水稻抗褐飞虱QBph3和QBph4基因的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子标记制备技术领域。具体涉及到同时来源于导入系IR02W101 中两个水稻抗褐飞虱基因QBph3和QBph4紧密连锁的分子标记的制备，以及所述的分子标 记在水稻褐飞虱抗性育种和品种改良上的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国的主要粮食作物，褐飞虱是目前活跃于东南亚稻区的主要害虫。它是 一种典型的刺吸式害虫，通过其口针吸食稻株韧皮部汁液，轻者引起水稻营养物质运输受 阻，影响千粒重，重则引起稻株下部干枯、腐烂、倒瘫，称之为"虱烧"，导致水稻大面积减产 甚至绝收。目前防治褐飞虱主要依靠化学杀虫剂，但是这种方法费时费工，且污染环境。同 时，杀虫剂的过量使用还会杀死其天敌及增强抗药性，最终会引起飞虱的再次猖獗。利用水 稻自身的抗性基因来培育抗虫品种是目前最为经济有效的防控褐飞虱的方法。
[0003] 迄今，已经在籼稻和野生稻中共发现和报道了至少29个褐飞虱抗性基因（Wuet al. 2014)。其中有 14 个基因（Bphl、bph2、Bph3、Bph6、Bph9、Bphl2、Bphl4、Bphl5、Bphl8、 Bphl9、Bph20、Bph21、Bph27和Bph28)已经应用分子标记精细定位到水稻染色体某一特定 区段内。最近一个较大的进展是Bphl4的克隆，该基因属于CC-NBS-LRR基因家族，编码的 蛋白质与植物抗病性相关（Duetal. 2009)。但是褐飞虱抗性基因的遗传基础研究依然进 展缓慢，而可供育种应用的基因更是少之甚少。因此迫切需要挖掘更多的优良抗性基因，并 将其导入到常规品种中以增强其褐飞虱抗性。
[0004] 一般来说，野生稻中富含优良的抗性基因，特别是褐飞虱抗性基因。但是野生稻往 往带有其它不良性状，且由于与栽培稻亲缘关系较远，很难与栽培稻杂交或是杂交后代种 子育性较低甚至不育。因此直接利用野生稻中的抗性基因将难于操作。通过回交育种和抗 性筛选将野生稻中的抗性基因导入到栽培种中，获得一系列抗性明显改良的导入系，并通 过感虫亲本与导入系杂交构建F2分离群体，结合分子标记遗传图谱来定位褐飞虱抗性基因 是目前从野生稻中发掘褐飞虱抗性基因的一种有效方法。目前已利用导入系定位了很多来 自野生稻的优良抗性基因，如来自于小粒野生稻的Bph20、Bph21 (Rahman et al. 2009)，来自 于澳洲野生稻的BphlO、Bphl8 (Ishii et al. 1994 ; Jena et al. 2006)，来自于药用野生稻的 Bphl4> Bphl5> bphll> Bphl3 (Huang et al. 2001 ；Hirabayashi et al. 1998 ；Renganayaki et al. 2002)等。
[0005] 目前，只有很少的褐飞虱抗性基因被用于水稻育种而在生产上应用。且已有证据 表明单个主效抗性基因的导入并不能持久解决褐飞虱逐年爆发的问题。多个抗性基因的 聚合以及轮换能够获得持久抗性，并有效地遏制褐飞虱频繁爆发。由于抗虫性鉴定的复杂 性，利用常规育种手段往往难以有效导入或聚合多个抗褐飞虱基因以培育抗虫品种。本发 明通过构建遗传群体和发展分子标记，成功发现了两个新的褐飞虱抗性基因，并开发了一 系列与抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记，借助分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS)技术可以有目的地将抗虫基因精确导入和聚合，从而高效率快速选育持久 抗褐飞虱品种，有效抑制褐飞虱种群数量，节约人工和农药成本，保持水稻稳产和增产。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种水稻抗褐飞虱主效基因新位点QBph3和QBph4的分子标 记，通过实验检测与这些抗性基因位点连锁或共分离的分子标记，可以在苗期就能准确预 测水稻植株的褐飞虱抗性，从而加快褐飞虱抗性水稻品种的选择。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现：
[0008] 申请人通过是筛选获得一个水稻抗褐飞虱主效基因QBph3的分子标记，它由下述 之一的引物对通过PCR程序扩增获得，所述的引物对的DNA序列如下所示：
[0009] 1)标记引物ql，
[0024] 申请人通过筛选在上述同一材料中获得另一个水稻抗褐飞虱主效基因QBph4的 分子标记，其由下述之一的引物对通过PCR程序扩增获得，所述的引物对的DNA序列如下所 示：
[0055] 显然上述两个分子标记可应用于选育抗褐飞虱水稻的遗传改良中。
[0056] 申请人提供了一种筛选水稻抗褐飞虱主效基因QBph3的分子标记方法，其要点 是：利用上述涉及主效基因QBph3的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测所得的扩增产 物，若利用标记引物ql能扩增出134bp的DNA片段，或利用标记引物m3能扩增出85bp的 DNA片段，或是利用标记引物t6能扩增出1197bp的DNA片段，或是利用标记引物c3-14能 扩增出242bp的DNA片段，或是利用标记引物f3能扩增出133bp的DNA片段，均标志着水 稻抗虫导入系IR02W101抗褐飞虱基因位点QBph3的存在。QBph3被精细定位在水稻第3染 色体长臂t6和f3之间，与C3-14共分离，因此利用标记C3-14筛选目的基因的单株效率最 高，其它标记如ql和m3均能用于筛选含有目的基因的抗褐飞虱水稻品种。
[0057] 与此同时，申请人提供了另一种筛选水稻抗褐飞虱主效基因QBph4分子标记方 法，其要点是：利用上述基因QBph4构建的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测所得的 扩增产物，若利用标记引物J409能扩增出137bp的DNA片段，或是利用标记引物p6能扩增 出141bp的DNA片段，或是利用标记引物p9能扩增出145bp的DNA片段，或是利用标记引物 P17能扩增出168bp的DNA片段，或是利用标记引物xc4-27能扩增出207bp的DNA片段，或 是利用标记引物c4-5能扩增出133bp的DNA片段，或是利用标记引物xc4-7能扩增出118bp 的DNA片段，或是利用标记引物HJ16能扩增出152bp的DNA片段，或是利用标记引物J417 能扩增出136bp的DNA片段，或是利用标记引物IN156能扩增出173bp的DNA片段，均标志 着水稻抗虫导入系IR02W101抗褐飞虱基因位点QBph4的存在。QBph4被精细定位在水稻第 4染色体短臂P17和xc4-27之间，也就是说这两个标记与褐飞虱抗性基因QBph4距离最近， 利用这两个标记筛选目的基因的单株可靠性最高，其它分子标记均能用于筛选该目的基因 的单株。
[0058] 此外，申请人还提出了利用主效基因QBph3和QBph4构建的的分子标记在水稻改 良中的应用的方法，该方法在于用于筛选褐飞虱抗性水稻：在杂交分离后代中，利用上述QBph3的紧密连锁标记引物（如C3-14)扩增待检水稻的基因组DNA，并检测所得的扩增产 物，若扩增产物的片段与上述检测的一致，均标志着杂交后代中存在QBph3位点；或/和通 过QBph4紧密连锁标记引物（如xc4-27)扩增后代单株的DNA，若扩增产物的片段与上述检 测的一致，均标志着杂交后代中存在QBph4位点。
[0059] 本发明的优点在于：
[0060] (1)本发明首次在水稻抗褐飞虱导入系IR02W101中利用分子标记精细定位了两 个新主效抗性基因QBph3和QBph4。
[0061] (2)本发明中与抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记可靠性高，鉴定方便。这些 分子标记都是在坚实的遗传实验结果上验证的，且引物特异性高，多态性广，可操作性强， 扩增出的目标片段单一，容易检测。因此只要通过简单的实验检测这些分子标记，就可以准 确预测水稻植株中褐飞虱抗性的存在与否，进而预测其褐飞虱抗性，不受环境影响，检测方 便、快捷、高效。
[0062] (3)本发明可以大大提高常规育种的辅助选择效率，节约成本。常规育种特别是抗 性育种中，经常是通过表型选择来筛选抗性单株用于后续的杂交或回交转育。但是水稻的 褐飞虱抗性鉴定程序非常复杂，同时受到环境和人力财力的限制。比如，在抗性鉴定之前， 要先准备虫源并饲养褐飞虱群体；在人工接虫前还要保证褐飞虱群体单一、生物型一致、虫 龄适当一致并与秧苗同步；此外接虫后还要用纱网罩住，控制室内湿度和温度，防雨防风防 天敌；最后鉴定标准大多是肉眼观察，主观性太强，可靠性就很低。因此利用常规手段进行 抗性育种难度较大，成本高。然而通过分子标记检测水稻植株中的褐飞虱抗性基因位点，仅 在苗期就能快速鉴定出高抗纯合基因型的单株，及时淘汰感虫单株，不仅节约生产成本，而 且大大提高抗性材料的选择效率，极大地缩短水稻品种的育种周期。
【附图说明】
[0063]图1.本发明的总体技术路线图。
[0064] 图2.亲本珍汕97B和IR02W101以及BC1F1和BC1F2的抗性分数次数频率分布图。 图中标记：A，接虫10天后。B，接虫12天后。
[0065] 图3.水稻品种IR02W101抗褐飞虱主效基因QBph3在第3染色体上的定位。图中 标记：A