对照更大的T细胞活力。但是，没有一个构建体导致比实例1中描述的Tat-Myc 更大的T细胞活力。
[0143] 在类似的实验中，下表5中显示了不同浓度的Tat-Myc和Tat-Bcl-2的活性。用 lμg/ml的抗CD3(2cll)活化来自C57BL.6j(Jackson)小鼠的脾脏的T细胞。活化后（48 小时后），将细胞洗涤，以约1至I. 5 X IO6个细胞/孔的密度接种，并添加不同浓度（0. 5、 1、5、10、25或5(^8/!111)的融合蛋白〇'&卜1^(3或了&卜8(31-2)。48小时后，通过流式细胞术 (前向加侧向散射）测定活细胞的百分比，如下表5中所示。
[0144] 对于Tat-Myc和Tat-Bcl-2两者，并且在所有的测试浓度下，与在任一融合蛋白不 存在下温育的细胞相比，细胞活力和/或增殖提高。
[0145] 在使用相同方法的另一实验中，图10提供了用50 μ g/ml的融合蛋白处理的活化T 细胞的活门（live gate)的FACS数据；Tat-Bcl-2和Tat-Myc与对照（Tat-Cre或无处理） 比较。如图所示，Tat-Myc处理和Tat-Bcl-2处理均导致显著改进的T细胞存活和/或增 殖。 实例11 :用于⑶34+扩增的细朐_子混合物的评估
[0146] 测试了多种在基础培养基中的细胞因子混合物支持干细胞存活和/或增殖的能 力。
[0147] 在第0天，将脐带血覆盖在聚蔗糖（Ficoll)梯度上以富集单核细胞和去除红细 胞。然后将细胞洗涤并在单独的StemSpan培养基或具有各种细胞因子组合的StemSpan培 养基中温育，如下表6中所示。
[0148] 为产生细胞因子，将293FT细胞在DlO培养基（DMEM、10 % FBSUOO单位/毫升 的 Penn/Str印、MEM NEAA(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺（Gibco))中以 12X106个细胞 / 板 的密度接种在150mm平板中。使用磷酸钙，将细胞用30 μ g总DNA/板进行转染，该30 μ g 总 DNA 由 pcDNA3. 1-SCF、10 μ g pcDNA3. 1-IL3 和 10 μ g pcDNA3. 1-IL6 组成或者由 10 μ g pcDNA3. 1-TPO、10 μ g pcDNA3. 1-Flt3-L 和 10 μ g pcDNA3. I-GM-CSF 组成。第二天，移除培 养基并用100ml DlO培养基更换。将细胞在37°C /5% CO2下温育4至5天。收集培养基， 过滤灭菌，以30ml等分试样在-20 °C下冷冻。通过每500ml瓶子的培养基加入30ml的含有 三种细胞因子IL3、IL6、SCF的经调理的培养基和30ml的含有TP0、Flt3-L、GM-CSF的经调 理的培养基，将细胞因子添加到扩增培养基。
[0149] 在第4、7、10、13、16和19天，使用标准的技术获取样品，通过流式细胞术测定 ⑶34+细胞的百分比。在第0天后不补充细胞因子。如表6中所示，StemSpan培养基加上 11-3、11-6、TPO (促血小板生成素）、Flt3-L和GM-CSF的组合对细胞显示最佳的存活和增 殖（参见例如第13天）。
[0150] 测试了在具有或不具有Tat融合蛋白（TMTB)的基础培养基中的多种细胞因子混 合物支持干细胞存活和/或增殖的能力。
[0151] 在聚蔗糖密度梯度上制备脐带血以移除红细胞。将20, 000个有核细胞平板接 种到24孔平皿的各孔中。细胞接种在含有以下成分的StemSpan中：干细胞因子、IL3和 IL6(S36) ;S36 加上 5μg/ml Tat-Myc 和 5μg/ml Tat-Bcl2;TP0、干细胞因子、Flt3-L、 IL3 和 IL6 (TSF36) ;TSF36 加上 5 μ g/ml Tat-Myc 和 5 μ g/ml Tat-Bcl2 ;ΤΡ0、干细胞因子、 Flt3-L、IL3、IL6、GM-CSF(TSF36G);及TSF36G加上5μg/ml Tat-Myc和5μg/ml Tat-Bcl2。 每三天更换培养基和Tat融合蛋白。在第13天，通过流式细胞术评估细胞寻找CD34阳性 谱系阴性HSC。
[0152] 如图11中所示，TSF36G加上融合蛋白提供最高的活力和增殖。在其他实验中，细 胞因子加上融合蛋白的这一组合被证实在集落形成测定法中和在异种嵌合小鼠的体内重 构中产生比从不具有融合蛋白的细胞因子混合物产生的细胞明显更胜一筹的细胞（图12 至 14)。
[0153] 对于异种嵌合小鼠体内重构实验，在聚蔗糖梯度上制备脐带血细胞。移取血沉棕 黄层，将细胞在PBS中洗涤3次。将一半的脐带血细胞接种在由补加有以下成分的伊思考夫 培养基（Gibco)组成的FCB (胎儿脐带血）培养基中：10%人血浆、100单位/毫升的Penn/ Str印、30ml的含SCF、IL3和IL6的培养基及30ml的含TPO、FLT3-L和GM-CSF的培养基。 将另一半的细胞接种在包含上述添加物且进一步补加有5 μ g/ml的重组Tat-Myc和5 μ g/ ml的重组Tat-Bcl-2的FCB培养基中。
[0154] 将细胞扩增11天。在第13天，将细胞离心沉淀并重新悬浮在IOml的新鲜FCB 培养基中。将原先用Tat-Myc和Tat_Bcl2处理的细胞再次用5 μ g/ml的重组Tat-Myc和 5 μ g/ml的重组Tat-Bcl-2在37°C下处理1小时。将两个FCB细胞群体在PBS中洗涤3次 以便注射到小鼠体内。
[0155] 将扩增的细胞注射到在就要进行注射之前接受了 180拉德的辐照的N0D/SCID/ gc /小鼠（NSG)(杰克逊实验室）体内。扩增的细胞是在200 μ I PBS中经尾静脉注射到 NSG小鼠体内。移植后八周，通过流式细胞术评估骨髓（BM)、脾脏和胸腺的人HSC重构情况 (图12至14)。来自在输注之前已用Tat-Myc和Tat-Bcl2预处理的每种组织的细胞与没 有用该融合蛋白预处理的细胞相比显示出人CD45+细胞显著增加。 实例12 :Bcl-2的评估
[0156] 用Tat_Bcl2转导3T3细胞1小时，然后进行3次PBS洗涤。转导后两小时，将细 胞进行胰蛋白酶消化，计数，并收获5X106个细胞。分离细胞核级分和细胞质级分。接着 5天，每24小时收获5 X IO6个细胞。通过将细胞在IOmM HEPES (pH 7. 6)、10mM NaCl 2、3mM CaCljP 0. 5% NP40中裂解，制备细胞核蛋白和细胞质蛋白。使细胞核沉淀，并用三氯乙酸 (TCA)沉淀含细胞质的上清液级分。用抗V5抗体（英杰公司）和山羊抗小鼠 IgG-HRP (圣 克鲁斯生物技术公司）探测蛋白质印迹。
[0157] 在24和48小时，在细胞质级分中观察到Tat_Bcl2。到转导后72小时为止，信号 开始减弱，并且在96小时时间点不再观察到信号。
[0158] 产生 了表达 Tat-Bcl2、Tat-Bcl2A、EPTD-Bcl2、VPR-Bcl2、VPR-Bcl2A 和 VPR-BclXL 的质粒。pPTD-Bcl2-V5-6xHis(AmpR):通过使用编码框内 PTD(Tat、EPTDSVPR) 蛋白转导结构域的正向引物对编码人Bcl2的cDNA进行PCR扩增来产生质粒。将PCR产物 克隆到pET101/D-Topo (英杰公司）载体中。为产生Bcl2 Δ，使用Quick Change定点诱变 试剂盒（Stratagene#200521-5)从BCL-2编码序列去除未结构化的环（第27至80号氨基 酸）。VPR-BclXL按与以上描述的PTD-Bcl2相似的方式制备，但使用人BclXL的cDNA而不 是 Bcl2 的 cDNA。
[0159] 在本申请中，单数的使用可包括复数，除非另有明确说明，或者除非如本领域技术 人员根据本公开内容将会理解的，该单数是唯一的功能性实施例。因此，例如，"一个（种） 可意指超过一个（种），并且" 一个实施例"可意指该描述适用于多个实施例。 以引用方式并入
[0160] 本文引述的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等，以及其中引述的 参考文献，只要未曾被并入本文中，都以引用方式整体并入本文。倘若所并入的文献和类似 资料中的一者或多者与本申请不同或抵触，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述 的技术等，则以本申请为准。 等同物
[0161] 前文的描述和实例详细说明了某些实施例。但是，应认识到，无论前述内容在文本 上可能看起来有多详细，本发明都可以按多种方式来实施，并且本发明应按照所附的权利 要求及其任何等同物来解释。
【主权项】
1. 一种产生条件性无限增殖化成人干细胞群体的方法，所述方法包括： 向一种或多种成人干细胞提供： a) 外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽；和 b) 外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽；并且 其中所述Myc多肽以至少约72小时的时间间隔提供给所述一种或多种成人干细胞；并 且 其中所述Bcl-2结构域多肽以至少约96小时的时间间隔提供给所述一种或多种成人 干细胞，以产生条件性无限增殖化成人干细胞群体。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc多肽以至少约48小时的时间间隔提供。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc多肽以至少约24小时的时间间隔提供。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc多肽连续提供。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽以至少约72 小时的时间间隔提供。6. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽以至少约48 小时的时间间隔提供。7. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽以至少约24 小时的时间间隔提供。8. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽连续提供。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述Myc多肽是n-Myc、c-Myc、 I-Myc、v-Myc或s-Myc中的一者或多者。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述Myc多肽以约Iyg/ml至约 50yg/ml的浓度提供。11. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述Myc多肽以约5yg/ml的浓度 提供。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽以约Iyg/ ml至约50yg/ml的浓度提供。13. 根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽以约 10yg/ml的浓度提供。14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽包括BH1、 BH2、BH3 和BH4。15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述一种或多种Bcl-2结构域多 肽是Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bcl-XL、Mcl-I中的一者或多者。16. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述一种或多种Bcl-2结构域多 妝是Bcl_2。17. 根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述Myc多肽或所述Bcl-2多肽 中的一者或多者包含蛋白转导结构域。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是Tat。19. 根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是EPID。20. 根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是vpr。21. 根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种成人干细胞在包 含IL3、IL6和干细胞因子的培养基中培养。22. 根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种成人干细胞在包 含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素和Flt3-L的培养基中培养。23. 根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述一种或多种成人干细胞在包 含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素和Flt3-L及GM-CSF的培养基中培养。24. 根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种成人干细胞的扩 增情况为以下一种或多种情况：在约28天里扩增约270倍、在约14天里扩增约150倍、在 约21天里扩增100倍或者在约9至14天里扩增约85倍。25. 根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述一种或多种成人干细胞是一 种或多种造血成人干细胞。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述造血成人干细胞通过以下一方面或多方面 来表征：细胞表面表型、体外分化能力、辐照后在体内重构造血谱系的能力或以连续方式移 植的能力。27. 根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种造血成人干细胞 从以下一者或多者中分离：脐带血、胎盘、骨髓、外周血、动员外周血或脂肪组织。28. 根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种造血成人干细胞 源自胚胎干细胞或诱导多能干细胞。29. 根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述一种或多种成人干细胞是人 细胞。30. 根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述一种或多种成人干细胞是非 人动物细胞。31. -种Myc融合蛋白，所述Myc融合蛋白包含： 蛋白转导结构域； 能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽； V5结构域；和 六组氨酸表位标签。32. 根据权利要求31所述的Myc融合蛋白，其具有超过约60分钟的半寿期。33. 根据权利要求31所述的Myc融合蛋白，其具有约48小时的半寿期。34. 根据权利要求31所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白在长达约72小时里 是可检测的。35. 根据权利要求31所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白在长达约48小时里 是可检测的。36. 根据权利要求31至34中任一项所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白可运 输到细胞中的细胞核中。37. 根据权利要求31至35中任一项所述的Myc融合蛋白，其中所述蛋白转导结构域是 Tat〇38. 根据权利要求31至35中任一项所述的Myc融合蛋白，其中所述蛋白转导结构域是 Vpr039. 根据权利要求31至35中任一项所述的Myc融合蛋白，其中所述蛋白转导结构域是 EPTD040. 根据权利要求31至38中任一项所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白具有 如下的组分顺序： a) 所述蛋白转导结构域框内连接到所述Myc多肽， b) 所述Myc多肽框内连接到所述V5结构域，和 c) 所述V5结构域框内连接到所述六组氨酸表位标签。41. 根据权利要求31至38中任一项所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白具有 如下的组分顺序： a) 所述Myc多肽框内连接到所述蛋白转导结构域， b) 所述蛋白转导结构域框内连接到所述V5结构域，和 c) 所述V5结构域框内连接到所述六组氨酸表位标签。42. -种干细胞扩增培养基，所述干细胞扩增培养基包含IL3、IL6、干细胞因子、促血 小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。43. 根据权利要求42所述的干细胞扩增培养基，其进一步包含基础培养基。44. 根据权利要求43所述的干细胞扩增培养基，其进一步包含： 能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。45. 根据权利要求41至44中任一项所述的干细胞扩增培养基，其进一步包含： 能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽。46. 根据权利要求41至45中任一项所述的干细胞扩增培养基，其中所述基础培养基是 StemSpan、Isco培养基、RPMI或DMEM中的一者或多者。47. -种Myc融合蛋白，所述Myc融合蛋白包含： a) 蛋白转导结构域 b) 能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽，其中所述Myc融合蛋白的半寿 期超过约60分钟。48. -种核酸，所述核酸编码根据权利要求31至41和47中任一项所述的蛋白质。49. 一种载体，所述载体包含根据权利要求48所述的核酸。50. -种细胞，所述细胞包含根据权利要求49所述的载体。51. 根据权利要求1所述的方法，其中在8小时时间里提供不超过Iyg/ml的Myc多 肽。52. 根据权利要求1所述的方法，其中在16小时时间里提供不超过Iyg/ml的Myc多 肽。53. 根据权利要求1所述的方法，其中在24小时时间里提供不超过Iyg/ml的Myc多 肽。54. 根据权利要求1所述的方法，其中产生所述群体是在透气容器内进行。55. -种Myc融合蛋白，所述Myc融合蛋白包含： 蛋白转导结构域； 能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽；和 短肽结构域。56. 根据权利要求55所述的Myc融合蛋白，其中所述短肽结构域选自HA标签、FLAG标 签、CBP、CYD、Str印II或HPC中的至少一者。57. -种透气容器，所述透气容器含有： 包含如下物质的干细胞扩增培养基：IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF; 能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽；和 能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽。58. 根据权利要求57所述的透气容器，其中所述容器是袋或烧瓶。
【专利摘要】本发明公开了用于操纵和扩增包括成人干细胞在内的干细胞群体的方法、通过这种方法产生的细胞以及与其相关的各种蛋白质构建体。
【IPC分类】C12N5/00, C12N5/071
【公开号】CN105209604
【申请号】CN201480026147
【发明人】布赖恩·柯蒂斯·特纳, 优素褔·里菲利, G·A·伯德
【申请人】泰加生物工艺学公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年3月11日
【公告号】CA2905296A1, EP2970885A1, US9365825, US20140273212, WO2014164606A1