stdown进行PCR检测。通过PCR 产物测序鉴定正确的菌株即为敲除tnaA基因的大肠杆菌工程菌株JM109 〇)E3)AtnaA。
[0088] 实施例2大肠杆菌JM109 〇)E3)AtnaAk半脫氨酸脱琉基酶基因malY的敲除
[0089] 1、材料
[0090] 菌种；大肠杆菌工程菌株JM109 〇)E3)AtnaA,其相关特性见实施例1。
[0091] 质粒；质粒地D4、P邸46、PCP20均购自武汉竊灵生物科技有限公司。
[009引LB培养基運白腺lOg/L，酵母粉5g/L，化C1lOg/L。
[0093] 卡郝霉素抗性平板；含有20mg/L卡郝霉素、1. 5 %琼脂粉的LB固体培养基。
[0094]S0C培养基；蛋白腺 2g/l，酵母粉 0. 5g/l，化C1 0. 0585g/L，KCl0. 0186g/L，MgCl2 0. 203g，M拆〇40. 246g/l，葡萄糖 20mmol/L。
[0095] 2、方法
[0096] (l)malY基因同源重组片段的克隆
[0097] 利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的大肠杆菌malY基 因（Genbank登录号为；M60722. 1)的序列设计引物：
[0098]mal化P:
[0099] 5^-ATGTTCGATTTTTCAAAGGTCGTGGATCGTCATGGCACATGGTGTACACAGTGGGAAAGTGTAGGC TGGAGCTGCTTC-3>，
[0100] malYdown： 5'-TCCAGCCACACCTTTTTCCAGTTTCGAACGTGGGCAGCCGGCATTGAGACGGATGGGAATTAGCCA TGGTCC-3'。
[0102] WP邸4质粒为模板，用引物mal化P、malYdown通过PCR(聚合酶链式反应）体外 扩增获得带有卡郝霉素抗性基因的malY基因同源重组片段。
[010引 PCR反应体系如下；10X缓冲液 5yL，25mmol/LMgClz4yL，10mmol/L四种dNTP 混合液1yL上下游引物（引物浓度为20ymol/L)各2yLhqDNA聚合酶1yL;模板DM1y以加水补至50yL。
[0104]PCR反应条件为；97°C预变性 5min;94°C变性 45s，58°C退火 45s，72°C延伸 90s，30 个循环后72°C延伸10min，4°C保存。
[0105] 回收纯化浓缩PCR产物即得到malY基因同源重组片段。
[0106] (2)电转化感受态细胞的制备
[0107] 1)通过化C12法将地D46质粒转化入大肠杆菌JM109 〇)E3)AtnaA菌株中，获得阳 性转化子。
[0108] 2)挑取带有地D46质粒的大肠杆菌JM109〇)E3)AtnaA，转入LB培养基中，同时加 入0. 2%的阿拉伯糖，培养00抑。至0. 5。
[0109] 3)冰浴15min，离必收集菌体，然后用10%的甘油洗涂H次。
[0110] 4)加入10%的甘油，分装感受态细胞。
[01川 做电转化，筛选重组子
[0112] 1)往lOOuL带有地D46质粒的JM109〇)E3)AtnaA感受态细胞中加入8ngmalY 基因同源重组片段，混匀后转到电击杯中。通过电穿孔仪电击，电压2. 5Kv。
[011引 2)往电击液中加入900illS0C培养基，37°C、150转/min培养比。
[0114] 3)涂布卡郝霉素抗性平板，挑取重组子。进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步 证实malY基因已被卡郝霉素抗性基因替换。所用PCR引物如下：
[011引 mal化es化P: 5' -TCGGGCAATTGGCGTAGTAC-3'，
[0116]malYtestdown: 5' -GCAATTGGGTTAACGAACAG-3'。
[0117] 4)PLP位点专一重组
[0118] 将PCP20转入malY基因被卡郝霉素抗性基因替换的克隆中，3(TC培养化，后提 高至42C过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环廳取菌液在无抗性 培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和卡郝霉素抗性平板上培养，在无抗 性平板上生长而在卡郝霉素抗性平板上不生长的单克隆即为卡郝霉素抗性基因已被FLP 重组酶删除的目的菌株。利用检测引物malYtestup和malYtestdown进行PCR检测。通 过PCR产物测序鉴定正确的菌株即为敲除malY基因的大肠杆菌工程菌株JM109 〇)E3) AtnaAAmalY。
[0119] 实施例3转化化-ATC合成k半脫氨酸的代谢途径的构建
[0120] 1、材料
[0121] 菌种；大肠杆菌工程菌株JM109〇)E3)AtnaAAmalY，其相关特性见实施例2。
[0122] 质粒；质粒祀T-28a(+)购自Novagen公司，质粒pACYC184购自化WElngland Biol油S公司。
[012引LB培养基運白腺lOg/L，酵母粉5g/L，化C1lOg/L。
[0124] 化-ATC消旋酶基因atcA、kATC水解酶基因atcB、氮一氨甲醜-k半脫氨酸水解 酶基因atcC均源于假单胞菌Pseudomonassp.BS株。
[0125] 卡郝霉素+四环素双抗平板；含有1. 5%琼脂、20mg/L卡郝霉素、lOmg/L四环素的 LB固体培养基。
[0126] 2、方法
[0127] (l)atcAB表达载体的构建
[0128] 将来源于假单胞菌Pseudomonassp.BS株基因组的DkATC消旋酶基因（atcA) (GenBank登录号为；BAD15357)与L-ATC水解酶基因（atcB)(其序列信息存在于一段 GenBank登录号为AB176845的一段大小为10肺的DNA序列内）进行密码子优化，在优 化后的两基因序列中间添加一段编码刚性连接肤的序列，形成atcA/atcB的融合表达 框，该融合表达框的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示；该融合表达框编码的蛋白质命名 为AtcAB，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。在该融合表达框的5'端及3'端分别引入 酶切位点Ndel及EcoRI后化学合成如SEQIDNO. 3所示的全基因序列，将此序列命名为 opt-atcAB。opt-atcAB的合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基 因片段opt-atcAB连于载体PUC57上。将含有opt-atcAB片段的载体PUC57用Ndel及 EcoRI进行双酶切后回收目的片段，备用。同时采用Ndel及EcoRI对载体祀T-28a(+)进 行双酶切，并将经双酶切后获得的opt-atcAB基因连入祀T-28a(+)载体中，转化大肠杆菌 T0P10,构建祀T-atcAB表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误，提取质粒备 用。祀T-atcAB载体可表达重组化-ATC消旋酶/1-ATC水解酶融合蛋白（AtcAB)。
[0129] (2)atcC表达载体的构建
[0130] 将来源于假单胞菌Pseudomonassp.BS株基因组中的氮一氨甲醜-心半脫氨酸 水解酶基因（atcC)(其序列信息存在于一段GenBank登录号为AB176845的一段大小为 10肺的DNA序列内）进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQIDNO. 5所示；该段基因 序列编码的蛋白质命名为AtcC,其氨基酸序列如SEQIDN0.4所示。在优化后的基因的5' 端加入Tac启动子及SD序列后形成基因表达盒，再在该表达盒的5'端及3'端分别引入 酶切位点EcoRI及化〇1后化学合成如SEQIDNO.6所示的全基因序列，将此序列命名为 opt-atcC。opt-atcC的合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片 段opt-atcC连于载体PUC57上。将含有opt-atcC片段的载体PUC57用EcoRI及化〇1进行 双酶切后回收目的片段，备用。同时采用EcoRI及化〇1对复制子为pl5A的载体PACYC184 进行双酶切，并将经双酶切后获得的opt-atcC基因连入PACYC184载体中，转化大肠杆菌 T0P10,构建pAC-atcC表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误，提取质粒备 用。pAC-atcC载体可表达重组氮一氨甲醜半脫氨酸水解酶（AtcC)。
[013U(3)JM1090)E3)AtnaAAmalY感受态细胞的制备
[0132] 1)挑取LB平板上的工程菌株JM109〇)E3)AtnaAAmalY，培养过夜。
[0133] 2)将培养过夜的工程菌株JM109〇)E3)AtnaAAmalY按照1% (V/V)的接种量转 入装有50血LB的300血的H角瓶中培养，ODe。。至0. 4左右时停止培养，置冰上20min，4°C、 4000g离必lOmin。弃上清，加入冰冷的lOOmM的化CI2溶液悬浮，冰上静置30min。离必浓 缩，获得感受态细胞，放于-7(TC保存。
[0134] (4)pET-atcAB+pAC-atcC表达载体的共转化
[0135] 1)将50ng的表达载体祀T-atcAB与60ng的表达载体pAC-atcC共转入100yL 步骤做所制备的JM109触扣AtnaAAmalY感受态细胞中，混匀，置冰上30min，42°C热激 90s，冰上静置2min。
[0136] 2)加入900uL的LB培养基，37°C、100转/min培养比。
[0137] 3)涂布卡郝霉素+四环素双抗平板，培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒，经酶 切验证，获得基因工程菌株JM109 〇)E3)AtnaAAmalY+atcAB+atcC。
[0138]实施