编码hpv58l1、hpv52l1蛋白的核苷酸序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更加具体地说，涉及人乳头瘤病毒编码及其应用。
【背景技术】
[0002] 人乳头状瘤病毒（human papilkgna virus, HPV)是一种致瘤DNA病毒，可引起人 生殖道和肛门皮肤、黏膜发生良性和恶性肿瘤，其中与宫颈癌发病密切相关的有HPV 16, 18 等。每年全世界宫颈癌的新增病例约为50万人，死亡人数近30万，是威胁女性健康的第二 大癌症。
[0003] 有80种以上的人乳头瘤病毒，即HPV。其中很多与各式各样的生物学表型相关， 所述生物学表型为从良性增生性疣到恶性癌。HPV6和HPVll是与生殖器或呼吸粘膜的良 性疣、非恶性尖锐湿疣和轻度发育不良相关的最普通类型。HPV16和HPV18是与子宫颈、阴 道、女阴和肛管的原位和侵袭性癌最常相关的高风险类型。90%以上的子宫颈癌与HPV16、 HPV18或较少流行的致癌类型HPV31、-33、-45、-52和-58的感染相关。在对90%以上子 宫颈癌中检测到HPV DNA的观察结果提供了 HPVs引起子宫颈癌的强大流行病学证据。人 乳头瘤病毒是小（50-60nm)、无包膜、二十面体的DNA病毒，其编码最多8个早期和2个晚 期基因。该病毒基因组的可读框命名为El至E7,和Ll和L2,其中E表示早期L表示晚期。 Ll和L2编码病毒衣壳蛋白，而E基因与病毒复制和细胞转化的功能相关。Ll蛋白是主要 的衣壳蛋白，并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要的衣壳蛋白。免疫学数据提示在病 毒衣壳中，大多数L2蛋白位于Ll蛋白内部。在不同人乳头瘤病毒中，Ll和L2蛋白是高度 保守的。Ll蛋白或Ll和L2蛋白组合在酵母、昆虫细胞、脯乳动物细胞或细菌中的表达导致 病毒样颗粒（VLPs)的自动装配。VLPs形态上类似于真的病毒体且在施用于动物或人后能 够诱导高效价的中和抗体。因为VLPs不会有潜在地致癌病毒基因组，所以它们为活病毒在 HPV疫苗开发中的用途提供了安全的备选方案。由于这个原因，Ll和L2基因已经被确定为 HPV感染和疾病的预防和治疗性疫苗开发的免疫学靶。
[0004] 在亚洲地区的流行病学调查显示，52、58型就与30%以上的宫颈癌相关。在正常 人群中HPV52的流行程度仅次于HPV16,约为2. 42%，在宫颈糜烂患者中也占有一定的比例 (略低于HPV58)，但在浸润性子宫颈癌中，HPV52的流行度却大大降低，这可能与HPV52E7癌 蛋白的转化能力有限有关。宫颈癌的发生是一个由宫颈糜烂引发的渐进过程，而HPV52又 是宫颈糜烂发生和发展的一个重要因素，因此针对HPV52亚型的免疫保护反应对于宫颈癌 的预防性疫苗有着重要的意义。
[0005] 与在成功转化的宿主生物中获得高表达水平的衣壳蛋白、限制纯化蛋白的生产相 关的困难已阻碍了 HPV疫苗开发和商业化。因此，尽管鉴定了编码HPV58L1蛋白的野生型 核苷酸序列，但是非常期望开发出HPV58L1蛋白的可容易更新来源，该蛋白利用在制定宿 主细胞中表达被最优化的编码HPV58L1的核苷酸序列。另外，产生具有天然蛋白的赋予免 疫性质的用于疫苗开发的大量HPV58L1VLPS将很有用处。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，针对HPV疫苗中使用的蛋白种类和活性 的问题，提供编码HPV58L1或HPV52L1蛋白的核苷酸序列，通过密码子优化使其能够在酵母 细胞中实现高水平表达；同时通过表达在酵母细胞中产生HPV52L1或HPV58L1病毒样颗粒 (VLPs)，以用于疫苗的研发。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
[0008] 编码HPV52L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列。
[0009] 编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列。
[0010] 一种载体，含有编码上述HPV52L1蛋白的核苷酸序列，或者编码HPV58L1蛋白的核 苷酸序列。
[0011] 一种真核汉逊酵母工程菌，以含有编码上述HPV52L1蛋白的核苷酸序列，或者编 码HPV58L1蛋白的核苷酸序列的载体转染真核汉逊酵母菌株RB-11，经筛选得到表达水平 和质粒拷贝数最高的菌株来获得。
[0012] RB-Il细胞株为LR9细胞株的改良衍生株（Roggenkamp.R etal.,1986Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorpha by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202:302) 〇RB-11细 胞株为5'-乳清酸苷磷酸脱羧酶基因缺陷性突变株，已被广泛应用于工业重组菌的构建。
[0013] 利用甲醇对转染后的真核汉逊酵母菌株RB-Il进行诱导表达，在整个过程中温度 为28-32°C，时间为72h，开始时甲醇用量为细胞悬浮液质量的0. 5%，每间隔24h，向细胞 悬浮液中添加甲醇，添加甲醇的量为细胞悬浮液质量的0. 5%。
[0014] 利用真核汉逊酵母工程菌进行发酵的方法，在发酵过程中，所述真核汉逊酵母工 程菌经过生长时相、去阻遏时相和诱导表达时相，其中一个质量份为Ig :
[0015] (1)生长时相：发酵罐pH值控制在5. 4-5. 5,发酵温度控制在28-32°C，使用的发 酵培养基经灭菌处理，由NH4H2PO 4HO -180质量份、MgSO4 · 7H20 40- 50质量份、KCl 40- 45质量份、NaCl 4- 5质量份、甘油500- 550质量份，发酵消泡剂4一5质量份和去离子 水10000-15000质量份组成；在生长时相中，发酵罐内溶氧会缓慢下降，当下降至60%时， 向发酵罐中匀速打入补料培养基，使用的补料培养基经灭菌处理，由NH 4H2P0480 - 90质量 份、甘油250- 300质量份和去离子水500- 550质量份组成；当发酵罐溶氧水平降至40% 以下时，将空气流量由起初的25- 30L/min调至12 - 15L/min，搅拌转速由起初的1200- 1500rpm调至700rpm ;整个生长时相时间在20-25小时，细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水 平可下降至20 %以下，细胞0D_达到80以上；
[0016] (2)去阻遏时相：当发酵罐溶氧由最低点回升到60%以上时，进入去阻遏时相， 维持空气流量和搅拌条件不变，加入去阻遏培养基；所述去阻遏培养基经灭菌处理，由 NH4H2P0425- 30 质量份、MgSO4WH2O 5-10 质量份、KCl 5-8 质量份、NaCl 0.5- 1 质量份、 甘油1700- 1900质量份和去离子水1200-1350质量份组成，去阻遏时相持续20- 25h ;
[0017] (3)诱导时相：去阻遏时相之后进入诱导时相，向发酵罐中补加诱导培养基，所述 诱导培养基经灭菌处理，由甘油和甲醇组成，甘油和甲醇的体积比为（38- 40) : (60- 65)， 调控甲醇的用量，以使甲醇在整个发酵罐的液相体积中，体积百分比为〇. 3%-0. 5%，诱导 时相持续48- 55h。
[0018] 在生长时相中，发酵培养基优选由NH4H2PO4HO - 175质量份、MgSO4 · 7H20 40- 45 质量份、KCl 42- 44质量份、NaCl 4. 2 - 4. 4质量份、甘油520- 540质量份，发酵消泡剂 4一5质量份和去离子水10000-12000质量份组成，所述发酵消泡剂为THIF - 298型生物 发酵消泡剂。
[0019] 在生长时相中，补料培养基优选由NH4H2P0485 - 87质量份、甘油260- 280质量份 和去离子水520- 540质量份组成。
[0020] 在生长时相中，补料培养基和发酵培养基的体积比为（0. 8 -1) ： (10一12) 〇
[0021] 在去阻遏时相中，去阻遏培养基优选由NH4H2P0 426 - 28质量份、MgSO4 · 7H20 6- 8质量份、KCl 7- 8质量份、NaCl 0. 6- 0. 8质量份、甘油1750- 1850质量份和去离子水 1300-1350质量份组成。在去阻遏时相中，发酵培养基和去阻遏培养基的体积比为4 :(1一 1. 2) 〇
[0022] 在诱导时相中，诱导培养基的使用体积为去阻遏培养基体积的30- 40%。
[0023] 本发明利用野生型基因，在充分考虑真核汉逊酵母菌株RB-Il的表达特点的基础 上，提供了两种新的核苷酸序列，编码HPV52L1蛋白或HPV58L1蛋白，在构建载体和转染 RB -11之后，诱导发酵得到的产物中形成各自的VLPs，并且表达量明显高于野生型基因的 表达水平，且能够作为疫苗进行使用。
【附图说明】
[0024] 图1是表达载体pMPT - HPV52L1的构建示意图。
[0025] 图2是表达载体pMPT - HPV58L1的构建示意图。
[0026] 图3是表达载体pMPT - HPV58L1转染细胞后PCR扩增的电泳照片。
[0027] 图4是HPV58L1的转化子west - blot方法筛选结果图。
[0028] 图5是悬浮缓冲液中HPV58L1 VLPs图像。
[0029] 图6是悬浮缓冲液中HPV52L1 VLPs图像。
[0030] 图7是野生基因与优化基因的酵母表达VLPs量的对比示意图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0032] 实施例1编码HPV52L1或HPV58L1蛋白的核苷酸序列的合成
[0033] 在NCBI数据库中分别检索得到HPV52L1和HPV58L1的野生型DNA序列和蛋白质 序列，其中对HPV52L1来说，野生型DNA序列HPV52L1-WT全长1512个碱基，蛋白质序列 Genbank登记号为HQ537731. 1，蛋白质序列全长504个氨基酸。