外，表1中显示轻链和重 链⑶R多肽。
[0063] 用于本发明方法和用途的VEGFRl抗体包括但不限于抗体I和II，可以基本上如 下产生并纯化。可以使用预先确定的最佳HC:LC载体比率或同时编码HC和LC的单个载 体系统，用分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染适宜的宿主细胞，如HEK293EBNA或CH0。 使用许多常用技术中的任一项纯化其中已经分泌有抗体的澄清培养基。例如，可以将培养 基便利地施加至用于Fab片段的MabSelect柱（GEHealthcare)或KappaSelect柱（GE Healthcare)，所述柱已经用相容性缓冲液如磷酸缓冲盐溶液（pH7.4)平衡。可以洗涤所 述柱以移除非特异性结合的组分。可以洗脱结合的抗体，例如，借助PH梯度洗脱（如20mM TRIS缓冲液pH7至10mM柠檬酸钠缓冲液pH3.0,或磷酸缓冲盐溶液pH7. 4至100mM 甘氨酸缓冲液PH3. 0)。可以检测抗体级分，如通过SDS-PAGE检测，并且随后可以将这些级 分汇集。取决于预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常见技术，将抗体浓缩和/或无 菌过滤。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换、多元或羟基磷灰石层 析有效地移除可溶性聚集物和多聚体。可以将产物立即在_70°C冷冻或可以冻干。
[0064]表I:SEQIDNO
[0065]
[0068]实施例2 :VEGFR1抗体的结合动力学、亲和力和特异性
[0069] 可以根据本领域已知的方法，通过使用表面等离子体共振（SPR)生物传感器如 BIAcore<?2：0：00> B[Acore?3000 ^BIA:c0re?W(GEHealthcare) 本发明方法和用途的抗体针对人VEGFRl及人VEGFR2和人VEGFR3的结合动力学、亲和力和 选择性。结合动力学、亲和力和特异性可以在本分析中用来显示所公开的针对小鼠VEGFRl 的抗体在体外类似于所公开的针对人VEGFRl的抗体发挥作用。
[0070] 可以使用SPR测定法在用HBS-EP运行缓冲液（GEHealthcare#BR-1006-69)所引 发的Biacore仪上确定该抗体针对多种物种的VEGF受体的结合亲和力、特异性、动力学和 化学计量，并且分析温度可以设定在25°C或37°C。可以在2个或全部4个流动小室（Fe) 上使用标准NHS-EDC胺偶联生成含有固定化山羊抗-(人或小鼠）K(K链特异性）或蛋白 A的CM4芯片（在37°C用于TlOO的S系列）并且将其用来利用捕获方法。可以通过稀释 入运行缓冲液，以Iyg/mL和10yg/mL之间的浓度范围制备抗体样品或VEGF-Fc受体。可 以按不同浓度（200nM至0. 078nM浓度范围，2倍稀释增量）制备VEGFRl-His、抗体II或抗 体IV。每个分析循环可以由以下组成：（1)在独立流动小室（Fc2、Fc3和Fc4)的固定化蛋 白A或抗（人或小鼠）K(K链特异性）上捕获抗体样品，（2)在全部Fc上以50yL/分钟 注射250yL(300秒）加His标签的受体、抗体II-Fab或抗体IV，（3)返回缓冲液流20分 钟以监测解离相，（4)用25yL(30秒）甘氨酸注射pH1. 5再生芯片表面，（5)用25yL(30 秒）HBS-EP注射平衡芯片表面。数据可以使用标准双参考法处理并对于Biacore2000使用 Biacore评价软件4. 1版及对于BiacoreTlOO使用Biacore评价软件2. 0. 3版，针对1:1结 合模型拟合，以确定结合速率（k?，M1S1单位）、解离速率（k。"，s1单位）和R_ (RU单位）。 可以从关系Kd=kw/k?计算平衡解离常数（KD)。
[0071] 在基本上如实施例2中所述那样进行的实验中，抗体I、II、III和IV以相似高的 结合亲和力（Kd)结合其相应物种的VEGFRl(参见表2)。通过不与至多200nM的VEGFR2和VEGFR3受体结合，抗体II和IV均对VEGFRl显示良好选择性。抗体II对人和食蟹猴VEGFRl 受体具有牢固的皮摩尔亲和力。对于人VEGFR1，抗体II在37°C的Kd是740+/-34pM(n= 3)并且对于食蟹猴VEGFR1，抗体II在37°C的Kd是554+/-29pM(n= 3)。
[0072] 表2 :使用表面等离子体共振法（SPR)，抗体I、II、III和IV对多个物种的VEGFR1、 VEGFR2或VEGFR3受体的体外结合参数
[0073]
[0074] (a)从每个独立实验计算为Kd= kMfZXn并且通过平均化几种独立KD值获得最终 值。nd=因为至多约200nM浓度的受体时未观察到结合作用而未测定
[0075] 实施例3 :在培养的表达嵌合人VEGFRl/EpoR或小鼠VEGFRl/小鼠EpoR受体的细 胞中VEGFRl由抗体II和抗体IV内化
[0076] 可以通过在表达嵌合小鼠VEGFRl/小鼠EPOR或人VEGFRl/小鼠EPOR受体的细胞 中测量VEGFRl内化，测定VEGFRl抗体内化并随后降解VEGFRl的能力。VEGFRl内化可以在 本分析中用来显示所公开的针对小鼠VEGFRl的抗体在体外类似于所公开的针对人VEGFRl 的抗体发挥作用。当表达嵌合VEGFRl/Epo受体时，BaF3细胞在IL-3不存在的情况下存活。 通过抗体介导的内化作用减少细胞表面嵌合VEGFRl/EpoR导致细胞死亡。
[0077] 人和小鼠VEGFRl胞外结构域和跨膜结构域可以与Epo受体的胞内结构域融合。可 以将嵌合受体克隆入pMSCVpuro逆转录病毒载体（Clontech，目录号634401)。可以通过 逆转录病毒感染，生成BaF3-小鼠VEGFRl-小鼠EpoR细胞和BaF3-人VEGFRl-小鼠EpoR细胞。可以通过分别用小鼠VEGFRl/小鼠EpoR或人VEGFRl/小鼠EpoR转染PhoenixEco 逆转录病毒包装细胞（ATCC)，产生逆转录病毒。逆转录病毒粒子可以用来转导BaF3细胞。 BaF3-VEGFRl-EpoR细胞可以在RPMI-1640(ThermoScientific，#SH30255. 01)、10% (v/v) FBS(Invitrogen，#10082)、ImM丙酮酸钠（ThermoScientific，#SH30239. 01)、100U/500mL 青霉素G和 100yg/500mL链霉素（ThermoScientific，#SV30079. 01)、2yg/mL嘌呤霉素 (Calbiochem#540411) ;5ng/mL鼠IL-3(R&D#403-ML-CF)中培养。
[0078] 为了进行内化测定法，可以将转导的BaF3细胞用20mL不含IL-3的培养基洗涤3 次以洗去IL-3。可以将100y1在不含IL-3的培养基中的细胞添加至白色/透明96孔组 织培养板（BD#353377)的每个孔以实现l-2xl04个细胞/孔。VEGFRl和同种型对照抗体可 以用不含IL-3的培养基连续稀释以实现待测试的2倍终浓度，并且随后可以将100yI2X 抗体溶液添加至每个孔。随后可以将平板在37°C于95%相对湿度和5% (VZV)CO2T温育。 在培养6日后，可以通过CellTiter-Gl0发光细胞生存力测定法（Promega#G7571)确定活 细胞的数目。可以将平板和CellTiter-Glo底物平衡到室温持续30分钟。可以将100y1 CellTiter-Gl0添加至每个孔。可以将平板在轨道摇床上振摇2分钟以混合内容物并继续 在室温温育10分钟以稳定发光信号。发光可以由1 &11&(：￥1(^(^3了11 142011111^1&1316计数 器（PerkinElmerPrecisely)记录。可以通过与无抗体处理的BaF3细胞比较，计算VEGFRl 抗体处理组和对照IgG抗体处理组中的细胞变异性百分数。每种剂量的三次重复处理的平 均数可以用作均数并用于标准误差计算。t-检验可以用来比较相同剂量时VEGFRl抗体和 对照抗体之间的数据。可以将小于0. 05的P值视为统计显著。
[0079] 在基本上如实施例3中所述那样进行的实验中，温育不同剂量的抗体II时，该抗 体抑制BaF3-小鼠VEGFRl-小鼠EpoR细胞增殖，如与人IgG4对照抗体相比，由生存力显 著减少显示（表3)。类似地，与不同剂量的抗体IV温育6日后，与小鼠IgGl对照抗体相 比，BaF3-小鼠VEGFRl-小鼠EPOR细胞显示更多的细胞死亡（表3)。这些结果显示细胞表 面VEGFRl受体均由抗体II和IV内化。另外，结果表明抗体II和IV与BaF3细胞上嵌合 VEGFRl的结合不刺激受体激活及细胞增殖。
[0080] 表3:抗体II和IV在表达嵌合小鼠和人VEGFRl/EpoR的BaF3细胞中减少细胞生 存力
[0081]
[0082] 数据显示三次重复处理的平均数和标准误差并且是两个实验的代表。
[0083]实施例4 :通过固相ELISA和基于细胞的VEGFRl磷酸化测定法测量的抗体II对 与人VEGFRl结合的人VEGF-A和PlGF的中和作用
[0084] 可以通过固相ELISA并通过基于细胞的VEGFRl磷酸化测定法，测量VEGFRl抗体 与VEGFRl结合并中和VEGF-A及PlGF对VEGFRl的结合作用的能力。VEGF-A和PlGF中和 作用可以在本分析中用来显示所公开的针对小鼠VEGFRl的抗体在体外类似于所公开的针 对人VEGFRl的抗体发挥作用。
[0085]对于固相ELISA，96 孔板可以用PBS中的Iyg/mLhVEGFRl-Fc(R&D321-fl050/ cf)以50y1/孔包被，并且随后在4°C温育过夜。随后可以从孔移除溶液，并且随后所述孔 可以用100y1 1%酪蛋白在室温封闭1小时。抗体（包括对照Ron抗体（R&DMAB691)) 可以在微量滴定板中相对于PBSt(含有Tween20的PBS)滴定，以50yg/mL开始并且以 1:3稀释稀释至0. 023yg/mL(参见表4a)。ELISA平板可以用PBSt洗涤3次，并且随后可 以添加50y1/孔预先滴定的抗体。在37°C温育1小时后，可以将50y1生物素酰化的配 体（2nMhPLGFl(P印roTech#AF-100 06)或 2nMhVEGFA-165(R&D#293-VE)添加至每个孔， 并且继续在37°C温育30分钟。平板可以用PBSt洗涤3次，并且随后可以添加50y1/孔 NA-AP(1:1000稀释），在室温温育15分钟。在洗涤另外三次后，可以添加100y1/孔PMP(水 中1:35稀释）。平板随后可以显色30分钟并且在OD56。读取。
[0086] 对于基于细胞的VEGFRl磷酸化测定法，表达人VEGFRl的PAE-Rl细胞可以按 100, 000个细胞/孔接种至24孔组织培养板中并在37°C伴随5% 0)2培养过夜。随后可 以将培养基更换成500y1饥饿培养基（含有0. 1 %BSA的DMEM/F12)并且培养过夜。随 后可以将抗体加入培养基并将细胞培养30分钟。随后可以添加人VEGF-A165 (R&D目录号 293-VE)或人P1GF(R&D目录号264-PG)并将细胞温育另外10分钟。可以使用ELISA(R&D DuoSetICELISA显色试剂盒，#DYC4170-2)，确定磷酸化人VEGFRl。
[0087]数据可以表示为均数+/_标准误差。JMP8可以用于ANOVA分析，接着进行Dunnett's比较。可以使用iGraphPadPrism第4版计算IC5。。可以将小于0? 05的P值 视为统计显著。
[0088] 在基本上在实施例4中如上文所述进行的实验中，抗体II中和人VEGF-A和PlGF 与VEGFRl的结合作用，并且还阻抑人VEGF-A和PlGF刺激的VEGFRl磷酸化。抗体II分别 以0. 43nM和0. 14nM的IC5。中和PlGF和VEGF-A与VEGFRl的结合作用（表4a)。
[0089] 需要在低抗体浓度时的数据点以精确计算IC5。。因此，实验在始于5yg/mL处并 按1:3稀释度稀释至0. 0023yg/mL的抗体浓度重复。实验流程可以如下文描述。
[0090]对于固相ELISA，96 孔板可以用PBS中的Iyg/mLhVEGFRl-Fc(R&D321-fl050/ cf)以50y1/孔包被，并且随后在4°C温育过夜。随后可以从孔移除溶液，并且随后所述孔 可以用IOOy1 1%酪蛋白在室温封闭1小时。抗体（包括对照Ron抗体（R&DMAB691))可 以在微量滴定板中相对于PBSt(含有Tween20的PBS)滴定，以5yg/mL开始并且以1:3稀 释稀释至0. 0023yg/mL(参见表4b)。ELISA平板可以用PBSt洗涤3次，并且随后可以添 加50y1/孔预先滴定的抗体。在37°C温育1小时后，可以将50y1生物素酰化的配体（4nM hPLGFl(R&DCat#264-PG-010)或 2nMhVEGFA-165(R&D#293-VE)添加至每个孔，并且继续在 37°C温育30分钟。平板可以用PBSt洗涤3次，并且随后可以添加50y1/孔NA-AP(1:1000 稀释），在室温温育15分钟。在洗涤另外三次后，可以添加IOOyl/孔PMP(水中1:35稀 释）。平板随后可以显色30分钟并且在OD56。读取。
[0091] 数据可以表述为均数+/-标准误差。JMP8可以用于ANOVA分析，接着进行 Dunnett's比较。可以使用GraphPadPrism第6版计算IC5。。可以将小于0? 05的P值视 为统计显著。
[0092] 在基本上如上文所述进行的重复实验中，抗体II中和人VEGF-A和PlGF与VEGFRl 的结合作用，并且还阻抑人VEGF-A和PlGF刺激的VEGFRl磷酸化。抗体II分别以0. 31nM 和I. 02nM的IC5。中和PlGF和VEGF-A与VEGFRl的结合作用（表4b)。
[0093] 抗体II在体外阻断VEGF刺