酵液中。
[0095]铝化合物
[0096] 我们已经发现，聚合氯化铝在去除残留宿主细胞DNA中是极其有效的。
[0097] 特别有用的聚合氯化铝包括具有化学式Aln(0H)mCl(3n_m)的化合物和聚合氯化铝 以及具有CAS号：1327-41-9 的氯化轻错（aluminiumchlorohydrate)。
[0098] 有用的聚合氯化错的实例包括轻错基氯化物（luminumchlorohydrate)、可获 自古尔布兰德森公司（Gulbrandsen)的GC85〇?(Al2(OH)5Cl)、或者NordPac18(可获自 诺沃挪第克公司（NordiskAluminatA/S)，丹麦），其为具有经验式（bruttoformula) 八1(011)1，2(：11， 8的铝配合物。具有化学式41(011)1，2(：11， 8的有用的聚合氯化铝的另一个实例是 PAX-XL100 (可获自凯米拉公司（Kemira))。有用的聚合氯化铝的另外两个实例是PAC(可 获自上海浩天水处理设备有限公司（ShanghaiHaotianWaterTreatmentEquipment Co.，Ltd)，以固体形式供应）或PAC(可获自天津市凯瑞特科技有限公司（Tianjin KairuitetechnologyLtd.)，以液体形式供应）。具有化学式A1 (OH) 的有用的聚合 氯化错的另一个实例是PAX18(可获自凯米拉水处理公司（KemiraWaterSolutions)。
[0099] 聚合氯化铝的浓度将通常处于以每千克发酵液（未稀释）计0? 1% -10% (w/w) 的范围内；优选以每千克发酵液（未稀释）计0. 5%-5% (w/w)的范围内。
[0100] 在添加聚合氯化错之后，可以调节pH。pH可以调节至在pH2到pH11范围之内 的pH。可以用本领域中已知的任何酸或碱调节pH。
[0101] 我们要求一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴 趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
[0102] a)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且
[0103]b)从该发酵液中分离絮凝的微生物。
[0104] 也可以在已经将该微生物从该发酵液中分离之后添加聚合氯化铝；因此我们还要 求：
[0105] -种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白 质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：
[0106]a)从该发酵液中分离该微生物，并且
[0107]b)将聚合氯化铝添加至该发酵液。
[0108] 还可以按照两个步骤或更多个步骤添加聚合氯化铝，例如在将该微生物从该发酵 液中去除之前；然后再次在已经去除该微生物之后，比如在后续下游工艺液体中。
[0109] 因此本发明进一步包括一种用于从发酵液和后续下游工艺液体中去除残留宿主 细胞DNA的方法，该发酵液和后续下游工艺液体包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋 白质的微生物，所述方法包括：
[0110] a)将聚合氯化铝添加至该发酵液并且添加至该后续下游工艺液体，并且
[0111] b)从该发酵液中分离絮凝的微生物
[0112] c)在添加聚合氯化铝之后精制该后续下游工艺液体。
[0113]聚合物
[0114] 聚合物广泛用于颗粒凝聚。阴离子和阳离子聚合物是优选的。有用的阳离子聚合 物可以是聚胺，并且有用的阴离子聚合物可以是聚丙烯酰胺。有用的聚合物浓度将通常处 于以每千克发酵液（未稀释）计0.5%-20% (w/w)的范围内；优选以每千克发酵液（未稀 释）计1 % _1〇% (w/w)的范围内。
[0115] 有用的阴离子聚合物的实例是SUperfl〇CTMA130(凯米拉公司）。有用的阳离子 聚合物的实例是Polycat?(凯米拉公司）、C521 (凯米拉公司）、和C591 (凯米拉公司）。
[0116]后续下游橾作
[0117] 可以通过本领域已知的方法，例如但不限于过滤，例如滚筒过滤、膜过滤、压滤机 终端过滤、交叉流动过滤、或离心来去除絮凝的细胞。
[0118] 然后可以通过本领域已知的方法将得到的蛋白质溶液进一步加工或精制。例如， 可以通过常规程序回收该蛋白质，所述程序包括但不限于进一步过滤（如超滤和透析过 滤）、提取、喷雾干燥、蒸发、沉淀或结晶。然后，分离的蛋白质可用本领域已知的各种程序进 一步纯化和/或修饰，所述程序包括但不限于层析（例如离子交换层析、亲和层析、疏水层 析、聚焦层析及大小排阻层析）和/或电泳程序（例如制备型等电聚焦电泳）和/或溶解 度差异（例如硫酸铵沉淀））和/或萃取。
[0119]残留宿丰细朐DNA的检测
[0120] 术语残留宿主细胞DNA包括来自生产菌株的基因组DNA和编码感兴趣的蛋白质的 DNA片段。
[0121] 可以通过本领域已知的各种方法来完成微量残留宿主细胞DNA的检测和定量。开 发了许多方法来测定特异性单个靶序列。方法实例为：
[0122] ?利用斑点印迹的用于检测具有定义起源的特异性DNA的基于杂交的方法、以及 使用随机六聚物来产生覆盖这些宿主细胞的全基因组的代表性探针的放射性同位素标记 的DNA探针的杂交。
[0123] ?用于检测具有定义起源的特异性DNA的基于定量PCR的方法，该特异性DNA靶向 特异性基因序列，以便使用纯化的、物种匹配的、基因组DNA进行扩增和校准。
[0124] ?用于检测具有定义起源的特异性DNA的定性PCR方法，该特异性DNA靶向特异性 基因序列，以便使用纯化的、物种匹配的、基因组DNA进行扩增和校准。基于可以使用该方 法检测的基因组DNA的最低量来确定阈值。
[0125] 根据本发明，微量DNA的纯化是通过使用FastDNA?Spin试剂盒（安倍生物医疗 (MPBiomedicals))来完成的。然后，使用针对该宿主细胞上的染色体位点的特异性引物， 可以使该洗脱的样品经历PCR反应。包括多个阳性对照，其中已知量的宿主DNA以不同的 浓度添加到PCR反应中。在PCR反应之后，使这些样品经历凝胶电泳，并比较这些DNA条带 的强度以便估计在初始样品中的宿主DNA的浓度。在英尼斯（Innis)等人（1990)的PCR 规程：方法和应用指南（PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)(纽约学 术出版公司（AcademicPressinc.)中提供了PCR的详细规程。
[0126] 通过使用根据本发明的方法，没有可检出的残留宿主细胞DNA(小于10ngDNA每 克发酵液，即，低于检测限）。
[0127] 在下列实例中进一步阐明本发明，这些实例并不旨在以任何方式限制所要求保护 的本发明的范围。
[0128] 实例
[0129]实例1
[0130]从发酵液中去除DNA
[0131] 该发酵液包含该感兴趣的蛋白质（麦芽糖淀粉酶）和产生该感兴趣的淀粉酶的微 生物（枯草芽孢杆菌）。该发酵为本领域已知的深层发酵并且得到的发酵液具有经证实的 DNA含量。
[0132] 对照：使淀粉酶批的冰冻培养液在水浴中融化。将两个独立等分试样的材料在 10,OOOrpm下旋转离心20分钟，保留得到的上清液用于分析，并且将在此得到的上清液描 述为"未处理的培养液"对照。
[0133] 试验：用四个不同的设置来絮凝该发酵液：
[0134]使用GC850?(A12(0H5)C1)或NordPAC18?Al(011)1，2(：11，8作为聚合氯化铝盐，并且使 用Polycat?或C521 ?作为阳离子聚合物。
[0135] 保持稀释用水、CaC12、和A130?的量恒定。
[0136] 使用以下组合进行四个絮凝设置：
[0137]
【主权项】
1. 一种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质 和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括： a) 将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且 b) 从该发酵液中分离絮凝的微生物。
2. -种用于从发酵液中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质 和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括： a) 从该发酵液中分尚该微生物；并且 b) 将聚合氯化铝添加至该发酵液。
3. -种用于从发酵液和后续下游工艺液体中去除残留宿主细胞DNA的方法，该发酵液 和后续下游工艺液体包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包 括： a) 将聚合氯化铝添加至该发酵液并且添加至该后续下游工艺液体； b) 从该发酵液中分离絮凝的微生物；并且 c) 在添加聚合氯化铝之后精制该后续下游工艺液体。
4. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白质是一种酶。
5. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该微生物是一种细菌或真菌。
6. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该酶是一种水解酶。
7. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该发酵液可以用水稀释高达2000% (w/w)〇
8. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该聚合氯化铝是以每千克发酵液计 0? 1% -10% (w/w)的浓度添加的。
9. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中除了聚合氯化铝之外，还添加了一种 或多种絮凝剂。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中这些絮凝剂选自下组，该组由盐和聚合物组成。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中该聚合物是一种阴离子聚合物或阳离子聚合 物。
12. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该聚合氯化铝具有化学式Aln(OH) mCl(3n-m)。
13. 根据权利要求12述的方法，其中该聚合氯化铝具有化学式Al2(0H)5C1和/或 Al(OH)WClw0
14. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a)或b)中的分离是通过离心 或过滤进行的。
15. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在添加聚合氯化铝之后将pH调节到 在pH2到pH11范围之内的pH。
16. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤b)之后每克发酵液有少于 IOng的宿主细胞DNA。
17. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中，当在步骤b)和/或c)之后进行PCR 反应和凝胶电泳时，在步骤b)和/或c)之后每克发酵液有少于IOng的宿主细胞DNA。
18. 根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中，当在步骤b)和/或c)之后进行PCR 反应和凝胶电泳时，在该发酵液中有低于检测限的宿主细胞DNA。
【专利摘要】一种用于从发酵液中去除残留DNA的方法，该发酵液包含感兴趣的蛋白质和产生该感兴趣的蛋白质的微生物，所述方法包括：a)将聚合氯化铝添加至该发酵液，并且b)从该发酵液中分离絮凝的微生物。
【IPC分类】C07K1-30, C12N15-10, C07K1-14
【公开号】CN104797590
【申请号】CN201380056811
【发明人】C·霍博尔, C·J·克普卡
【申请人】诺维信公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2013年11月1日
【公告号】EP2914611A1, WO2014068083A1