加。其它增殖分化相关蛋白如MAP激酶相互作用丝/苏氨酸 激酉每1 (MAP Kinase-interactingserine/threonine-protein Kinase 1,MKNK1)MKNKUMAP 激酶相互作用丝 / 苏氨酸激酶1 (MAP Kinase-interacting serine/threonine-protein Kinase 2、MKNK2)、蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB, also known as Akt)及自蛋白自 体吞卩策相关蛋白5(Autophagy Protein 5，ATG5)表达暂无明显统计学差异。
[0128] 图17WesternBlot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其皮层脑区 内的定量结果显示STCH+/-小鼠的翻译调控因子PS6K1表达与对照相比明显下调、凋亡 相关蛋白MT0R表达显著增加且二者均与年龄呈正相关；转录、分化调控因子MAPKAP1在 STCH+/-小鼠内3的发病早期表达明显升高。其他蛋白MKNK1、MKNK2、AKT的表达暂无明显 统计学差异。
[0129] 图18WesternBlot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其半脑脑 区内的磷酸化蛋白的定量结果显示信号转导和转录激活子3(Signaltransducerand activatoroftranscription3,alsoknownasSTAT3)、细胞外调节蛋白激酶 (extracellularregulatedproteinkinase，ERK)表达与对照相比明显上调，其中STAT3 表达变化发生在发病初期而ERK表达变化发生在病症最严重时期。转录调控因子S6K1在 发病初期表达急剧升高而蛋白磷酸化酶PP2A在相对晚期表达明显上调。Tuberin蛋白表达 暂无明显统计学差异。
[0130] 图19WesternBlot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其皮层脑区内 的磷酸化蛋白定量结果显示定量翻译调控因子S6K1、Tuberin表达明显下调，而信号转导 因子ERK在发病早期及病症最严重时期均高度表达。其他蛋白STAT3、PP2a暂无明显统计 学差异。
[0131] 图20WesternBlot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其半脑脑区 淀粉样蛋白前体APP、载脂蛋白AP0E、及早老素Psenl表达均上调，其中APP和Psenl在 STCH+/-小鼠晚期表达明显上调，其他蛋白表达量暂无明显统计学差异。
[0132] 图21WesternBlot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其皮层脑区淀 粉样蛋白前体APP及早老素Psen2在发病晚期表达均上调，其中Psen2在STCH+/-小鼠早 期表达亦明显上调，其他蛋白表达量暂无明显统计学差异。
[0133] 图22WesternBlot及定量结果显示STCH+/-与STCH+/+小鼠相比其大脑皮层 GAD、BDNF、Crebl蛋白的表达显著下调。THP2、FKBP5蛋白的表达出现下降但并未出现统计 学差异。
[0134] 敲除STCH基因后整个脑区、皮层的蛋白翻译因子表达下调，机体许多与该信号通 路相关蛋白表达关闭且蛋白凋亡通路激活，体内蛋白水平的变化使得小鼠出现上述诸如体 重减轻、情绪抑郁、协调能力及记忆能力下降等外在表型。此外，敲除该基因使得痴呆相关 蛋白大量表达，这些蛋白过度表达到一定程度可引起痴呆，在未达到此种程度之前必然引 起记忆能力的下降。这与我们前面的行为学检测结果相吻合，STCH+/-小鼠的记忆、学习能 力明显差于STCH+/+小鼠。不同年龄阶段小鼠的皮层内BDNF表达存在差异，在发病晚期， 该差异极为明显。该蛋白在STCH+/-小鼠内的低表达与情绪抑郁相关。该结果亦可从行为 学上得到证实，STCH+/-小鼠的抑郁程度明显比STCH+/+小鼠剧烈。
[0135] 实施例6
[0136] STCH+/-与STCH+/+小鼠的组织形态学差异鉴定及神经递质检测
[0137] 由递质检测结果图23分析可得出总体上各种检测的递质含量在STCH+/-小鼠普 遍低于STCH+/+小鼠。在两月、六月鼠龄时期的STCH+/-小鼠体内其DA的含量与STCH+/+ 小鼠相比含量明显减少。而DA的甲基化代谢产物3-MT递质在STCH+/-小鼠内的含量在六 月、十二月鼠龄时才出现显著减少。递质5-HT的含量在二月、六月鼠龄的STCH+/-小鼠体 内含量也明显比STCH+/+小鼠低。
[0138] 通过实验对比发现，在多巴胺神经元胞体聚集区并在大脑中发挥重要作用的黑质 部位，STCH+/-小鼠的星型胶质细胞高度活化。这可能是由于在生物体内发挥重要作用的 STCH基因的敲除引起生物自身的抵抗该恶劣环境的一种自我保护机制。然而小胶质细胞 程度CDllb没有明显活化。而且随着鼠龄的增长，在小鼠达到八个月、十二月时并没有发现 STCH+/-及STCH+/+在星型胶质细胞、小角质细胞相关染色上的明显差别。这一结果可能提 不在小鼠生命晚期，STCH+/-与STCH+/+小鼠间的差异逐渐变小。
[0139] 神经递质的结果显示，敲除STCH基因后多巴胺神经元及其甲基化代谢产物3-甲 基化色胺盐酸盐含量明显降低。这些重要神经元的减少从递质水平上说明了STCH+/-小鼠 外在行为能力降低的原因。而与情绪有关的神经递质5-HT在STCH+/-小鼠内含量明显下 降，这在递质水平再次证明了STCH+/-小鼠表现出的情绪方面的抑郁。
[0140] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种STCH基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，STCH条件性基因剔除小鼠是 通过基因打靶的策略，在STCH基因外显子2两端插入方向相同的LoxP位点，当该小鼠在导 入Cre重组酶的情况下，Cre重组酶通过识别LoxP位点，切除LoxP位点间的序列，达到在 特定细胞中条件性剔除STCH基因的目的。2. 根据权利要求1所述的STCH基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，具体包括 以下步骤： 1) 在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养来源于129SV/J品系雄性小鼠的CJ7胚胎干细 胞，收集通过针对于STCH基因外显子2的打靶载体产生突变的STCH基因敲除的胚胎干细 胞， 2) 制备小鼠供体囊胚， 3) 将STCH基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚， 4) 将含有STCH敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫， 5) 该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠， 6) 获得进入种系的嵌合体小鼠， 7) 得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。3. 根据权利要求1所述的STCH基因敲除动物模型的构建方法，其特征在于，所述的动 物为STCH基因杂合敲除小鼠。 4. STCH基因敲除动物模型的应用，其特征在于，其作为抑郁和/或痴呆发病研究的动 物模型。5. 根据权利要求4所述的STCH基因敲除动物模型的应用，其特征在于，包括以下内容 中的一种或几种： (1) 基因型鉴定：通过普通PCR技术对STCH基因敲除动物进行基因型鉴定，并在蛋白 水平采用Western blot进行验证； (2) 行为学实验筛查：分别对不同年龄段的STCH基因敲除动物与对比动物进行转棒行 为学、悬尾行为学、强迫游泳行为学、旷场行为学及水迷宫行为学检测； (3) 在mRNA水平采用RT-PCR技术对不同年龄段STCH基因敲除动物与对比动物的皮层 进行抑郁相关基因BDNF、TPH2、FKBP5、GADl、GAD2、HTR2a、Crebl的表达进行检测； (4) 在蛋白水平采用Western Blot技术对STCH基因敲除动物与对比动物进行自噬相 关抗体、记忆相关抗体和抑郁相关抗体的检测； (5) 通过免疫荧光检测GFAP、⑶11b、STCH、F4/80在STCH基因敲除动物与对比动物黑 质脑区的表达； (6) 采用HPLC-MS技术从递质水平检测STCH基因敲除动物与对比动物整个脑组织内多 巴胺及其代谢产物二羟苯乙酸的含量。 6. STCH基因敲除动物模型的应用，其特征在于，其用于抗抑郁和/或痴呆的药物筛选。7. 根据权利要求6所述的STCH基因敲除动物模型的应用，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 给STCH基因敲除动物模型施用待筛选的测试药物； (2) 观察STCH基因敲除动物模型中的抑郁和/或痴呆的相关症状和/或指标，并与对 照组进行比较； 其中，所述STCH基因敲除动物模型中抑郁和/或痴呆的相关症状有显著改善，则表示 该测试物是潜在的抗抑郁和/或痴呆的药物。 8. STCH基因的应用，其特征在于，其用于制备预防和/或治疗抑郁和/或痴呆的药物。9. 根据权利要求8所述的STCH基因的应用，其特征在于，所述的药物包括过表达STCH 基因的药物。
【专利摘要】本发明涉及STCH基因敲除动物模型的构建方法及应用。本发明的STCH基因敲除动物模型可作为抑郁和/或痴呆发病研究的动物模型，本发明采用基因敲除技术制备STCH基因敲除动物模型，通过动物行为学检测，该小鼠出现随着年龄增长抑郁样症状(强迫游泳、悬尾实验)和记忆功能障碍(水迷宫)，具有抑郁症和痴呆样症状，可用于抗抑郁和痴呆药物的筛选。
【IPC分类】A61P25/24, A01K67/027, A61K49/00, A61K45/00, C12N15/85, A61P25/28
【公开号】CN105112448
【申请号】CN201510519704
【发明人】徐国彤, 吕立夏
【申请人】同济大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月21日