<0. 05);而化CAM-GM-CSF 重组蛋白负载DC诱导的CTL，杀伤效率显著高于化CAM蛋白负载DC诱导的CTL(P<0. 05)及 裂解物负载DC诱导的CTL(P<0. 01)。
[0105] 口)invivo实验结果；效应细胞杀伤实验；瘤周注射化CAM-GM-CSF-C化，肿瘤杀伤 效率显著高于对照组（P<〇. 001)，明显高于化CAM-DCVAC组和lysate-DCVAC组（P<0. 05; respectively;图9)。本专利的技术创新在于；
[0106] 1.首次提出应用化CAM作为腺癌特异性抗原，诱导腺癌特异性细胞免疫治疗；
[0107] 2.首次制备出化CAM-GM-CSF基因重组蛋白；
[010引 3.该重组蛋白兼顾了化CAM的特异性W及GM-CSF的免疫活化功能，使应用该重组 蛋白诱导的细胞免疫杀伤更加高效。
[0109] 本发明的应用还在于：
[0110] ①、化CAM-GM-CSF重组蛋白疫苗的制备：应用本发明的融合蛋白，制备溶液，直接 皮内、皮下接种，或静脉输注，或通过病毒、非病毒、纳米等载体转导入人体，通过体内DC摄 取并激活T淋己细胞，诱导化CAM抗原特异性C化，并对表达化CAM抗原的肿瘤细胞产生特 异性免疫杀伤。
[0111] ②、腺癌特异性DC疫苗的制备；应用本发明的融合蛋白，负载肿瘤病人或健康人 外周血、骨髓、组织或器官等所获得的自体或异体DC细胞，在相关细胞因子参与下，经过一 定时间培养收获DC疫苗。其特征在于，该DC疫苗能激活自体或异体T细胞，诱导腺癌特异 性C化，并对表达化CAM抗原的腺癌细胞产生特异性免疫杀伤。
[0112] ⑨、EpCAM抗原特异性DC疫苗的制备；应用本发明的融合蛋白，负载肿瘤病人或健 康人外周血、骨髓、组织或器官等所获得的自体或异体DC细胞，在相关细胞因子参与下，经 过一定时间培养收获DC疫苗。其特征在于，该DC疫苗能激活自体或异体T细胞，诱导化CAM 抗原特异性C化，并对表达化CAM抗原的肿瘤细胞产生特异性免疫杀伤。
[0113] ④、化CAM抗原特异性肿瘤细胞疫苗的制备；应用本发明的融合蛋白，对各种化学 或物理方法灭活的肿瘤细胞进行负载、融合或转染，制备成化CAM高表达的肿瘤细胞疫苗。 其特征在于，该肿瘤细胞疫苗能激活自体或异体T细胞，诱导化CAM抗原特异性CTL，并对表 达化CAM抗原的肿瘤细胞产生特异性免疫杀伤。
[0114] ⑥、腺癌特异性CTL效应细胞的制备：应用本发明的融合蛋白，负载自体或异体DC 细胞，制备成DC疫苗，在相关细胞因子参与下，与各种来源的自体或异体T细胞共培养，审U备成腺癌特异性CTL效应细胞制剂。其特征在于，该效应细胞制剂能特异性杀伤腺癌细胞。 [011引⑧、化CAM特异性CTL效应细胞的制备：应用本发明的融合蛋白，负载自体或异体 DC细胞，制备成DC疫化在相关细胞因子参与下，与各种来源的自体或异体T细胞共培养， 制备成化CAM特异性CTL效应细胞制剂。其特征在于，该效应细胞制剂能特异性杀伤表达 化CAM抗原的肿瘤细胞。
【附图说明】：
[011引图1PCR扩增获得的目的基因片段
[0117] Lanel:EpCAM
[0118] Lane2,3:hGM-CSF
[011引图2菌体PCR结果。W菌落为模板同时扩增化CAM和hGM-CSF;第一排为hGM-CSF的扩增电泳图；第二排为化CAM的扩增电泳图
[0120] 图3双酶切鉴定结果。Lanel-4用SalI和化0I酶酶切；Lane7-12用化0I和 SalI酶酶切；Lanel3-17用化0I和化0I酶酶切
[0121] 图4SDS-PAGE鉴定化CAM-hGM-CSF融合蛋白诱导表达
[0122] 4a:Lanel:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta未诱导前；
[0123] Lane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后；
[0124] Lane3:蛋白Marker;
[01 巧]4b:Lanel:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后包涵体中表达；
[0126] Lane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中表达；
[0127] Lane3:蛋白Marker;
[0128] 箭头位置指示诱导后表达的化CAM-hGM-CSF融合蛋白。
[0129] 图5化CAM-hGM-CSF融合蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定
[0130] LanelLane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中表达；
[0131] Lane3Lane4:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中的融合蛋白纯化 后；Lane5:蛋白Marker;
[0132] 图6Westernblot鉴定化CAM-hGM-CSF融合蛋白
[0133] Lanel:蛋白Marker;
[0134] Lane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta未诱导前；
[01 巧]Lane3:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后；
[0136] Lane4:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中表达；
[0137] Lane5:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后包涵体中表达；
[0138] Lane6Lane7:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中的融合蛋白纯化 后表达。
[0139] 图7效祀比为10:1时，化CAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL的杀伤效率
[0140] 化CAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL杀伤，明显高于化CAM蛋白（P<0. 05) 及细胞裂解物负载DC所诱导的CTL杀伤（P<0. 01)。
[014。 图8效祀比为20:1时，EpCAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL的杀伤效率
[014引化CAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL杀伤，明显高于化CAM蛋白（P<0. 05) 及细胞裂解物负载DC所诱导的CTL杀伤任<0.01)。效祀比为20:1时，杀伤效率显著高于 10:1更佳。
[0143] 图9化CAM-GM-CSF-CTL的肿瘤杀伤效率
[0144] 化CAM-GM-CSF-CTL对肿瘤的杀伤效率，显著高于化CAM-CTL和Lysate-CTL(P<0. 0 5,respectively)
【具体实施方式】：
[0145]W下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0146] 实施例1
[0147] 1.实验材料
[014引1.1质粒；
[0149]质粒pORFhGM-CSF购自Invivogen;质粒祀T-30a购自Novagen。
[0巧0] 1.2主要试剂；
[0151] 质粒提取试剂盒W及胶回收试剂盒均购自上海生工；NiSe地aroseTM6Fast Flow购自GE。
[0152] 2.实验方法；
[0153] 2. 1构建重组化CAM-GM-CSF融合蛋白表达质粒
[0154] 2. 1. 1引物的设计与合成；
[0巧日]根据质粒祀T-30a的酶切位点，W及NCBI所提供的化CAM基因序列，及质粒pORFhGM-CSF所提供的基因序列，分别设计化CAM和hGM-CSF基因的上下游引物；
[0156]化CAM上游引物序列为；5'CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT3';下游引物序列 为；5'ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC3';其上下游引物分别引入了限制性内切酶 NcoI和SalI的酶切位点。hGM-CSF上游引物序列为；5'ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC 3';下游引物序列为；5'CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC3';其上下游引物分别引入了限 制性内切酶SalI和化0I的酶切位点。全部引物由上海生工合成。
[0157] 2. 1. 2基因扩增和测序；
[0158] 从腺癌细胞株LS174-T(购自南京凯基）中提取RNA，然后反转为cDNA，WcDNA为 模板，PCR扩增化CAM基因，切胶回收目的片段，将该片段连接至T载体，转化D册a，PCR扩 增鉴定阳性斑，提取阳性斑的质粒并测序。WpORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF 基因，其余步骤同上。全部测序由上海生工完成。
[0159] 2. 1. 3 重组载体祀T-EpCAM-hGM-CSF的构建；
[0160]测序完成后经比对（NCBI)，选取测序正确、连有目的基因片段的T载体进行终载 体构建；用限制性内切酶化0I和SalI酶切测序正确、连有化CAM的T载体，切胶回收 化CAM片段；用限制性内切酶SalI和化0I酶切测序正确、连有hGM-CSF的T载体，切胶 回收hGM-CSF片段；载体祀T-30a用限制性内切酶化0I和化0I，切胶回收载体；然后把 回收的化CAM片段，hGM-CSF片段W及载体用T4连接酶进行连接（具体操作步骤分别按说 明书进行）。
[0161] 2. 1. 4重组载体祀T-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定；
[0162] 化Cl2法制备大肠杆菌感受态D册a，然后将W上连接产物转化感受态大肠杆菌 畑5a，PCR扩增筛选阳性重组载体，对阳性斑进行质粒提取，并进行酶切鉴定。
[0163] 2. 2重组质粒祀T-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta;
[0164] 2. 2. 1取5y1鉴定正确的重组质粒加入到100y1Rosetta感受态细胞中，混匀， 冰上放置30min。
[0165] 2. 2. 242 °C水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
[0166] 2. 2. 3加入900y1LB液体培养基（不含抗性），混匀后37°C振荡培养1小时。 4°C，3000巧m离屯、lOmin。
[0167] 2. 2. 4弃上清，剩余的重悬菌体（约50yl)涂于含卡那抗性的LB固体培养基， 37°C培养12-1化。
[0168] 2. 3重组化CAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达；
[0169] 2. 3. 1挑取LB固体培养基上、经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于含有卡那 抗性的LB液体培养基中，37°C，振摇培养过夜。
[0170] 2. 3. 2次日培养菌液1:50接种于含有卡那抗性的LB液体培养基中，37°C振摇培养 至 0D600 值达 0. 4-0. 6 (约 2.化）。
[0171] 2. 3. 3培养菌液中，取出1ml做诱导阴性对照，将IPTG加入到余下的菌液中（终浓 度0.ImM)，16°C振摇培养4-化后收集菌体。
[017引2. 3. 4诱导后的菌液中，取出1ml，与阴性对照均在4°C，100化pm，离屯、5min。然 后将菌沉分别重悬于lOOyl1XSDS凝胶加样缓冲液中，煮沸lOmin，各取20yl，进行SDS-聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE)。考马斯亮藍染色，脱色，拍照记录，观察诱导情况。
[0173] 2. 3. 5余下的菌液4°C，6000巧m，离屯、20min。弃上清，菌沉-80°C冷冻过夜。
[0174] 2. 4化C