] 6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300 μ 1/TMAs，（Biotinyl Tyramid IC存液：Biotinyl Tyramid 溶解于 0· 2ml DMS0，Biotinyl Tyramid 工作液：1 X 稀释液， 1:50 稀释 Biotinyl Tyramid IC存液），室温 10 分钟。
[0104] 7)丁町洗，3\511^11。
[0105] 8)切片滴加 SA-HRP (链霉卵白素-辣根过氧化物酶），300 μ Ι/TMAs，室温30min。
[0106] 9)丁町洗，3\511^11。
[0107] 10)蒸溜水洗涤，I X lmin。
[0108] 11) DAB显色，显微镜下控制显色反应。
[0109] 12)苏木素复染，
[0110] 13)酒精梯级脱水，切片干燥。
[0111] 14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片lmin。
[0112] 1. 7结果判断及标准
[0113] 应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达 信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。
[0114] 再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进 行综合评分，判断标准为：（1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细 胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅 棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。（2)依 据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记O分；b.阳性表达细胞数< 25%，记1分； c. 25%<阳性细胞数< 50%，记2分；d.阳性表达细胞数彡50%，记3分。
[0115] 为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自 进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①〇分者最终计为〇分，认为阴性表达；②1 分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性 表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。
[0116] 1.8分析和统计软件
[0117] 应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用x2test或 Fisher exact test，相关性分析米用Spearmen correlation方法；P <0· 05即差异有统 计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test;多变量分析采用 Cox' s proportional hazards model ;P <0· 05 即差异有统计学意义。
[0118] 2 结果
[0119] 2. I AFAP1-AS1在鼻咽癌中的表达比正常对照组织中的表达显著升高
[0120] AFAP1-AS1在69. 64 %的鼻咽癌组织中（78/112例）有表达，而仅在20 % (10例正 常组织样本中的2例）的正常鼻咽上皮组织中有表达（图2)，两者之间具有明显的统计学 差异（Ρ〈0· 001)。
[0121] 2. 2 AFAP1-AS1高表达的鼻咽癌患者预后较差
[0122] 我们对112例鼻咽癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情 况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对鼻 咽癌组织中AFAP1-AS1的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现AFAP1-AS1 高表达患者平均生存时间明显短于AFAP1-AS1低表达或不表达的患者（图3)。说明 AFAP1-AS1是一个与鼻咽癌预后相关的分子标记，该IncRNA表达高，病人预后差。
[0123] 实施例3,构建shRNA载体干扰AFAP1-AS1的表达
[0124] 1.材料方法
[0125] I. 1试剂及试剂盒
[0126] 限制性内切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA连接酶等购自TakaRa公 司；
[0127] TRIZ0L? Reagent (Invitrogen);
[0128] 质粒抽提试剂盒（#D6943_01，OMEGA);
[0129] 胶回收试剂盒（#M5212, OMEGA);
[0130] 逆转录试剂盒（#A3500, Promega);
[0131] 抗生素 G418 (Ameresc)。
[0132] I. 2 shRNA 的设计
[0133] 首先将 AFAP1-AS1 序列输入 Invitrogen 公司的 Block-It RNAi designer 软件， 寻找该IncRNA的shRNA最佳祀点，挑选最佳的3条相应的祀点序列如下：
[0134] shRNA-Ι :GCAATTCACTGAGTGGTTACG 如 SEQ NO: 12 所示，
[0135] shRNA-2 :GCTTACTCTCTTGGTGATTCT 如 SEQ NO: 13 所示，
[0136] shRNA-3 :GCAAGACATCCGATGGTATAC 如 SEQ NO: 14 所示，
[0137] 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其 序列如下：
[0138] Scramble :5' -GACACGCGACTTGTACCAC-3' 如 SEQ NO: 15 所示。
[0139] 针对这3条IncRNA祀点序列，及Scramble序列，根据OligoEngine公司pSUPER 载体说明书，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形 成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链。具体需合成的各条 寡核苷酸序列及它们配对退火后形成的DNA双链如下：
[0140] shRNA-Ι ：
[0141] 5, -GATCCCC GCAATTCACTGAGTGGTTACG TTCAAGAGA CGTAACCACTCAGTGAATTGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGTTAAGTGACTCACCAATGC AAGTTCTCT GCATTGGTGAGTCACTTAACG AAAAATTCGA-5'如SEQN0:16、17所示，
[0142] shRNA-2 ：
[0143] 5, -GATCCCC GCTTACTCTCTTGGTGATTCT TTCAAGAGA AGAATCACCAAGAGAGTAAGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGAATGAGAGAACCACTAAGA AAGTTCTCT TCTTAGTGGTTCTCTCATTCG AAAAATTCGA-5'如SEQN0:18、19所示，
[0144] shRNA-3 ：
[0145] 5' -GATCCCC GCAAGACATCCGATGGTATAC TTCAAGAGA GTATACCATCGGATGTCTTGC TTTTTA-3' 3' -GGG CGTTCTGTAGGCTACCATATG AAGTTCTCT CATATGGTAGCCTACAGAACG AAAAATTCGA-5' 如 SEQ N0:20、21 所示，
[0146] Scramble
[0147] 5, -GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3' 3' -GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5' 如 SEQ N0:22、23 所示。
[0148] 两条互补配对的DNA退火后，左边是限制性内切酶Bgl II的粘性末端，右边是 Hind III的粘性末端。
[0149] 1.3 shRNA 载体构建
[0150] 化学合成上述4个shRNA对应的8条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20 μ M，互补单链各取10 μ 1混合。然后将oligo混合物在PCR 仪中95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段。
[0151] 用Bgl II和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3. Ikb的载体片段，将退火后的 粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16°C连接 过夜。转化E. coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I酶 切构建好的pSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入 了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于干扰细胞内AFAP1-AS1的表达。
[0152] 1.4细胞培养与转染
[0153] 鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640 培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
[0154] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞系5-8F、HKl和HNE2按2X IO5个细胞/孔接种于 6孔板中，将6孔板置于37°C，5% 0)2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始 shRNA表达载体的转染；转染过程如下：
[0155] 在无菌EP管中加入3 μ 1的Iipofectamine 2000于100 μ 1无血清培养基中混勾 静置5min ;
[0156] 将构建的shRNA表达载体加入100 μ 1无血清培养基中；然后与上述包含 Iipofectamine的100 μ 1无血清培养基温和混勾，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成 复合体；
[0157] 用D-Hank' s液洗涤细胞3次；
[0158] 将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和混匀后加入6孔板 中的1个孔；
[0159] 将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续 培养48小时。
[0160] 1. 5实时定量PCR检测shRNA干扰IncRNA表达的效果：
[0161] 将各种shRNA载体转染后的鼻咽癌细胞抽提总RNA，2yg RNA经逆转录成 cDNA 后，进行实时荧光定量 PCR。AFAP1-AS1 引物为 5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，和 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3'。
[0162] 用于对照的 GAPDH 引物为 5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 和 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' ，
[0163] 实时荧光定量PCR反应体系
[0164] SYBR? Premix Ex TaqTM (2χ ) 10μ1 PCR Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.4μΙ PCR Reverse Primer ( ΙΟμηι) 0.4μΙ cDNA 模板 2.0μ1
[0165] ClH2O 7.2μΙ Total 20μΙ
[0166] 实时荧光定量PCR反应步骤
[0167] 1 94 0C 5 min 2 95 C IOscc 3 58'C 30 see 4 72 °C 20 sec 5 Plate read 6 82 °C 30 sec 7 Plate read 8 Go to step 2 for more 39 limes 9 Perform melting cixrve from 55.0°C to 95.O C, read every 0.2°C, hold for I sec
[0168] 反应结束后确认实时荧光定量