一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域中的基因工程技术领域，涉及一种三顺反子肌肉特异双 向共表达基因转移体及制备方法
【背景技术】
[0002] 在转基因动物中外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。更需要多基因，组 织特异性共表达的载体。
[0003] MSTN，又称肌肉生长抑制素，属于转化生长因子超家族成员，1997年 McPherron、Lawler首次制备了 MSTN基因敲除小鼠[1]，证实它最重要的功能即对骨骼肌的 生长与发育负调控骨骼肌生长。MSTN作为一种分泌型蛋白主要由骨骼肌产生，在不同物种 中MSTN基因都由3个外显子（exonl/2/3)和2个内含子（intronl/2)组成，在哺乳动物中 MSTN的成熟肽序列同源性很高，例如人和牛的相似度为98. 2%。自然突变或者通过基因 操作手段制备的MSTN功能缺失型的动物（如小鼠、牛、羊等）表现出骨骼肌肥大的双肌效 应，是一种常染色体隐性遗传的性状 [2 3]，因此在家畜育种中如何有效阻断或抑制MSTN的 表达，如何使MSTN失活成为家畜育种的研究热点。在医学方面抑制MSTN能够增强横纹肌 生长，治疗肌肉萎缩，减少肥胖，改善心脏收缩性，因此，更多抑制MSTN表达的基因操作方 法在不断的发现和研究中。
[0004] 核基质结合区（MARS)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段 DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。
[0005] MARs的长度一般为300 - lOOObp，也有的长达几个kb，维持其活性的最小长度约 是300bp，MARs是非编码序列，AT含量高达70 %，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的 结构基元，如烟草中发现TM2序列具备一般MARs序列的基本特征：其序列全长lOOlbp，AT 含量为62.8%，序列上含有一个典型的1'-13(?，两个潜在的0嫩解旋序列仏4141'1')和一个 潜在的拓扑异构酶II结合位点（CTTTATATTGTTGAC)。
[0006] 研究表明，MARs序列的功能包括边界因子（boundarye lement)作用、染色质调节 作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARS对转基因表达的调控作用，鉴于 MARs与基因表达间的关系，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉 默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。
[0007] MRF4,肌肉特异启动子，真核生物启动子位于基因5'端上游转录起始位点附近，是 包含核心启动子以及上游转录调控元件的一段DNA序列，这些转录调控元件控制着基因表 达的强度和特异性。肌肉特异性启动子的上游调控元件种类、数量和排列顺序决定着基因 在肌肉中的特异性表达。目前，人们分离了许多肌肉特异性启动子，如骨骼肌a- actin、心 肌a -actin、肌肉肌酸激酶（MCK)、肌球蛋白重链（MyHC)、结蛋白（desmin)和生肌调控因子 家族（MyoD、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特异性基因的启动子，并对这些启动子的转录 活性和其对肌肉细胞的增殖、分化作用进行深入研究]。本MRF4是根据"肌肉特组织特异 性启动子生物信息学设计路线"最终优化的MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点 及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
[0008] FAD3是在植物中发现的一种脂肪酸去饱和酶基因，催化细胞中亚油酸到亚麻酸的 反应，研究表明在非光合作用的组织中，FAD3蛋白主要为co-3去饱和酶的功能，催化组织 中约80%三稀脂肪酸的合成。〇_3多不饱和脂肪酸（〇_3polyunsaturated fatty acids， PUFA)是组成人体必需的物质，对健康非常重要，《-6与0-3PUFA比值过高可导致心血管 疾病、癌症、炎症以及自身免疫反应等疑难病。但由于哺乳动物体内缺乏《_3脂肪酸去饱 和酶，自身不能催化合成《-3PUFA，只能通过饮食获得。
[0009] RNAi技术，用基因打靶技术敲除MSTN基因，已在多种模式动物中成功运用，但该 技术需要消耗大量的时间和资源而且往往效率很低。由于RNAi转基因小鼠的出现，使在哺 乳动物个体水平上研究靶基因的敲减成为了可能。RNAi技术的优越性：①RNAi效应可以遗 传。②dsRNA的表达受到特异性启动子的调控，因而可以有目的地在特定时相内启动RNAi。 避免基因突变或敲减进行可遗传的修饰时，会过早的沉默基因，从而产生致死表型，使得无 法进一步研究，从这点来看RNAi比基因敲除具有优越性。另外，利用RNAi可以很快得到许 多有关基因的功能信息，而且可以达到研究信号通路中多个基因的目的。有研究证明，大于 50bp的外源双链RNA转染细胞后，会引起干扰素途径，但转染19-23bp的shRNA却可以避免 干扰素途径，从而特异性降解靶基因，而且这种shRNA具有高效、稳定的特点。
[0010] IRES序列，内部核糖体进入位点序列，真核生物大多数蛋白质合成采用了依赖帽 子结构的翻译起始方式.但一组缺乏帽子结构的RNA病毒的蛋白质合成起始是依赖其5' 端非翻译区（untranslated region，UTR)，即内部核糖体进入位点（IRES)，该位点是一段高 度保守序列，可使其前后基因在同一启动子下转录一个双顺反子mRNA，而转译时使两基因 分别翻译成两个独立的产物。因此，在真核生物转基因表达载体构建中，常用于构建在一个 启动子下IRES连接两个基因编码序列，实现双顺反子共表达。
[0011] DsRed2基因，红色荧光蛋白基因，常用于转基因的标志性基因。
[0012] 目前，构建真核表达载体多为非组织特异、单顺反子或双顺反子表达载体。而生物 改造，尤其经济形状、数量性状的改造往往涉及多个基因，因此，多基因共表达的真核载体 的构建，至关重要。多基因单向共表达，往往产生相互影响。而非组织特异性启动子在所有 组织中均表达，并非需要，有时是有害的。
【发明内容】
[0013] 为解决上述问题，本发明提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体及 制备方法，能使三种目的基因双向高效组织特异共表达，无质粒载体主干序列、无抗性选择 基因，洁净且安全的三顺反子共表达基因转移体。
[0014] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0015] 三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体，其特征在于，基因转移体包括MARs 牛核基质结合区、以牛肌肉抑素（MSTN)第三号外显子（926-947位点）为靶点的小发夹 RNA(shRNA)、MRF4、以MRF4为优化合成的肌肉特异启动子、以FAD3为人源化n-3去饱和酶 基因、IRES为内部核糖体进入位点、DsRed红色荧光蛋白基因和终止信号区SV40polyA，所 述独立基因转移体无原核主干载体序列。
[0016] 其中，所述的基因转移体的全序列为SEQ N0. :17。
[0017] 其中，置换CMV的肌肉特异性启动子MRF4的序列为SEQ ID NO :9 ;根据"肌肉特组 织特异性启动子生物信息学设计路线"优化MRF4序列，在两端添加Kpnl和Smal酶切位点 及保护碱基，将序列送至takara公司，进行人工合成。
[0018] 其中，置换U6的MRF4的序列为SEQ ID N0 :9 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0019] MRF4-F 正义链，5，到 3' ：SEQ ID N0 :1 ;
[0020] MRF4-R 反义链，5，到 3' ：SEQ ID NO :2。
[0021] 其中，FAD3的序列为SEQ ID NO :10 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0022] FAD3-F 正义链，5，到 3' ：SEQ ID N0 :3 ;
[0023] FAD3-R 反义链，5，到 3' ：SEQ ID NO :4。
[0024] 其中，IRES的序列为SEQ ID NO :11 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0025] IRES-F 正义链，5'到 3' ：SEQ ID N0 :5 ;
[0026] IRES-R 反义链，5'到 3' ：SEQ ID NO :6。
[0027] 其中，DsRed基因为SEQ ID NO :12 ;通过如下引物进行PCR获得：
[0028] DsRed-F 正义链，5'到 3' ：SEQ ID N0 :7 ;
[0029] DsRed-R 反义链，5'到 3' ：SEQ ID NO :8。
[0030] 还提供了一种三顺反子肌肉特异双向共表达基因转移体的制备方法，包括如下步 骤：
[0031] S1、，人工合成 MRF4,并用 MRF4 置换初始载体 pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN 中的 CMV， 得 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN ;
[0032] S2、用克隆的 MRF4 置换 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN 中的 U6，得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN ；
[0033] S3、用克隆的 FAD3 置换 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN 中的 FSTN，得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3 ；
[0034] S4、进行 IRES 序列的克隆，并连入 FAD3 下游，得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IR ES ；
[0035] S5、克隆 DsRed，连入 IRES 下游，构建质粒载体 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES -DsRed ；
[0036] S6、用Xhol I、AfI II对步骤S5所得的质粒载体双酶切，电泳分离，获得三顺反子 肌肉特异双向共表达基因转移体 MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40po 1 yA。
[0037] 其中，所述步骤S1具体包括如下步骤：
[0038] SI 1、根据"肌肉特组织特异性启动子生物信息学设计路线"优化MRF4序列，在两 端添加Kpnl和Smal酶切位点及保护碱基，并将序列送至takara公司，进行人工合成；
[0039] S12、将步骤S11合成的MRF4肌肉特异启动子序列连接到PMD19T-simple载体中， 挑取穿刺菌加