一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测转基因植物中靶标SiRNA池的方法。
【背景技术】
[0002] 基因干扰是研宄植物基因功能的一个重要手段，干涉正常核糖核酸的积累（RNAi) 是基因干扰的一个方法。RNAi是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA (dsRNA) 诱导序列特异的目标基因的沉寂，抑制或者阻断基因表达。小干扰RNA(siRNA)是由dsRNA 经过剪切形成的21-25核苷酸（nt)，是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需 的因子。使用转基因植物表达dsRNA，表达的dsRNA可以由Dicer和Rde-I作用形成靶标 siRNA 池。
[0003] 检测转基因植物中靶标SiRNA池的形成对于研宄目标基因的干扰过程具有重要 意义。目前，检测转基因植物中靶标siRNA池的方法主要有两种：1.利用含有放射性磷32P-dCTP的DNA探针；2.检测靶标siRNA可以使用合成小片段反义单链RNA(ssRNA)(通常小 于30nt)，然后使用化学修饰的方法，在ssRNA的5'或者3'端增加地高辛（DIG)标记。但是， 这两种方法的实施都有较大的限制：对于方法1 :国家对使用放射性材料有严格的限制，而 且使用放射性探针需要复杂的实验设备和防护措施，只有少数单位具有操作放射性材料的 资质，导致该方法无法大规模推广使用，而委托具有资质的单位进行检测则价格昂贵；对于 方法2 :化学修饰的方法增加 DIG标记价格昂贵，靶标siRNA池中具有大量靶标siRNA，使用 少量反义单链RNA作为探针容易产生脱靶标效应，若合成大量反义单链RNA，则由于化学修 饰增加 DIG的方法价格昂贵而很难实施。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种检测转基因植物中靶标SiRNA池的方法，利用DIG标 记RNA探针来检测转基因植物中标靶siRNA池，该方法具有高度特异性，且操作简单，成本 低，大幅度减少标靶siRNA池的检测成本。
[0005] 本发明是基于如下理论和技术实现的：目的基因的dsRNA在转基因植物中被随机 剪切为21-25nt的靶标siRNA，这些不同核苷酸序列的靶标siRNA形成靶标siRNA池。本发 明通过目标基因扩增出的反义RNA链与靶标siRNA池中的各个靶标siRNA正义链均互补， 该反义RNA链在Northern杂交过程中可以和各个革El标siRNA结合，具体如图1所示，提高 了检测特异性和灵敏度。
[0006] 为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法，其包括如下步骤：
[0008] (1)以目标基因 DNA为模板制备DIG-UTP标记的反义RNA链：
[0009] ①反应体系包括：UTP、ATP、GTP、CTP，DIG-UTP、RNA聚合酶缓冲液、目标DNA、RNA 聚合酶、去离子水，10~50°C反应0~24小时。
[0010] ②然后，反应体系中加入DNA酶，10~50°C反应去除反应体系中的目标DNA。
[0011] ③再，加入去离子水和氯化锂溶液，-20~0°C中沉淀RNA。
[0012] ④离心，弃上清，加去离子水溶解RNA沉淀，获得含有多个DIG-UTP标记的高纯度 目标反义RNA链。
[0013] (2)以DIG-UTP标记的反义RNA链为探针检测转基因植物中靶标siRNA池：
[0014] ①将目标基因 RNA进行聚丙烯酰胺胶电泳，然后，将目标基因 RNA从聚丙烯酰胺胶 中转到硝酸纤维素滤膜上，烤干滤膜。
[0015] ②然后，将烤干后的滤膜预杂交后，加入步骤1)获得的DIG-UTP标记的高纯度目 标反义RNA链，杂交过夜。
[0016] ③再，将滤膜清洗，显色、曝光、成像。
[0017] 优选的，一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法，其包括如下步骤：
[0018] (1)以目标基因 DNA为模板制备DIG-UTP标记的反义RNA链：
[0019] ①反应体系：50 ~200mM UTP，50 ~200mM ATP，50 ~200mM GTP，50 ~200mM CTP， 5~20mM DIG-UTP，10 X RNA聚合酶缓冲液，1~20 μ 1目标DNA，1~10 μ I RNA聚合酶， 0~20 μ 1去离子水，25~45°C，反应0~10小时。
[0020] ②然后，反应体系中加入DNA酶，25~40°C反应0~1小时，去除反应体系中的目 标 DNA。
[0021] ③再加入去离子水和氯化锂溶液，-20~0°C中沉淀RNA。
[0022] ④在0~25°C下，高速离心5分钟以上，弃上清，加入去离子水溶解RNA沉淀，获得 含有多个DIG-UTP标记的高纯度目标反义RNA链。
[0023] (2)以DIG-UTP标记的反义RNA链为探针检测转基因植物中靶标siRNA池：
[0024] ①将RNA进行聚丙烯酰胺胶电泳，使用半干电转系统，将RNA从聚丙烯酰胺胶中转 到硝酸纤维素滤膜上，烤干滤膜。
[0025] ②将滤膜放入杂交液中，55~65°C预杂交10分钟以上，将滤膜取出，浸入新鲜杂 交液中，加入步骤1)获得的DIG-UTP标记的高纯度目标反义RNA探针，37~45°C杂交5小 时以上。
[0026] ③依次使用低严谨性和高严谨性缓冲液缓清洗滤膜，然后，将滤膜在阻断液和抗 体混合溶液中浸泡，使用洗膜液浸洗滤膜。最后使用检测液和显色液浸泡滤膜，显色后，将 滤膜放入显色成像系统，曝光，拍摄并保存成像图片。
[0027] 更优选的，一种检测转基因植物中靶标siRNA池的方法，其包括如下步骤：
[0028] (1)以目标基因 DNA为模板制备DIG-UTP标记的反义RNA链：
[0029] ①反应体系：L 7μ1 UTP(IOOmM)，L 7 μ I ATP(IOOmM)，L 7 μ I GTP(IOOmM)， I. 7 μ I CTP (IOOmM)，I. 0 μ I DIG-UTP (IOmM)，2· 0 μ I 10 X RNA 聚合酶缓冲液，5· 0 μ 1 目标 DNA，2. ΟμL RNA聚合酶，3. 2μ1去离子水，37°C，反应4小时。
[0030] ②然后，反应体系中加入ΙμL DNA酶，37 °C反应15分钟，去除反应体系中的目标 DNA0
[0031] ③再加入去离子水和氯化锂溶液，_20°C中沉淀1小时。
[0032] ④在4°C下，12000rpm离心15分钟。弃上清，加入50μ1去离子水溶解RNA沉淀， 获得含有多个DIG-UTP标记的高纯度目标反义RNA链。
[0033] (2)以DIG-UTP标记的反义RNA链为探针检测转基因植物中靶标siRNA池：
[0034] ① RNA转移：将RNA进行聚丙烯酰胺胶电泳，使用半干电转系统，将RNA从聚丙烯 酰胺胶中转到硝酸纤维素滤膜上，烤干滤膜。
[0035] ②将滤膜放入杂交液中，58°C预杂交30分钟，将滤膜取出，浸入新鲜杂交液中，加 入步骤1)获得的DIG-UTP标记的高纯度目标反义RNA探针，42°C杂交过夜。
[0036] ③依次使用低严谨性和高严谨性缓冲液缓清洗滤膜，然后，将滤膜在阻断液和抗 体混合溶液中浸泡，使用洗膜液浸洗滤膜。最后使用检测液和显色液浸泡滤膜，显色后，将 滤膜放入显色成像系统，曝光，拍摄并保存成像图片。
[0037] 本发明提供一种包含所述DIG-UTP标记的反义RNA链的RNA扩增试剂盒。
[0038] 又，一种包含所述DIG-UTP标记的反义RNA链的RNA扩增试剂盒在检测转基因植 物中靶标siRNA池中的应用。
[0039] 本发明中，步骤（1)制备DIG-UTP标记的反义RNA链中所选反应体系和反应条件 可保证生成含有DIG标记的全长目标RNA，进而有效地结合siRNA池中的各个siRNA，而且 此条件下产生RNA的效率最高。
[0040] 步骤⑵中，55~65°C预杂交可以充分地去除没有结合到滤膜上的RNA，提高杂交 的特异性，使siRNA打开双链。37~45°C杂交过夜使探针与目标siRNA充分接触和结合， 且一旦结合，不容易分离。
[0041] 本发明有益效果：
[0042] 1.本发明利用DIG标记核酸得到DIG-UTP标记的反义RNA链及其RNA扩增试剂 盒，用于检测转基因植物中靶标siRNA池，检测过程中无放射性，在一般的生物学实验室就 可以进行合成，且比制作放射性探针需要的设备少，无需特殊的防护措施、成本低。
[0043] 2.与化学修饰的方法相比，DIG-UTP标记的反义RNA链和RNA扩增试剂盒可以多 次使用，这种合成反义RNA链的方法使成本大幅降低。
[0044] 3.本发明特异性高、操作简单。
【附图说明】
[0045] 图1为本发明检测方法的原理示意图。
[0046] 图2为本发明实施例3中使用1 %琼脂糖胶分析样品中RNA总含量的溴化乙锭染 色图。
[0047] 图3为相对应于图2的Northern Blot检测图。
[0048] 图4为本发明实施例5中使用15%聚丙烯酰胺胶分析样品中小RNA总含量的溴化 乙锭染色图。
[0049] 图5为本发明实施例5中使用DIG-UTP反义RNA探针的Northern Blot检测图。
[0050] 图6为本发明实施例6中使用放射性DNA探针的Northern Blot检测图。
[0051] 图2~图6中，泳道1为1号RNA样品（非转基因植物株系），泳道2-3对应2号 RNA样品（转基因植物株系）、3号RNA样品（转基因植物株系）。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。<