br>[0218]45摩尔％至50摩尔％的助表面活性剂（低于45摩尔％，该制剂可能具有稳定性 问题；超过50%，该制剂的转染效率较低），和/或
[0219]30摩尔％至40摩尔％的阳离子表面活性剂，（低于30摩尔％，该制剂的转染效率 较低；超过40%，该制剂可能具有稳定性问题）。
[0220] 对于包括微滴大小在130nm至175nm之间的制剂，将优选使用包括至少5摩尔％ 的两亲性液体和15摩尔％至70摩尔％的至少一种阳离子表面活性剂和如下物质的制剂：
[0221]10摩尔％至25摩尔％，尤其10摩尔％至15摩尔％的助表面活性剂。
[0222] 上述两亲性液体、阳离子表面活性剂和助表面活性剂的摩尔百分比是相对于（两 亲性脂质/阳离子表面活性剂/助表面活性剂/可能的膜融合脂质）的集合。
[0223] 示踪物
[0224] 在本发明的范围内，术语"示踪物"指可以确定纳米颗粒是否被整合到细胞内的分 子。在特定实施方式中，所述示踪物是磁性示踪物、放射性示踪物或荧光团。
[0225] 磁性示踪物可以是钆螯合物或磁性纳米晶体，诸如例如铁、氧化锰或铁-铂 (Fe-Pt)的纳米晶体。
[0226] 放射性示踪物可以是包括放射性核素的化合物，诸如例如mI、lsF、nC，或"mTc或 mIn的螯合物，或金属阳离子6SGa、64Cu的螯合物。
[0227] 荧光团优选是亲脂性荧光团。优选地，所使用的荧光团吸收并且放出可见光或近 红外范围的光。所选择的荧光团适用于体内或体外的方法应用类型。在体内应用的情况 中，可以采取体内荧光成像。对于该非侵入性成像，优选的荧光团吸收并且发射近红外的 光。事实上，为了激发光和由荧光团发出的光可以更好地穿过组织，应当使用吸收和发射近 红外的光（即波长在640nm至900nm之间）的焚光团。在体外应用的过程中，对于所应用 的成像方法，诸如荧光显微镜或FACS(荧光激活细胞分选）类型的细胞计数，通常使用被可 见光波长（典型地在450nm至650纳米之间）激发的荧光团。这些尤其是亲水性花青苷或 FITC(异硫氰酸荧光素）。这些荧光团可以被封装在纳米颗粒的脂质核中，或者当它们是亲 水性时，可以位于纳米颗粒的表面。
[0228]作为亲脂性焚光团，可以例如是在InVitrogen目录（MolecularProbes?手册， 荧光探针和标记技术指南，第11版，2010)的第13章（"用于脂质和膜的探针"）中描述的 化合物。更具体地，尤其可以是作为荧光团的吲哚菁绿（ICG)，脂肪酸的类似物，和经荧光 基团官能化的磷脂，诸如以商品名Bodipy(R)出售的荧光产品诸如Bodipy(R) 665/676 (Ex/ Em.);碳菁的亲脂性衍生物，诸如1，1双十八烷基-3, 3, 3'，3' -四甲基吲哚二碳菁高氯 酸盐（DiD)，例如以参考D-307出售，3,3'-双十六烷基氧碳菁高氯酸盐（DiO)，例如以参 考D1125出售，1，1'-双十六烷基_3,3,3'，3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐（Dil)，例如 以参考D384出售；衍生自鞘脂、类固醇或脂多糖的荧光探针，诸如以商品名BODIPY?TR 神经酰胺、BODIPY?FLC5-乳糖神经酰胺、BODIPY?FLC5-神经节苷脂、BODIPY? FL脑苷脂出售的产品；花青苷、罗丹明、荧光黄（fluorescein)或香豆素的两亲性衍生物， 诸如十八烷基罗丹明B、十八烷基荧光黄酯和4-十七烷基-7-羟香豆素；以及，二苯基己三 稀（DPH)及其衍生物；这些产品全部由Invitrogen出售。
[0229] 根据本发明的优选实施方式，荧光团是吲哚菁绿、1，1 ' _双十六烷 基-3, 3, 3'，3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐、3, 3'-双十六烷基氧碳菁高氯酸盐或 1，1'-双十六烷基_3,3,3'，3'-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐。
[0230]候诜分子
[0231]在本发明的范围内，术语"候选分子"指能够在细胞和/或组织和/或器官中产生 表型变化的任何分子。
[0232]在特定的实施方式中，所述候选分子是中性分子或带负电荷或正电荷的分子。优 选地，所述候选分子带负电荷。
[0233]作为实例，当如上限定的纳米颗粒是阴离子纳米颗粒时，所述候选分子带正电荷， 或者，当如上限定的所述纳米颗粒是阳离子纳米颗粒时，所述候选分子带负电荷。
[0234]在特定的实施方式中，所述候选分子是化学分子。优选地，所述化学分子是药物活 性成分，生物分子，对于物理治疗有用的试剂，或者放射性试剂。优选地，所述化学分子是治 疗剂。
[0235]作为治疗剂的感兴趣的药物活性成分可特别是在治疗AIDS中使用的药剂，在 治疗心脏病中使用的药剂，镇痛药，麻醉剂，食欲抑制剂，驱虫药，抗过敏剂，抗心绞痛剂， 抗心律失常药，抗胆碱能药，抗凝血药，抗抑郁药，抗糖尿病药，抗利尿剂，止吐药，抗惊厥 药，抗真菌剂，抗组胺剂，抗高血压药，消炎药，抗偏头痛剂，抗毒蕈碱剂，抗分支杆菌剂， 抗肿瘤剂，包括抗帕金森剂，抗甲状腺剂，抗病毒剂，收敛剂，封闭剂，血液制品，血液代用 品，强心药（cardiacinotropes)，心血管药，中枢神经系统药，螯合剂，化疗剂，造血生 长因子，皮质类固醇，止咳剂，皮肤病药，利尿药，多巴胺能药，弹性蛋白酶抑制剂，内分泌 剂，麦角生物碱，祛痰剂，胃肠剂，泌尿生殖剂，生长激素触发因子，生长激素，血液学剂，造 血剂，止血剂，激素，免疫抑制剂，白细胞介素，白细胞介素类似物，脂质调节剂，促性腺素 释放剂，肌肉松弛剂，麻醉药拮抗剂，营养物，营养剂，肿瘤治疗，有机硝酸盐，迷走神经类 药（vagomimetics)，前列腺素，抗生素，肾剂，呼吸剂，镇静剂，性激素，兴奋剂，拟交感神 经药，全身抗感染药，他克莫司，溶栓药，甲状腺剂，注意力障碍的治疗，血管扩张剂，花黄 素，降低胆固醇的药剂。特别针对抗肿瘤剂，诸如紫杉酚（紫衫醇）、阿霉素和顺氯氨铂 (Cisplatin)〇
[0236] 生物分子可以是蛋白、肽、抗体、糖和核酸。
[0237] 用于物理治疗的试剂可以是用于温热疗法的化合物，用于光线疗法的在使用光激 发之后释放单线态氧的化合物（即感光剂），和放射性试剂。
[0238] 放射性试剂尤其可以是放射性同位素。
[0239] 感光剂尤其可以是属于四吡咯类的那些感光剂，如卟啉，菌绿素、酞菁、二氢卟 酸、红紫素，P卜啉稀（porphycenes)、脱镁叶绿酸（pheophorbides)，或属于得克萨卟啉 (texaphyrins)或金丝桃素（hypericins)类型的其它感光剂。第一代感光剂可以是血卟 啉，以及血卟啉衍生物（HpD)的混合物（由AxcanPharma以商标名Pho丨.ofrin；&出售）。第 二代感光剂可以是间-四-羟基苯基二氢卟酚（mTHPC ;商标名Foscan?，Biolitec AG)，和 苯并卟啉环A的单酸衍生物（由QLT和NovartisOphthalmics以商标名Visudyne?出售 的BPD-MA)。第二代感光剂与被描述为能在肿瘤样组织处选择性运输的载体的分子（脂质、 肽、糖等）相结合的第二代感光剂的制剂被称为第三代感光剂。
[0240] 在一种实施方式中，所述带负电荷的候选分子是核酸。优选地，所述核酸包括可以 调节RNA干扰机制的核苷酸序列或由可以调节RNA干扰机制的核苷酸序列组成。在特定的 实施方式中，所述核苷酸序列包括经修饰的核苷酸，诸如肌苷。
[0241] "可以调节RNA干扰机制的核苷酸序列"指经由RNA-RNA、RNA-DNA或蛋白-RNA的 相互作用（Egholmet&1.，1993，似1：1^6,365:566)与1?熟革[11点结合，并且改变该1?熟革[11点的 活性的反义核酸（综述参见SteinandCheng, 1993,Science, 261，1004和Woolfetal.，U. S.Pat.No. 5, 849, 902)。通常，反义核酸的连续序列与靶序列互补。但是，在特定的实施方 式中，反义核酸可以与底物结合，以便底物形成环或发卡结构，和/或反义核酸可以向后折 叠以形成环或发卡结构。因此，（i)反义核酸可以与2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个非连续 的底物序列互补，和/或（ii)反义核酸的非连续序列的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个部 分可以与革E序列互补（例如，参见Crooke, 2000,MethodsEnzymol.，313:3-45)。
[0242] 反义核酸进入一般被称为RNA干扰途径（RNAi)的细胞途径。术语"RNA干扰" 指RNA的选择性细胞内降解，另外已知的名称为"基因沉默"。RNAi还包括通过小干扰 RNA(siRNA)抑制翻译。iRNA可以例如是通过引入长RNA双链（dsRNA)或siRNA来起始。
[0243] 在特定的实施方式中，所述可以调节RNA干扰机制的核苷酸序列是：
[0244] 小干扰RNA(siRNA)( "短的干扰RNA"或"小干扰RNA"），
[0245]嵌段核酸（blockednucleicacid)( "锁核酸"（LNA))，或
[0246]微小RNA(miRNA)( "微小RNA" 或"miRNA"），或
[0247]长双链RNA(dsRNA)( " 长双链RNA"）。
[0248] "短的干扰RNA"或"siRNA"是用于靶向感兴趣基因的核苷酸的RNA双螺旋。RNA 双螺旋指通过在RNA分子的两个区域之间互补配对形成的结构。在特定的实施方式中， siRNA双螺旋的长度在15个核苷酸至50个核苷酸之间，优选在20个核苷酸至35个核苷酸 之间，仍然优选在21个核苷酸至29个核苷酸之间。在特定的实施方式中，双螺旋的长度可 以是至少 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、 50个核苷酸。在特定的实施方式中，双螺旋的长度可以是至多45、40、35、34、33、32、31、30、 29、28、27、26、27、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15个核苷酸。811?熟的双螺旋部分可 以是发卡结构的一部分。除了双螺旋部分之外，发卡结构还可以含有在形成双螺旋的序列 之间的环。环的长度可以不同。在特定的实施方式中，环的长度是5、6、7、8、9、10、11、12或 13个核苷酸。两个脱氧胸苷通常被添加在它的每一条链的3'部分中，以增加其稳定性。因 此，脱氧胸苷已经被连接至其3'部分的siRNA在根据本申请的siRNA的定义之内。siRNA 允许通过干扰编码靶蛋白的信使RNA来降低该蛋白的表达。
[0249] 术语"长双链RNA"（dsRNA)指基因组或合成来源或来源于表达载体的表达的且 在它的片段或部分中经修饰或未经修饰的寡核糖核苷酸或多核糖核苷酸，可以部分或全部 是双链的，并且它的末端可以是平的（"平末端"）或在5'和3'中含有剩余末端（leaving end)，并且还可以具有发卡形状。在特定的实施方式中，dsRNA的大小在250bp至2000bp 之间，优选在300bp至lOOObp之间。在特定的实施方式中，dsRNA的大小至少是150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、 400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500bp。在特定的实施方 式中，dsRNA的大小至多是 3000、2500、2000、1500、1000、950、900、850、800、750, 700、650、 600、550、500、450、400、350、300bp。
[0250] 在一种实施方式中，所述核苷酸序列是锁核酸。
[0251] 锁核酸是单链RNA和/或DNA的核苷酸序列，其至少一个核酸含有在核糖的2位 羟基和碳原子4之间的亚甲基桥。这是合成的核苷酸序列。锁核酸是微小RNA的抑制剂， 并且允许调节一种或多种靶蛋白的表达，该靶蛋白的mRNA受到来自所述微小RNA的RNA序 列的干扰。所述调节最经常是去除蛋白表达的抑制。
[0252] 在一种实施方式中，所述核苷酸序列是微小RNA。
[0253] 微小RNA是单链RNA的核苷酸序列（大约100个碱基）。这是合成的核苷酸序列。
[0254] 微小RNA允许通过干扰分别编码这些蛋白的一种或多种mRNA来调节一种或多种 靶蛋白的表达。所述调节最经常是抑制蛋白的表达。
[0255]唯一DNA标答
[0256] "唯一DNA标签"指候选分子的特异性双链或单链核苷酸序列。
[0257] 在特定的实施方式中，所述唯一DNA标签由具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100 个核苷酸，或至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50 个核苷酸的单链DNA序 列组成。在特定的实施方式中，所述唯一DNA标签由具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100 个碱基对（bp)，或至多 100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50 个bp的双链DNA 序列组成。
[0258] 优选地，在根据本发明的纳米颗粒库中或在根据本发明的筛选方法中，所述唯一 DNA标签由具有至少50个核苷酸或bp的DNA序列，优选双链DNA组成，在一条链上并且以 5'_3'的顺序由以下序列组成：
[0259] 与库的所有唯一DNA标签共有的至少20个核苷酸的第一序列，
[0260] 对如上限定的候选分子具有特异性的至少10个核苷酸的单一序列，
[0261] 与库的所有唯一DNA标签共有的至少20个核苷酸的第二序列。
[0262] 所述第一和第二序列尤其用于扩增和/或测序所述唯一DNA标签。为此，优选的 是，所述第一或第二序列具有在细胞、组织或器官的基因组中不存在的核苷酸序列，其中起 源于所述细胞、组织或器官的细胞与纳米颗粒的库接触。例如，（i)当与纳米颗粒的库接触 的细胞是人类细胞时，所述第一和第二序列不是人类基因组的一部分；（ii)当与纳米颗粒 的库接触的细胞是诸如啮齿类（大鼠、小鼠）细胞的动物细胞时，所述第一和第二序列不是 所述动物基因组的一部分；（iii)当与纳米颗粒的库接触的细胞是植物细胞时，所述第一 和第二序列不是所述植物基因组的一部分。优选地，所述第一或第二序列包括至少1、2、3、 4、5、6或更多个经修饰的核苷酸。例如，所述第一或第二序列包括至少1、2、3、4、5、6或更多 个肌苷。
[0263] 在特定的实施方式中，所述第一和第二序列是相同或不同的，优选所述第一和第 二序列是不同的。这样可以在扩增步骤中对所有标签都使用一对引物。在特定的实施方 式中，所述第一和第二序列的长度为至少20、25、30、35、40、45、50个核苷酸，或至多50、45、 40、35、30、25、20 个核苷酸。
[0264] "对候选分子具有特异性的至少10个核苷酸的单一序列"指在娃片上（insilico) 与确定的候选分子相关联的序列。因此，在纳米颗粒的库中，每一种候选分子都与至少10 个核苷酸的单一序列相关联，并且可以利用包含在唯一DNA标签中的该单一序列来鉴定。 在特定的实施方式中，对候选分子具有特异性的所述单一序列的长度为至少1〇、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50 个核苷酸，或至多 50、45、40、 35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10 个核苷酸。
[0265] 在特定的实施方式中，所述单一序列具有在细胞、组织或器官的基因组中不存在 的核苷酸序列，其中起源于所述细胞、组织或器官的细胞与纳米颗粒的库接触。例如，（i)当 与纳米颗粒的库接触的细胞是人类细胞时，所述单一序列不是人类基因组的一部分；（ii) 当与纳米颗粒的库接触的细胞是诸如啮齿类细胞（大鼠、小鼠）的动物细胞时，所述单一序 列不是所述动物基因组的一部分；（iii)当与纳米颗粒的库接触的细胞是植物细胞时，所 述单一序列不是所述植物基因组的一部分。优选地，所述单一序列包括至少1、2、3、4、5、6 或更多个经修饰的核苷酸。例如，所述单一序列包括至少1、2、3、4、5、6或更多个肌苷。
[0266] 所述唯一DNA标签的合成可以使用本领域技术人员已知的方法进行。
[0267] 用于靶向细朐和/或器官的牛物配体
[0268] 靶向生物配体可以例如是抗体、肽、糖、适体、寡核苷酸或如叶酸的化合物。
[0269] 根据一种实施方式，所述靶向生物配体与两亲性化合物，尤其与助表面活性剂接 枝在制剂微滴的表面处，所述制剂为包括如上限定的连续的水相和至少一种分散相的纳米 乳剂的形式。纳米乳剂因此包括枝接的助表面活性剂。在这种情况中，助表面活性剂起到 允许靶向生物配体被容纳在表面的间隔物的作用。例如，当生物配体是包括一个或多个半 胱氨酸的肽时，可以通过巯基-马来酰亚胺偶联确保与表面活性剂的亚烷基氧链的枝接。
[0270] 纳米颗粒的组分的宙位
[0271] ?当纳米颗粒是无机的时
[0272] 当纳米颗粒是无机的时，例如当纳米颗粒是金纳米颗粒或磁性纳米颗粒或半导电 材料的纳米晶体时，如上限定的候选分子、示踪物和唯一DNA标签定位在所述无机纳米颗 粒的表面处。优选地，如上限定的候选分子、示踪物和唯一DNA标签以非共价的方式被复合 在所述无机纳米颗粒的表面处。
[0273] ?当纳米颗粒是有机的时
[0274] 当纳米颗粒是有机的时，例如当纳米颗粒是阳离子载体时，取决于候选分子、示踪 物和唯一DNA标签的性质，如上限定的候选分子、示踪物和/或唯一DNA标签定位在所述有 机纳米颗粒的表面处，和/或被封装在所述有机纳米颗粒中。
[0275] 在特定的实施方式中，（i)当所述纳米颗粒是包括如上限定的连续的水相和至少 一种分散相的纳米乳剂的形式的制剂微滴时，和（ii)当所述候选分子带负电荷时：
[0276] 所述带负电荷的候选分子和所述唯一DNA标签利用与阳离子表面活性剂的静电 相互作用被维持在制剂的分散相的微滴表面处，即它们因此定位在微滴的表面处，在微滴 的冠处，在冠的亲水侧上，
[0277] 如上限定的示踪物定位在微滴的核中。
[0278] 相应地，在一种优选的实施方式中，根据本发明的制剂微滴以核-冠的形式构成， 其中：
[0279] 核包括：
[0280] 增溶脂质，
[0281] 可选的油，
[0282] 示踪物，
[0283] 冠包括：
[0284] 两亲性脂质，
[0285] 阳离子表面活性剂，
[0286] 助表面活性剂（可选的枝接有感兴趣的分子），
[0287] 可以调节干扰RNA内源性机制的核苷酸序列，
[0288] 唯一DNA标签，
[0289] 可选的膜融合脂质，
[0290] 可选的式⑴的表面活性剂，
[0291] 可选的靶向生物配体。
[0292] 除了siRNA与上述的脱氧胸苷可选结合之外，所述核苷酸序列未经化学修饰并且 它们不是变性的。特别地，所述核苷酸序列不与纳米颗粒共价结合。所述核苷酸序列尤其 不与助表面活性剂，或两亲性脂质，或可选的成像试剂共价结合。事实上，所述核苷酸序列 仅通过与阳离子表面活性剂的静电相互作用而与纳米乳剂的微滴结合。这是非常有利的， 因为所述核苷酸序列一旦在它们的作用位点被释放，所述核苷酸序列不是变性的并且可以 起到预期的作用。进一步地，不需要制备昂贵的核苷酸序列的衍生物。市场上可买到的核 苷酸序列因此可以与微滴复合，且事先不需进行任何修饰。
[0293] 在特定的实施方式中，（i)当所述纳米颗粒是包括如上限定的连续的水相和至少 一种分散相的纳米乳剂的形式的制剂微滴时，和（ii)当所述候选分子是化学分子时，根据 本发明的制剂微滴以核-冠的形式构成，其中：
[0294] 核包括：