OsFBH1转录因子在调控抽穗期方面的应用
【专利说明】OsFBHI转录因子在调控抽穗期方面的应用
[0001] 本研究得到国家自然科学基金项目（No. 31171515)及天津市中青年骨干教师 创新培养计划（No.ZX110GG017)的资助。
技术领域
[0002] 本发明设及水稻化功能研究技术领域，更确切地说是化转录因子在水 稻抽穗期方面。
【背景技术】
[0003] bHLH(Basic/helix-loop-helix)转录因子是植物中的转录因子大家族，bHLH转 录因子得名来源于其蛋白结构能形成bHLH结构域。该结构域一般含有60个氨基酸，按照 一定顺序排列后能够形成一个碱性氨基酸区(约15个氨基酸)和一个a-螺旋-环-a-螺 旋区（HLH区，约40个氨基酸）。其中碱性区域位于bHLH结构域的N端，其作用主要同 DNA结合区结合相关，例如，某些氨基酸能够对祀基因启动子区域的E-box巧'-CANNTG-3') 特异性识别并与之结合；HLH区同碱性区域相连，位于bHLH结构域的C端，不同长度的连 接环将两个a-螺旋连接起，形成了HLH区域。还有些转录因子之间能够形成同源或异源 性二聚体，进而调控基因的表达。
[0004] bHLH广泛存在于高等植物，调控很多生理代谢过程。在植物的生长发育、胁迫应 答、次生代谢及植物的开花调控中起重要作用。最近的研究发现，bHLH类型转录因子能够 同光敏色素基因互作从而调控植物开花。拟南芥中，bHLH转录因子能够调控a堪因的表 达，从而促进拟南芥的开花。为了进一步探究该转录因子家族在水稻抽穗开花中所起的作 用W及在光周期通路中的作用机制，本发明利用反向遗传学方法对水稻化巧?似的功能进 行了研究，结果表明化巧?似定位于细胞核中，是一个核蛋白，主要在叶片中大量表达，可W 调控水稻的抽穗期早晚。水稻抽穗开花期是水稻产量的重要构成要素之一，对水稻产量有 重要影响；同时水稻抽穗开花的早晚常伴随着水稻巧粒产量的变化，因此清晰的掲示水稻 成花的分子调控通路，利用分子设计辅助育种，对于提高水稻产量具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供OsFBHI转录因子的核巧酸序列在制备调控水稻抽穗期提 高水稻产量方面的应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过如下的方法予W实现： OsFBHI转录因子的核巧酸序列，其特征在于OsFBHI基因的核巧酸序列为SEQIDNo. 1 所示，OsFB化编码一个399个氨基酸的蛋白质序列为SEQIDNo2所示。
[0007] 本发明所述OsFB化转录因子核巧酸序列的mRNA序列为SEQIDNo. 3所示。
[000引本发明所述OsFBHI转录因子的核巧酸序列在制备调控水稻抽穗期方面，特别是 在提高水稻产量方面有明显的提高。试验研究表明：过表达化巧?似延迟了水稻的抽穗日 期，增加水稻的分葉，从而可W提高水稻产量。
[0009] 本发明所述Os化xlO的基因序列如下（SEQIDNo. 1所示）： OsFBHl基因序列：
【附图说明】： 图1转基因植株的获得及分子检测；其中：A:愈伤组织的继代培养；B:浸染后的愈 伤组织筛选培养；C:愈伤组织的分化培养；D:幼苗的生根培养；E:T。代过表达转基因植 株PCR检测，1-18分别代表T。代过表达转基因植株，WT:野生型，P:重组质粒，CK:d地2〇 ; 图2化转基因植的表型；其中：A:过表达转基因植株的realtime-PCR分析， 1-8分别过表达转基因植株WT为野生型；B:过表达转基因植株的表型分析，OsFB化-0V1 过表达植株体系，WT:为野生型； 图3化的表达模式；其中：图中A-0为转基因植株在不同组织和器官中GUS染色 结果，其中N、0为转基因植株叶片的横切面图；A:根巧：茎；C:茎顶端分生组织；D:愈伤组 织；E:叶片；F:叶銷；G-J不同时期的幼穗；K-L:花器官。标尺为50ym。P:化做做在不同 组织中的Realtime-PCR表达分析。YM:茎顶端分生组织；YR:幼根；YL:幼叶；MS:叶銷； S:茎；P1 :4cm长幼穗；P2 :13cm长幼穗；P3 :开花前幼穗； 图4化规做基因的亚细胞定位；其中：A-C:融合载体P化规做/.?做7在烟草表皮细胞 的瞬时表达，Merged为GFP、DPAI场融合；D-F:空载体在烟草表皮细胞的瞬时表达，Bri曲t field为明场，Merged为明场和GFP暗场的叠加；G-I:融合载体P化?做7在洋葱细胞 表皮细胞的瞬时表达，Bri曲tfield为明场，Merged为明场和GFP暗场的叠加J-L:为空 载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。
【具体实施方式】
[0010] 下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。W下各实施例 仅仅是用于说明而不是限制本发明。需要特别说明的是实施例中所用到的试剂均由市售， 化基因序列由RT-PCR扩增获得并克隆到空载体中。
[0011] 其中所用到的名词解释及来源：
实施例1 1. 意义 本发明利用反向遗传学方法对水稻化巧?似的功能进行了研究，结果表明化巧?似可W调控水稻的抽穗期早晚。对水稻产量有重要影响；同时水稻抽穗开花的早晚常伴随着水稻 巧粒产量的变化，因此清晰的掲示水稻成花的分子调控通路，利用分子设计辅助育种，对于 提高水稻产量具有广阔的应用前景。
[0012] 2材料与方法 2. 1植物材料 梗稻品种日本晴及其转基因植株用于本研究。材料种植海南陵水中国水稻所南繁基地 及天津市农科院试验田。
[001引 2. 2方法 2. 1. 1化过表达载体的构建 总RNA从40天的水稻叶片中用Trizol试剂（Invit;rogen，USA)提取，2yg总RNA用M-MLV反转录酶（TaKaRa，china)反转录合成cDNA。W反转录得到的cDNA为模板，用基因 特异性引物FBHF:5' -TTGGGATCCTGGGTTGAGGTGGGAGAATT-3^ 和阳皿:5'-CAGACTAGTTCCTGC CTAATCTCCAAAAC-3'，进行PCR扩增获得目的基因的完整0RF。将获得的目的片段纯化回收 后，用目的载体中相应的酶切位点连入空载体中获得最终过表达载体。PCR反应条件为1 min/ 95°C; 35cycles(30sec/ 94°C, 30sec/ 62°C, 2min/ 72°C) ; 5min/ 72°C。反应体系如下（总体积20yL): DM 10 - 30ng 10XBuffer(含 20mlMg2+) 2yL dNTP(2. 5mM) 0. 2mM PrimerF(FBHF) 0. 2yM PrimerR(FBHR) 0. 2yM ExTaq酶（TaKaRa) lU dd&O补至 20yL 2. 2. 3转基因植株的分子检测 基因组DM用CTAB法从水稻叶片中提取。然后用载体中潮霉素抗性基因对获得 的过表达转基因植株进行检测，所用引物为出PTF: 5 '-CTTCTGCGGGCGATTTGT-3'和 HPTR:5<-CAGCGTCTCCGACCTGAT-3，。PCR扩增程序为 2min/ 95°C; 30巧cles(30sec/ 94°C，30sec/ 57°C，30sec/ 72°C) ; 5min/ 72°C。
[0014] 2.2.4目的基因的表达分析 对于组织特异性表达，收集水稻根、茎、叶、叶片、叶銷、茎和不同发育时期的穗组织，用Trizol试剂（Invitrogen，USA)提取运些组织的总RNA，反转录后用RT-PCR方法分析目的 基因在运些器官中的表达。对于转基因植株表达检测，总RNA从50天大小的植株用上述相 同方法获得，反转录后用RT-PCR方法分析目的基因的表达。
[0015]所用引物为 0BF:5 < -ATCAGCGAGCGAATCAGGAAGC-3 ' 和RHLH1R:5 <-cacTGCTCCATTGCCCTTTGCT-3,。
[0016]扩增条件为2 min / 95°C ;35巧cles (30 sec / 94°C , 30 sec / 60°C , 30 sec / 72°C ) ; 5 min / 72°C。实时定量PCR应用SYBR方法按照SYBR Green PCR预混液 (Tiangen，北京）试剂盒说明操作，并用2-AAEt方法进行相对定量分析，重复3次。w水 稻化打7为内参进行相对定量分析。引物为ActinF: 5 '-GACTCTGGTGATGGTGTC