr0-domain质粒。
[0062] 大鼠proBDNF前体结构域融合蛋白的表达与纯化 将生长良好的肥K293F细胞（肥K293F，购自LI阳公司）W1X106细胞/毫升的 密度接种于细胞H角培养瓶，37°C，5%C02 12化pm培养过夜备用；将上述步骤获得的 V5FC-rat-pr〇-domain质粒与脂质体（293化ct