b4-合成反应混合物与至少Neu5Ac、CTP、α 2, 3-唾液酸转移酶、胞 苷单磷酸激酶及CMP-唾液酸合成酶予以混合以形成唾液酸-Gb5-0R1A反应混合物；(vii) 在允许转换Gb5-0R 1AS唾液酸-Gb5-0R 14的条件下，培养唾液酸-Gb5-0R 1A反应混合物；及 视需要（viii)分离唾液酸-Gb5-0R1A。
[0020] 另一方面，一种合成SSEA4方法的实施方式是如下：（i)如本发明所述，在UDP-Gal 再生酶存在下，自半乳糖生成UDP-Gal ;(ii)如本发明所述，在Gb3-合成反应混合物中将 Lac-〇R1A转换为Gb3_0R 1A，其中该反应混合物包含至少UDP-Gal、α -1，4半乳糖转移酶及 UDP-Gal再生酶；（iii)将Gb3-合成反应混合物与至少GalNAc、β 1，3-Ν-乙酰半乳糖胺 转移酶、N-乙酰己糖胺1-激酶及N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶予以混合以形成 Gb4-合成反应混合物；（iv)在允许转换Gb3-0R1A为Gb4-0R1A的条件下，培养Gb4-合成反应 混合物；（V)分离Gb4-0R1A; (Vi)将Gb4-0R 14与β 1，3-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组 予以混合以形成Gb5-合成反应混合物；(vii)在允许转换Gb4-0R1AS Gb5-0R 1Α的条件下， 培养Gb5-合成反应混合物；（viii)将665-01^与α -2, 3唾液酸转移酶及CMP-Neu5Ac再 生酶组予以混合以形成唾液酸-Gb5-合成反应混合物，其中该CMP-NeU5Ac再生酶组包含胞 苷单磷酸激酶、CMP-唾液酸合成酶、丙酮酸激酶及焦磷酸化酶；（ix)在允许转换Gb4-0R 1A 为唾液酸-GbS-OR1M^条件下，培养唾液酸-Gb5-合成反应混合物；及视需要（X)分离唾液 酸-Gb5-0R 1A。
[0021] 在一些实施例中，本发明所述的方法是使用Gb3(例如，尾式）作为酶性合成寡糖 的起始材料。该方法包括：（i)如前所述，在MF-GalNAc再生酶组存在下，自GalNAc生成 UDP-GalNAc，并在UDP-GalNAc及β 1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶存在下，将663-01^转换 为Gb4-0R1A，其中Ria为氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或 未经取代的炔基、经取代或未经取代的环碳基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经 取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基或氧保护基团。R ia的实施例包括，但不限于氢、丙 烯基、生物素、神经酰胺或一非氢基团（如烷基），其是进一步被经取代或未经取代的硫、经 取代或未经取代的氨基、羰基（例如，羧酸）、迭氮、烯基（例如，丙烯基）、炔基（例如，丙炔 基）、生物素或神经酰胺基团所取代。某些特定的实施例中，R ia是氢、丙烯基、经取代的烷 基、生物素或神经酰胺。步骤（i)及（ii)可在Gb4-合成反应混合物中进行，其中该反应混 合物包含 GalNAc、PEP、ATP、UTP、Gb3-0R1A、β -1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶及 UDP-GalNAc 再生酶组。如需要,可分离Gb4-0R1A。
[0022] 上述方法可进一步包括：（iii)在UDP-Gal及β -1，3-半乳糖转移酶存在下，将 Gb4-0R1A转换为Gb5-0R1A，该步骤可与步骤（iv)结合，步骤（iv)包括如本发明所述的，在 UDP-Gal再生酶存在下，自半乳糖生成UDP-Gal。步骤（iii)及（iv)可在Gb5-合成反应混 合物中进行，其中该反应混合物包含半乳糖、PEP、ATP、UTP、Gb4-0R 1A、β -1，3-半乳糖转移 酶及UDP-Gal再生酶组。产物665-01^可自反应混合物中分离而得。
[0023] 根据本发明的一实施例，可将665_01^再转换为岩藻糖-Gb5_0R 1Α，其方法如下： (V)在⑶P-Fuc及α -1，2-岩藻糖转移酶存在下，将Gb5_0R1A转换为岩藻糖-Gb5_0R1Α，该步 骤可与步骤（vi)结合，步骤（vi)包括在本发明所述的GDP-Fuc再生酶组存在下，自岩藻糖 生成GDP-Fuc。步骤（V)及（vi)可在岩藻糖-Gb5-合成反应混合物中进行，该反应混合物 包含岩藻糖、ATP、GTP、PEP、Gb5-0R 1A、α-l，2-岩藻糖转移酶及⑶P-Fuc再生酶组。如需要， 岩藻糖-Gb5-合成反应混合物是将Gb5-合成反应混合物与至少岩藻糖、GTP、a -1，2-岩藻 糖转移酶及L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶混合而得。本发明方法可进一步包括 分离岩藻糖 _Gb5_0R1A。
[0024] 本发明的另一实施例，可将Gb5-0R1A再转换为唾液酸-Gb5_0R 1A，其方法如下： (vii)在CMP-Neu5Ac及a -2, 3-唾液酸转移酶存在下，将Gb5-0R1A转换为唾液酸-Gb5-0R1A， 该步骤可与步骤（viii)结合，步骤（viii)包括在本发明所述的CMP-Neu5Ac再生酶组存在 下，自Neu5Ac生成CMP_Neu5Ac。步骤（vii)及（viii)可在唾液酸-Gb5_合成反应混合物中 进行，该反应混合物包含Neu5Ac、CTP、PEP、Gb5-0R 1A、a -2, 3-唾液酸转移酶及CMP-Neu5Ac 再生酶组。在特定实施例中，唾液酸-Gb5-生成反应混合物是将Gb5-合成反应混合物与至 少Neu5Ac、CTP、a -2, 3-唾液酸转移酶、胞苷单磷酸激酶及CMP-唾液酸合成酶混合而得。 产物唾液酸-Gb5-0R1A可分离自反应混合物中。
[0025] 根据本发明的其它实施例，此处所述的方法是关于使用Gb4(例如，尾式）作为 起始物以合成寡糖。该方法包括：（i)如本发明所述的UDP-Gal再生酶组存在下，自半乳 糖生成UDP-Gal ;及（ii)在UDP-Gal及β -1，3-半乳糖转移酶存在下，将Gb4-0R1A转换为 Gb5-0R1A，其中Ria为氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未 经取代的炔基、经取代或未经取代的环碳基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经 取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基或氧保护基团。R ia的实施例包括，但不限于氢、丙 烯基、生物素、神经酰胺或一非氢基团（如烷基），其是进一步被经取代或未经取代的硫、经 取代或未经取代的氨基、羰基（例如，羧酸）、迭氮、烯基（例如，丙烯基）、炔基（例如，丙炔 基）、生物素或神经酰胺基团所取代。某些特定的实施例中，R ia是氢、丙烯基、经取代的烷 基、生物素或神经酰胺。根据本发明方法，步骤（i)及（ii)可在Gb5-合成反应混合物中实 施，该反应混合物包含半乳糖、PEP、ATP、UTP、Gb4-0R 1A、β -1，3-半乳糖转移酶及UDP-Gal 再生酶组。另一方面或选择性的，可分离所获得的Gb5-0R1A。
[0026] 上述方法可进一步包括：（iii)在⑶P-Fuc及α -1，2-岩藻糖转移酶存在下， 将Gb5-0R1A转换为岩藻糖-Gb5-0R1A，该步骤可与步骤（iv)结合，步骤（iv)包括如本发 明所述的GDP-Fuc再生酶组存在下，自岩藻糖生成GDP-Fuc。步骤（iii)及（iv)可在岩 藻糖-Gb5-合成反应混合物中进行，该反应混合物包含岩藻糖、ATP、GTP、PEP、Gb5-0R 1A、 α -1，2-岩藻糖转移酶及⑶P-Fuc再生酶组。岩藻糖-Gb5_合成反应混合物是将Gb5_合成 反应混合物与至少岩藻糖、GTP、α 1，2-岩藻糖转移酶及L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷 酸化酶混合而得。产物岩藻糖-Gb5-0R1A可自反应混合物中分离。
[0027] 另一方面，上述方法可进一步包括：（V)在CMP_Neu5Ac及α -2, 3-唾液酸转移酶 存在下，将Gb5-0R1A转换为唾液酸-Gb5-0R1A，该步骤可与步骤（vi)结合，步骤（vi)包括 在如本发明所述的CMP-Neu5Ac再生酶套组存在下，自Neu5Ac生成CMP-Neu5Ac。步骤（V) 及（vi)可在唾液酸-Gb5-合成反应混合物中进行，该反应混合物包含Neu5Ac、CTP、PEP、 Gb5-0R1A、α-2,3-唾液酸转移酶及CMP-Neu5Ac再生酶组。唾液酸-Gb5-合成反应混合物 是将Gb5_合成应混合物与至少Neu5Ac、CTP、α -2, 3-唾液酸转移酶、胞苷单磷酸激酶及 CMP-唾液酸合成酶混合而得。根据本发明方法所得的唾液酸-Gb5-0R1A可自反应混合物中 分离。
[0028] 根据本发明其它实施例，此处所述方法是关于自Gb5合成岩藻糖-Gb5寡糖 (Globo H)。该方法包括：（i)在如本发明所述的GDP-Fuc再生酶套组存在下，自岩藻糖 生成⑶P-Fuc ; (ii)在⑶P-Fuc及α -1，2-岩藻糖转移酶存在下，将Gb5_0R1A转换为岩藻 糖-Gb5-0R1A;&视需要（iii)分离岩藻糖-Gb5-0R 1A。步骤（i)及（ii)可在岩藻糖-Gb5-合 成反应混合物中进行，该反应混合物包含岩藻糖、ATP、GTP、PEP、Gb5-0R 1A、α -1，2-岩藻糖 转移酶及⑶P-Fuc再生酶组。
[0029] 根据本发明的其它实施例，此处所述的方法是关于自Gb5合成唾液酸-Gb5寡糖 (Globo H)。该方法包括：（i)在如本发明所述的CMP-Neu5Ac再生酶套组存在下，自Neu5Ac 生成CMP-Neu5Ac ; (ii)在CMP-Neu5Ac及α -2, 3-唾液酸转移酶存在下，将665-01^转换 为唾液酸-Gb5-0R1A;&视需要（iii)分离唾液酸-Gb5-0R 1A。步骤（i)及（ii)可在唾液 酸-Gb5-合成反应混合物中进行，该反应混合物包含Neu5Ac、CTP、PEP、Gb5-0R、α -2, 3-唾 液酸转移酶及CMP-Neu5Ac再生酶组。
[0030] 前述任一合成方法，不论所涉及的任一酶或反应中的任一底物（例如，乳糖、Gb3、 Gb4或Gb5)，皆可固定于一支持体（support member)上。
[0031] 本发明的另一方面是有关于用于本发明寡糖合成方法的酶反应器（emzymatic reactor)。该酶反应器可包含一或多个下述的反应室（reaction chamber):
[0032] (a)合成Gb3-0Rl^反应室，其中该室包含α -1，4-半乳糖转移酶及UDP-Gal再 生酶组，其包含半乳糖激酶、UDP-糖焦磷酸化酶、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶；
[0033] (b)合成Gb4-0Rl^反应室，其中该室包含β-1，3_Ν-乙酰半乳糖胺转移酶及 UDP-GalAc再生酶组，其包含N-乙酰己糖胺1-激酶、N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰转移 酶、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶；
[0034] (c)合成Gb5-0Rl^反应室，其中该室包含β -1，3-半乳糖转移酶及UDP-Gal再 生酶组；
[0035] (d)合成岩藻糖-GbS-OR1I^反应室，其中该室包含α-1，2-岩藻糖转移酶及 ⑶P-Fuc再生酶组，其包含L-岩藻糖激酶/⑶P-岩藻糖焦磷酸化酶、丙酮酸激酶及视需要的 焦磷酸化酶；及
[0036] (e)合成唾液酸-GbS-OR1I^反应室，其中该室包含α-2, 3-唾液酸转移酶及 CMP-Neu5Ac再生酶组，其包含胞苷单磷酸激酶、CMP-唾液酸合成酶、丙酮酸激酶及视需要 的焦磷酸化酶。
[0037] 根据本发明的一些实施例，该酶反应器包含反应室如下：（a)及（b) ;(a)、（b)及 (c) ; (a)、（b)、（c)及（d) ; (a)、（b)、（c)及（e) ; (b)及（c) ; (b)、（c)及（d) ; (b)、（c)及 (e) ; (c)及⑷或（c)及（e)。
[0038] 根据本发明的其它实施例，此处所述的酶反应器包含一反应室，该反应室包含半 乳糖转移酶（例如，α -1，4-半乳糖转移酶、β -1，4-半乳糖转移酶、α -1，3-半乳糖转移酶 或β -1，3-半乳糖转移酶）及本发明所述的UDP-Gal再生酶组，其可包含半乳糖激酶、UDP 焦磷酸化酶、丙酮酸激酶及视需要的焦磷酸化酶。
[0039] 在任一反应室中，一或多种酶可固定于一支持体上。根据本发明的特定实施例，该 一或多个UDP-Gal再生酶组、UDP-GalNAc再生酶组、⑶P-Fuc再生酶组及CMP-Neu5Ac再生 酶组是各自固定于一支持体上。根据本发明的其它实施例，一反应室中的所有酶是固定于 一支持体上。
[0040] 本发明也涵盖根据上述合成方法所制得的寡糖。
[0041] 本发明的一或多种实施例是详载于以下【具体实施方式】中。本发明的其它特征、目 的及优势将清楚揭露于以下的定义、图式、实施例及权利要求书中。
[0042] 化学式的定义
[0043] 本发明相关的特定功能基团及化学名词的定义说明如后。化学元素的鉴别是根 据周期表（CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.)封页内部，而 特定功能基团也据此作定义。此外，有机化学的一般原则以及特殊官能基团及其活性如有 机化学，托马斯?索瑞尔，大学科学书籍，索萨利托，1999 ;史密斯和马区的高等有机化学， 第5版，约翰威立公司，纽约，2001年；Larock，综合有机转化，VCH出版公司，纽约，1989 ; 以及卡拉瑟斯，有机合成的一些现代方法，第3版，剑桥大学出版社，剑桥，1987 (Organic Chemistry, Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalitoj 1999 ；Smith and March March' s Advanced Organic Chemistry, 5th EditionjJohn Wiley&Sons, Inc. , New York，2001 ;Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers，Inc.，New York, 1989 ； 以及 Carruthersj Some Modern Methods of Organic Synthesis,3rd Edition，Cambridge University Press，Cambridge，1987)所描述。
[0044] 本发明所述化合物可包含一或多个非对称中心，因而存在多种异构体形式，诸如 对映体及/或非对映异构体。例如，本发明所述化合物可呈个别对映体、非对映异构体或 几何异构体等形式，或可呈混合异构体形式，包括外消旋混合物及富含一或多种异构体的 混合物。可利用包括掌性高效液相层析（HPLC)以及掌性盐类的形成与结晶等公知技术， 自混合物中分离同分异构物；或利用非对称合成法制备较佳的异构物。请参见Jacques 等人，对映异构体，外消旋体和分辨率（威利跨学科，纽约，1981);维伦等人，四面体期 刊33 :2725(1977);以列，E.L.，碳化合物的立体化学（麦格劳-希尔，纽约，1962);以及 维伦，S. H.，拆分剂和光学分辨率表P. 268 (E. L.以列编，圣母院大学出版社，巴黎圣母院， 1972)(Enantiomers, Racemates and Resolutions(Wiley Interscience1New York, 1981)； Wilen 等人,Tetrahedron 33:2725 (1977) ；Eliel, E. L. Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw_Hill，NY, 1962);以及 Wilen，S.H. Tab